第4章

微生物的分類與鑒定contents1微生物分類的基本理論2細菌分類鑒定的特征和技術3微生物的快速鑒定和自動化分析1微生物分類的基本理論微生物分類學(microbialtaxonomy):研究微生物分類理論和技術方法的學科。從廣義上講，分類學涉及三個相互依存又有區(qū)別的組成部分：分類、命名、鑒定1.1微生物分類學的三個組成部分分類(classification)：根據(jù)一定的原則(表型特征相似性或系統(tǒng)發(fā)育相關性)對微生物進行分群歸類，根據(jù)相似性或相關性水平排列成系統(tǒng)，并對各個分類群的特征進行描述，以便查考和對未被分類的微生物進行鑒定。

----根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)建立系統(tǒng)的過程根據(jù)相互之間的相似性或進化親緣關系將生物歸屬為類群或分類單元（taxa)。（美：沈萍與彭珍榮譯，p428)1.1微生物分類學的三個組成部分命名(nomenclature)：是根據(jù)命名法規(guī)，給每一個分類群一個專有的名稱

----分類系統(tǒng)建立過程中的步驟之一命名是分類學的一個分支，給予分類類群單元與公布規(guī)則相符的名稱。（美：沈萍與彭珍榮譯，p428)]鑒定(identification或determination)：借助于現(xiàn)有的微生物分類系統(tǒng)，通過特征測定，確定未知的、或新發(fā)現(xiàn)的、或未明確分類地位的微生物所應歸屬分類群的過程.

--根據(jù)現(xiàn)有系統(tǒng)確定未知微生物分類歸屬的過程。鑒定是分類學的實用方面，是決定某一特定分離物歸屬于某一已確認分類單元的過程。（美：沈萍與彭珍榮譯，p428)]1.1微生物分類學的三個組成部分1.2分類單元及其等級分類單元（taxon,復數(shù)taxa)：

指具體的分類群（具有特定名稱的分類群）。如：原核生物界(Procaryotae)、 腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等

分類單元具有不同的水平和等級，國際公認的生物分類單元的7個分類等級自上向下為：界Kingdom

門DivisionorPhylum

綱Class

目Order

科Family

屬Genus

種Species1.2分類單元及其等級 在分類中，若這些分類單元的等級不足以反映某 些分類單元之間的差異時也可以增加"亞等級"

即：亞界、亞門……亞種，在細菌分類中，還可 以在科(或亞科)和屬之間增加族和亞族等級。1.2分類單元及其等級界Kingdom

門DivisionorPhylum

綱Class

目Order

科Family

屬Genus

種Species值得強調(diào)的是，分類單元的等級只是分類單元水平的概括，它并不代表具體的分類單元。1.2分類單元及其等級分類等級分類單元中文名稱英文名稱拉丁名稱學名詞尾舉例界KingdomRegnumProcaryotae(原核生物界）亞界SubkingdomSubregnum門DivisionDivisioGracilicutes（薄壁菌門）亞門SubdivisionSubdivisio綱ClassClassisScotobacteria(暗細菌綱）亞綱SubclassSubclassis目OrderOrdo-alesRickettsiales(立克次氏體目）亞目SuborderSubordo-ineae科FamilyFamilia-aceaeRickettsiaceae(立克次氏體科）亞科SubfamilySubfamilia-oideae（族）TribeTribus-eaeRickettsieae(立克次氏體族）（亞族）SubtrideSubtribus-inae屬GenusGenusRickettsia(立克次氏體屬）亞屬SubgenusSubgenus種SpeciesSpeciesRickettsiaprowazekii(普氏立克次氏體）亞種SubspeciesSubspecies除此之外,在微生物分類中,還常使用一些非正式的類群術語,如：亞種以下常用培養(yǎng)物、菌株、種群和型；種以上常使用群、組、系等類群名稱1.2分類單元及其等級根據(jù)CarlWoese的理論，現(xiàn)在還在界之上使用域(domain)把全部生物先分為:古生菌域真細菌域真核生物域域下面再分界1.2分類單元及其等級1.3常用的細菌分類學術語：

1）微生物種的定義

表型種：具有高度特征相似性的菌株群，這個菌株群與其他的菌株群有很明顯的區(qū)別

基因型種：

基因組DNA雜交同源性在60-70%以上;或者16S rRNA序列同源性達97%以上的菌株定為一個種.2）菌株(strain)或病毒的毒株：從自然界中分離得到的任何一種微生物的純培養(yǎng)物都可以稱為微生物的一個菌株；用實驗方法(如誘變)所獲得的某一菌株的變異型，也可以稱為一個新的菌株，以便與原來的菌株相區(qū)別。

菌株 是微生物分類和研究工作中最基礎的操作實體。2）菌株(strain)或病毒的毒株：菌株強調(diào)的是遺傳型純；菌株與克隆（無性繁殖系）的概念相同；

同一菌種的不同菌株間，作為鑒定用的一些主要性狀是相同的，非鑒定用性狀上可存在很大的差異（如：產(chǎn)量性狀）； 菌株實為一個物種內(nèi)遺傳多態(tài)性的客觀反映，其數(shù)目是無限的；菌株實際上是某一菌株達到遺傳型純的標志，一旦變異，都應當標以新的菌株名稱；菌株的名稱可以隨意確定；菌種保藏時，發(fā)表論文或生產(chǎn)等，都必須在菌種后標出該菌株的名稱。2）菌株(strain)或病毒的毒株：例如：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)的2個菌株：BacillussubtilisAS1.398：蛋白酶生產(chǎn)菌BacillussubtilisBF7658：α-淀粉酶生產(chǎn)菌再如：大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）的2個菌株EscherichiacoliK12：常用菌株EscherichiacoliO-157:H7：致病菌3）培養(yǎng)物(culture)：一定時間一定空間內(nèi)微生物的細胞群或生長物。如微生物的斜面培養(yǎng)物、搖瓶培養(yǎng)物等。由單一微生物細胞繁殖產(chǎn)生的培養(yǎng)物，稱為純培養(yǎng)物。由多種微生物細胞繁殖產(chǎn)生的培養(yǎng)物，稱為混合培養(yǎng)物。1.3常用的細菌分類學術語：??4）亞種(subspecies)或變種（variety):當種內(nèi)不同菌株存在少數(shù)，但是明顯而穩(wěn)定的變異特征或者遺傳性狀，但是又不足以區(qū)分為新種時，就可以將這些菌株細分為更小的分類單元---亞種。 亞種是正式分類單元中地位最低的分類等級；

1976年后，細菌種的亞等級一律采用亞種，不再使用變種。1.3常用的細菌分類學術語：5）型(form或type)：常指亞種以下的細分。當同種或同亞種不同菌株之間的性狀差異，不足以分為新的亞種時，可以細分為不同的型。例如：抗原特征的差異分為不同的血清型； 對噬菌體裂解反應的不同分為不同的噬菌體型等

菌株與型的區(qū)別菌株之間不存在鑒別性特征的差異，命名不同的菌株無需分類學依據(jù)；不同型的細菌之間存在鑒別性特征的差異，命名或鑒定不同的型必需有分類學依據(jù)。1.3常用的細菌分類學術語：5）型(form或type)：“Type”一詞在分類中還有“模式或者典型”的意思，為避免誤解，對型的表示詞匯作了修改，用“-var”代替了“-type”表常用型的術語及其含義中文譯名 生物型

血清型

致病型 噬菌型 形態(tài)型

推薦使用的名稱biovarSerovarPathovarPhagovarMorphovar

以前使用的同義詞biotypeSerotypePathotypephagotypelysotypephagotypelysotype應用于只有下列性狀的菌株 特殊的生理生化性狀

不同的抗原特征

對宿主致病性的差異 對噬菌體溶解反應的差異 特殊的形態(tài)學特征1.4微生物的命名生物名稱區(qū)域性的俗名國際上統(tǒng)一使用的學名??其中種名:細菌的種名采用雙名法命名.即：“屬名+種名加詞”，二元式組合屬名在前，一般用拉丁字名詞表示，首字母大寫；種名在后，常用拉丁文形容詞表示，全部小寫。如：Pseudomonasaeruginosa(銅綠色假單胞菌）Pseudomonas

是屬名(假單胞菌屬)；aeruginosa

是種名加詞，是拉丁語形容詞，原意為"銅綠色的"。??3)種名:細菌的種名采用雙名法命名.

即：“屬名+種名加詞”，二元式組合

屬名在前，一般用拉丁字名詞表示，首字母大寫； 種名在后，常用拉丁文形容詞表示，全部小寫。 如：Pseudomonasaeruginosa(銅綠色假單胞菌）

Mycobacteriumtuberculosis（結(jié)核分支桿菌）

Bacillusthuringiensis（蘇云金芽孢桿菌） 印刷體一般用斜體表示.在上下文中再次出現(xiàn)時，種名可縮寫成：P.aeruginosa

亞種名

“屬名+種名加詞+subsp.亞種名加詞”

Alcaligenesdenitrificanssubsp.Xylosoxylans

屬名產(chǎn)堿桿菌屬種名加詞 反硝化的縮寫

亞種名加詞氧化木糖的該亞種名為：反硝化產(chǎn)堿桿菌氧化木糖亞種

Bacillussubtilissubsp.nigar

枯草芽孢桿菌黑色亞種命名法則

1)所有正式分類單元的學名,必須用拉丁詞或拉丁化的詞命名.2)屬名:字首字母大寫3)種名:二元式組合“屬名+種名加詞”4)亞種名:三元式組合“屬名+種名加詞+subsp.亞種名加詞”5)屬級以上分類單元的名稱:特定的詞尾6)屬名,種名,亞種名印刷體一律斜體.

Bacillussubtilissubsp.nigar

枯草芽孢桿菌黑色亞種1.5細菌分類系統(tǒng)最理想的分類系統(tǒng)是:自然分類（naturalclassifica-tion)，即將那些具有許多共同特征的成員分為一個類群，并能夠盡可能地反映生物的本性。

有兩種方法建立分類系統(tǒng)

表型系統(tǒng)根據(jù)整個相似性將生物組織在一起；

系統(tǒng)發(fā)育系統(tǒng)根據(jù)可能的進化關系將生物組織在一起。1.5細菌分類系統(tǒng)1.表型分類系統(tǒng)：根據(jù)整個相似性將生物組織在一起；其特點：1.能夠顯示可能的進化關系；2.不是依賴于系統(tǒng)發(fā)育的分析；3.所有的表型特征同等對待，不考慮系統(tǒng)發(fā)育上主次作用；因此，最好的表型分類就是比較盡可能多的性狀而建立起來的分類。1.5細菌分類系統(tǒng)2.系統(tǒng)發(fā)育分類：建立在進化關系上而不是普遍的相似性基礎上。由于缺少好的化石記錄，對于原核生物多是直接比較遺傳物質(zhì)和基因產(chǎn)物如：DNA、RNA和蛋白質(zhì)等。1.5細菌分類系統(tǒng)----Bergey’sManual

Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology

《伯杰氏鑒定細菌學手冊》1923年賓夕法尼亞大學的細菌學教授DavidBergy和四個同事發(fā)表了細菌分類法,至1994年,發(fā)行了第9版。各版本反映了出版年代細菌分類學的最新成果，因而逐漸確立了在國際上對細菌進行全面分類的權威地位。從1974年的第8版開始,已經(jīng)成為世界通用的“官方的分類”。(如1974年第8版，撰稿人多達130多位，涉及15個國家；現(xiàn)行版本撰稿人多達300多人，涉及近20個國家)。

美國賓夕法尼亞大學的細菌學教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)1.5細菌分類系統(tǒng)----Bergey’sManual

（20世紀80年代）

Bergey’sManualofSystematicBacteriology

《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》1984-1989年分4卷出版第一版（給出的系統(tǒng)基本上是表型性的），目前正在分5卷出版該手冊的第二版（rRNA,DNA和蛋白質(zhì)，系統(tǒng)發(fā)育）。伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊第一版分類大綱——p339伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊第二版分類大綱——p340從1984年第一版開始發(fā)行以來，細菌分類已取得了巨大進展，新命名的種成倍增加、新描述的屬也在170個以上，尤其是80年代末以來，rRNA、DNA、蛋白質(zhì)序列分析方法日趨實用，為細菌的系統(tǒng)發(fā)育積累了不少新的資料。伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊第二版中更多地采用了核酸序列資料對分類群進行新的調(diào)整，無疑這是細菌系統(tǒng)發(fā)育分類的重大進展伯杰氏手冊是目前進行細菌分類、鑒定的最重要依據(jù)，其特點是描述非常詳細，包括對細菌各個屬種的特征及進行鑒定所需做的實驗的具體方法。1.5細菌分類系統(tǒng)----Bergey’sManual2細菌分類鑒定的特征和技術傳統(tǒng)技術：形態(tài)學特征、

生理學特征、 生態(tài)學特征 血清型與噬菌體分型2.1形態(tài)學特征(1)培養(yǎng)特征:最重要是菌落特征：如菌落的形狀、大小、顏色、隆起、表面狀況、質(zhì)地、光澤、水溶性色素等.(2)細胞形態(tài):形態(tài)(球形、桿狀、弧形、螺旋形、絲狀、分枝及特殊形狀)大小(其中最重要的是細胞的寬度或直徑)排列(單個、成對、成鏈或其他特殊排列方式)(3)特殊的細胞結(jié)構(gòu):鞭毛(有無鞭毛、著生位置及其數(shù)量);芽孢(有無芽孢、形狀、著生位置、孢囊是否膨大)；孢子(孢子形狀、著生位置、數(shù)量及排列);其他(莢膜、細胞附屬物為柄、絲狀物、鞘、藍細菌的異形胞、靜止細胞和連鎖體等);超微結(jié)構(gòu)(細胞壁、細胞內(nèi)膜系統(tǒng)、放線菌孢子表面特征等)(4)細胞內(nèi)含物:異染顆粒、聚β-羥丁酸等類脂顆粒、硫粒、氣泡、伴孢晶體等(5)染色反應:革蘭氏染色、抗酸性染色(6)運動性:鞭毛泳動、滑行、螺旋體運動方式2.2生理生化特征(1)營養(yǎng)類型:光能自養(yǎng)/異養(yǎng)、化能自養(yǎng)/異養(yǎng)及兼性營養(yǎng)型(2)氮源的利用能力:對蛋白質(zhì)/胨、氨基酸、含氮無機鹽、N2等的利用(3)碳源的利用能力:對各種單/雙/多糖以及醇類、有機酸等的利用(4)對生長因子的需要:對特殊維生素、氨基酸等的依賴性(5)需氧性:好氧、微好氧、厭氧及兼性厭氧(6)對溫度的適應性:最適、最低及最高生長溫度及致死溫度(7)對pH的適應性:在一定pH條件下的生長能力及生長的pH范圍(8)對滲透壓的適應性:對鹽濃度的耐受性或嗜鹽性(9)對抗生素及抑菌劑的敏感性:對抗生素、氰化鉀(鈉)、膽汁、弧菌抑制劑或某些染料的敏感性(10)代謝產(chǎn)物:各種特征性代射產(chǎn)物(11)與宿主的關系:共生、寄生、致病性等形態(tài)和生理生化特征是最常用的細菌分類、鑒定指標2.3血清型和噬菌體型1、血清學試驗： 例如： 根據(jù)鞭毛抗原(H抗原):蘇云金芽孢桿菌分成40多個血清 型； 根據(jù)莢膜抗原:肺炎鏈球菌分成近百個血清型；根據(jù)菌體(O)抗原、H抗原和表面(Vi)抗原:將沙門氏菌屬細菌分成約2000個血清型等等。血清型的劃分在流行病的研究中有重要意義。

2、噬菌體型：噬菌體應用于細菌分類鑒定工作中的分型基礎是：噬菌體對宿主的感染和裂解作用常具有高度的特異性，即一種噬菌體往往只能感染和裂解某種細菌，甚至只裂解種內(nèi)的某些菌株。但也存在宿主范圍較廣泛的噬菌體，是否反映屬種間的系統(tǒng)發(fā)育相關性及其相關程度，目前尚沒有明確的解析。2.3血清型和噬菌體型噬菌體分型Salmonellatyphi傷寒沙門氏菌現(xiàn)代技術：氨基酸順序和蛋白質(zhì)分析核酸的堿基組成和分子雜交rRNA的序列分析2細菌分類鑒定的特征和技術化學分類特征2.4氨基酸順序和蛋白質(zhì)分析依據(jù)：（1）蛋白質(zhì)氨基酸序列的進化速率基本恒定。具有重要功能的蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子中的重要功能區(qū)域的氨基酸進變化速率低。（2）同功能蛋白氨基酸序列相似性越高，其親緣關系越近。常用于分類鑒定的蛋白分子靶點：（1）細胞色素和電子傳遞蛋白（2）組蛋白（3）熱休克蛋白（4）轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白等通過氨基酸順序判斷細菌間的親緣關系金槍魚2.5核酸的堿基組成和分子雜交1）每個物種都有特定的GCmol%范圍，因此可以作為分類鑒定的指標。細菌的GCmol%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合于細菌的分類鑒定。否定原則資料表明：（1）同一個種內(nèi)的不同菌株GC含量差別在4--5%以下。否定原則：若二個在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其GC含量的差別大于5%，則肯定不是同一個種，即將GC含量差別大于常規(guī)值的菌株進行排除的原則。資料表明：（2）同屬不同種的差別應低于10--15%。否定原則：被鑒定的菌株GC含量差別大于15%，則肯定不是同一個屬。2.5核酸的堿基組成和分子雜交

2.核酸的分子雜交：

不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物之間

親緣關系的遠近，堿基排列順序差異越小，它們之

間的親緣關系就越近，反之亦然。

t直接分析比較DNA的堿基排列順序

---由于技術上的