DB13/Txxx—2020PAGE1堆肥用木質纖維素降解菌篩選技術規程1范圍本標準規定了堆肥用木質纖維素降解菌菌株篩選的樣品采集、培養基配制、富集培養、菌株分離、初篩、復篩、菌株綜合鑒定，以及篩選菌株的保藏技術等。本標準適用于農林牧及加工業的有機廢棄物堆肥、農作物秸稈還田，及其它行業和生活垃圾的有機廢物中木質纖維素降解與資源化利用領域。本標準不適用于厭氧發酵和其他材料及形式的處理與利用。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489-2008實驗室生物安全通用要求GB7959-87糞便無害化衛生標準GB/T25246-2010畜禽糞便還田技術規范GB/T25169-2010畜禽糞便監測技術規范GB/T26622-2011畜禽糞便農田利用環境影響評價準則NY884-2012 生物有機肥GB4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》GB15618-2018土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準GB/T36195-2018畜禽糞便無害化處理技術規范HJ497畜禽養殖業污染治理工程技術規范NY/T1168畜禽糞便無害化處理技術規范NY/T3442-2019畜禽糞便堆肥技術規范NY/T3441-2019蔬菜廢棄物高溫堆肥無害化處理技術規程HJ1088-2020排污單位自行監測技術指南磷肥、鉀肥、復混肥料、有機肥料和微生物肥料NY/T525-2021有機肥料3縮略語下列縮略語適用于本文件。TSA：胰蛋白胨大豆瓊脂培養基；TSB：胰蛋白胨大豆液體培養基；GSM：高斯氏合成培養基；GGSM：改良高斯氏合成培養基；PDA：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基；PDB：馬鈴薯葡萄糖液態培養基；CMC-Na：羧甲基纖維素鈉；DNA：脫氧核糖核酸；rDNA：核糖體DNA；ITS：內轉錄間隔區；PCR：聚合酶鏈式反應；CMCase：羧甲基纖維素酶；FPA：濾紙酶；Lip：木質素過氧化物酶；Mnp：錳過氧化物酶；Lac：漆酶；PBS：磷酸緩沖液；ABTS：2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。4菌株篩選包括樣品采集、各種篩選培養基制備、木質纖維素降解菌的富集與分離、菌株初篩與復篩。4.1樣品采集從養殖場、有機肥廠、菌菇廠、垃圾填埋場、污水處理廠、林地和農田等采集發酵過程中的糞便、堆肥、菌菇發酵料、活性污泥以及林下腐殖土和耕層土壤等樣品，將樣品按類別、采樣點和采樣時間做好標記，當天帶回實驗室，在24h內進行富集或分離培養。4.2篩選培養基配制木質纖維素富集培養基：秸稈末（濾紙漿粉）5g，蛋白胨5g，NaCl5g，CaCO32g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，蒸餾水1000mL。TSA培養基：TSA粉30g，蒸餾水1000mL。TSB培養基：TSB粉30g，蒸餾水1000mL。GSM培養基：可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g，磷酸氫二鉀0.5g，氯化鈉0.5g，七水硫酸鎂0.5g，七水硫酸亞鐵0.01g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.2~7.4。GGSM培養基：KNO31g，KH2PO40.5g，NaCl0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，可溶性淀粉20g，酵母膏1g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，pH7.2-7.4。PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL。PDB培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。CMC剛果紅培養基：(NH4)2SO42.0g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO41.0g，NaCl0.5g，CMC-Na2.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH7.0。另配制1mg/mL剛果紅染液和1mol/LNaCl溶液。木質素苯胺藍培養基：(NH4)2SO42g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl0.5g/L，堿性木質素5g/L，瓊脂粉22g/L，H2O950mL；苯胺藍粉末0.25g溶于50mL無菌水中，用一次性醫用注射器吸取苯胺藍染液，再裝上無菌過濾器注入滅菌后的培養基中趁熱于超凈臺中混合均勻。木質素亮藍培養基：(NH4)2SO42g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl0.5g/L，堿性木質素5g/L，亮藍0.25g，瓊脂粉22g/L，H2O1L。亮藍的除菌方法同苯胺藍。發酵培養基：麩皮50g，蛋白胨3g，(NH4)2SO43g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.3g，NaCl5g，水1000mL。濾紙條崩解培養基：KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.4g，(NH4)2SO43g，酵母粉0.1g，H2O1000mL。秸稈降解培養基：玉米秸稈粉2%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.05%，pH值7.2~7.4。上述培養基于121℃高壓滅菌30min，冷卻至55~60℃傾注平板備用。4.3富集培養稱取各類樣品各20g，充分打散混勻；稱取2份10g混合樣品，分別放入2個滅菌的含100mL木質纖維素富集培養液的250mL錐形瓶中，兩瓶分別于35℃和45℃、160r/min搖瓶48h。4.4分離純化將富集培養液搖勻，各取1.0mL懸液置于含9mL無菌水的離心管，搖勻后得10﹣1稀釋液，依此倍比稀釋至10﹣5稀釋液；分別從兩個溫度富集培養液及其系列稀釋液（100~10﹣5）中取100μL菌懸液，均勻涂布于細菌、放線菌、真菌分離培養基平板，每個稀釋度重復2次，將富集培養液的稀釋平板分別置于35℃和45℃條件下恒溫培養1~7d。在培養期間每天觀察菌落生長情況，并從適當稀釋平板上挑取不同形態單菌落，在新的分離培養基平板上劃線分離純化培養；重復以上操作至得純菌株。4.5初篩將分離純化的菌株分別接種于CMC剛果紅培養基、木質素苯胺藍培養基、木質素亮藍培養基上。每個平板接種一株菌，均勻分散點接三個點，兩個平行，35℃培養3d。在明亮背景下觀察、測量不同培養基上各菌落及其周圍透明圈的直徑大小，并計算同一菌株菌落直徑（d）、透明圈直徑（D）的平均值以及D/d的比值。剛果紅培養基上的透明圈需染色才能看到：將配制的剛果紅染液倒入平板中染色10~15min，倒去染液，加入NaCl溶液顯色15min即可。按菌株在初篩培養基上的菌落直徑、透明圈直徑、D/d值、透明圈清晰度對每個菌株進行積分，將同類菌株的積分進行比較，選擇積分較高的菌株進入復篩。4.6復篩4.6.1酶活測定將初篩入選菌株分別進行CMCase、FPA、Lip、Mnp和Lac酶活性測定。CMCase測定：采用3,5-二硝基水楊酸法測定內切-β-1,4-葡聚糖酶催化羧甲基纖維素鈉降解產生的還原糖的含量。Cx(μg/(min·mL))=1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V總÷V樣÷T=14.305×(ΔA+0.0673)。FPA測定：濾紙酶水解濾紙產生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內反應液顏色深淺與還原糖的量成正比，可測定計算濾紙酶的活力。FPA(U/ml)=(ΔA+0.0255)÷0.2805×V總÷V樣÷T=0.416×(ΔA+0.0255)。上述公式中，V總：反應體系總體積(mL)；V樣：加入反應體系中樣本體積(mL)；T：反應時間(min)；ΔA：測定組與對照組的吸光值差。Lip測定：采用木質素過氧化物酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）檢測。木質素過氧化物酶氧化藜蘆醇生成藜蘆醛在310nm處有特殊吸收峰。將菌株發酵培養液超聲波冰浴破碎菌體，然后10000g離心10min，取上清液100μL裝入2mL離心管中，放置于冰上待測。反應體系含有1mM藜蘆醇，50mMpH7.2的磷酸緩沖液（PBS）和0.1mM過氧化氫，總體積1mL。超純水作為對照，分別測定310nm處反應10S和310S的吸光值，分別記為A1和A2，ΔA=A2-A1。酶活性定義為每升培養液60S內氧化1nmol藜蘆醇所需酶量為一個酶活力單位，藜蘆醛摩爾消光系數ε=9300L·mol-1·cm-1。計算公式如下：Lip(nmol·min-1·L-1)=ΔA÷(ε×d)×V總÷V樣÷TMnp測定：錳過氧化物酶也是一種含有亞鐵血紅素的氧化酶，在Mn2+存在的條件下將愈創木酚氧化為四鄰甲氧基連酚，在465nm處有特征吸收峰。使用木質素錳過氧化物酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行測定。將發酵培養液10000g離心10min，取上清液作為粗酶液放置于冰上待測。反應樣品100μL，底物反應體系900μL，充分混勻反應體系與樣品，在37℃反應10min，于1mL玻璃比色皿中，蒸餾水調零，測定465nm處吸光值，計算與對照組差值ΔA。酶活性定義：每升培養液每分鐘氧化1nmol愈創木酚所需的酶量為一個酶活力單位。愈創木酚消光系數ε=12100L·mol-1·cm-1，計算公式如下：Mnp(nmol·min-1·L-1)=ΔA÷(ε×d)×V總÷V樣÷TLac測定：漆酶是含銅的多酚氧化酶，具有較強的氧化能力。使用漆酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測定。漆酶分解ABTS產生ABTS自由基，在420nm處吸光系數遠大于ABTS，測定ABTS自由基增長率得到漆酶活性。離心后粗酶液0.1mL，加入反應體系液0.6mL，對照組樣品煮沸后加入。樣品加入后在60℃水浴3min，測定其420nm處吸光值，計算與對照組的差值ΔA。ABTS消光系數ε=36L·mmol-1·cm-1。定義每毫升每分鐘氧化1nmol底物ABTS時所需的酶量為一個酶活單位。計算公式如下：Lac(U·L-1)=ΔA÷(ε×d)×V總÷V樣÷T上述公式中d：比色杯光徑；V總：反應總體積；V樣：反應中樣品體積；T：反應時間。4.6.2秸稈降解率測定將玉米秸稈粉碎后于105℃烘干至恒重，配制秸稈降解培養基備用。將初篩入選菌株接種于相應種子培養基（TSB、GGSM、PDB），在35℃、150r/min搖瓶培養24~72h；取菌懸液按2%接種率接種到裝有150mL秸稈降解培養基的250mL錐形瓶中，35℃搖床培養5d。培養結束后，在錐形瓶中加入裝液量20%的中性洗滌劑（3%十二烷基硫酸鈉），煮沸10min以便除去可溶性物質。將培養液用質量恒定（m0）濾紙進行過濾，經蒸餾水沖洗過濾后，將濾紙和濾渣置于105℃烘箱中干燥至恒重（m2）。質量恒定后的m2?m0即為降解剩余物質量m1。玉米秸稈木質纖維素降解率Y計算公式為：Y=(m-m1)/m×100%公式中m：培養基中初始玉米秸稈的質量（g）。將復篩菌株的CMCase、FPA、Lip、Mnp和Lac酶活性值和秸稈降解率進行積分，比較同類菌株間復篩積分高低，并結合初篩結果對復篩菌株進行取舍。5菌株的綜合鑒定包括形態學和分子生物學鑒定。參照GB19489-2008實驗室生物安全通用要求的相關條款。5.1菌株形態特征將復篩入選菌株以平板劃線的方法接種于相應的培養基，于恒溫培養箱中倒置培養，24～72h后觀察各菌株在平板上的菌落形態特征；挑取菌體進行涂片染色，細菌用革蘭氏染色法，放線菌用結晶紫染色，真菌用苯胺藍染色，鏡檢觀察菌體顯微形態特征，結合菌株的典型菌落形態和菌體形態特征進行初步鑒別。5.2菌株的分子生物學鑒定5.2.1基因組DNA提取細菌、放線菌DNA的提取：將1mL的TSB液體培養基放入2mL的EP管中，用接種環挑取純化完成的單個菌落放入其中，35℃，160r/min培養過夜。將培養好的菌液12000r/min離心5min，棄上清；加入1mL無菌水，震蕩混勻，12000r/min離心3min后棄上清，重復2次。加入30-50μL的無菌水，震蕩混勻，98℃水浴，細菌水浴15min，放線菌水浴35min。水浴完成后，12000r/min離心2min，上清液即為提取的細菌DNA，取上清移入新的EP管中，-20℃保存備用。真菌DNA的提取：真菌的DNA提取采用北京索萊寶生物科技有限公司的真菌試劑盒，按說明書指導方法進行提取。5.2.2引物合成細菌和放線菌采用16SrDNA通用引物，真菌采用真核生物rDNA的ITS序列通用引物，引物由華大基因公司合成，引物序列如下表：表1引物序列菌株上下游引物細菌上游引物：5’-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3’下游引物：5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’真菌上游引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’下游引物ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’放線菌上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’下游引物1492R：5’-GGTTAC