暗腹雪雞cy基因克隆及序列分析

世界上分布最高的鳥類之一是一種生活在海拔超過3000米的鳥。世界上有五種喜食雞屬、秋海雞、大海雞、altai雞、黑雞和泰海雞。主要分布在歐亞大陸。其中，黑雞、藏雞和泰海雞主要分布在中國新疆和毗鄰地區。雪雞是一種二級國家保護動物，國內外關于雪雞的文獻很少。到目前為止，只有蘇聯科學家對黑雞進行了研究。沈曉宇和當地科學家鄭作新對雪雞的分類、地理分布和生態進行了全面的介紹，而雞的分子系統發展尚未報告。根據力學研究，雪雞科的分類分為雞型和科。目前在動物分類進化和系統分類研究中,由于線粒體DNA具有快速進化、缺少重組、嚴格的母系遺傳、基因組小、易于測序和分析等特點,作為一種有效的分子標記得到了廣泛的應用.在鳥類中,常用細胞色素b(cytochromeb,Cytb)來進行分類地位和系統進化的研究.用Cytb基因的序列,特別是全長序列來研究鳥類的分類、親緣關系、系統演化,已經成為最可靠的依據之一,解決了不少困擾分類學家多年的問題.本文克隆了暗腹雪雞的Cytb基因全長序列,并且把它作為一種遺傳標記,分析了雪雞屬在雉科中分類地位、親緣關系問題.1材料和方法1.1雞baminus5只暗腹雪雞(Tetraogallushimalayensis)肌肉組織樣品,采自我國新疆天山地區.其他雉科19個屬物種的Cytb基因全長序列從GenBank上檢索所得.石雞(Alectorischukar序列號L08378)、剛果孔雀(AfropavocongensisAF013760)、大眼斑稚(ArgusianusargusAF013761)、灰胸竹雞(BambusicolathoracicaAF028790)、日本鵪鶉(CoturnixjaponicaAP003195)、彩雉(CatreuswallichiAF028792)、紅腹錦雞(ChrysolophuspictusobscurusAF534563)、藍馬雞(CrossoptilonauritumAF534552)、鷓鴣(FrancolinusfrancolinusAF013762)、原雞(GallusgallusAY235570)、血雉(IthaginiscruentusAF068193)、棕尾虹雉(LophophorusimpejanusAF028796)、藍鷴(LophuraswinhoiiAF314644)、藍孔雀(PavocristatusL08379)、環頸雉(PhasianuscolchicusAF028798)、眼斑孔雀雉(PolyplectrongermainiAF330063)、勺雞(PucrasiamacrolophaAF028800)、黑頸長尾雉(SyrmaticushumiaeAF534560)、紅腹角雉(TragopantemminckiiAF229838).1.2dna提取取肌肉組織50mg標準酚氯法提取,操作過程中設空白對照.1.3tagac-3的pcr擴增根據GenBank中已知的原雞的Cytb序列,用PrimerPremier5.0進行引物設計,S15’-TACCTGGGTTCCTTCGCCCT-3’,S25’-TTCAGTTTTTGGTTTACAAGAC-3’.擴增反應體積為50uL,其中含有0.2mMdNTPs,0.5μM引物,10mMTris-HCl(pH8.0),1.5mMMgCl2,1.5unitTaqPULS酶,以及約100ng的DNA模板.反應條件為95℃預變性5min;94℃變性60s,50℃退火60s,72℃延伸60s,共進行30個循環;72℃延伸10min.PCR反應在PTC-200型熱循環儀上進行,操作過程中設空白對照.取5μL反應液在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測.1.4重組質粒的鑒定PCR產物經瓊脂糖電泳分離后,用上海生工(Sangon)生產的UNIQ10柱式PCR產物回收試劑盒(UNIQ-10columnPCRProductsPurificationKit)純化回收.將Cytb基因的PCR純化產物克隆到PMD18-T載體中(購自寶生生物工程有限公司),鑒定陽性克隆后,對重組質粒進行測序.測序在Pharmacia公司自動測序儀Megabase1000上進行.1.5ssr標記系統的建立用DNASTAR軟件包中的MegAlign程序排列DNA同源序列(1143bp),并經人工仔細核查.在此基礎上,序列輸入MEGA2.1軟件包.計算不同序列間的堿基組成百分比、變異位點數、簡約信息位點數、轉換顛換比值、顛換百分比,并用雙參數法(Kimura2-parameter)計算分枝間的遺傳距離,用鄰接法(Neighbor-joining)進行系統重建,鄰接樹采用Kimura2-parameter法.用PHYLIP3.6軟件包進行最大擬然法(MaximumLikelihood)和最大簡約法(MaximumParsimony)的系統重建,系統重建均以灌叢塜雉(AlecturalathamiAF082058)為外群,系統樹各分枝的置信度由重抽樣法(Bootstrap)1000次重復檢測,DNA序列變異中的轉換和顛換賦于相同的加權值.2堿基組成對g蛋白表達的影響,有相關物種轉換與糾偏從肌肉組織中提取的DNA經PCR擴增后,獲得了清晰且無非特異性條帶的結果(見圖1).產物克隆到PMD18-T載體后測序,得到雪雞細胞色素b全長序列(1143bp),序列為首次報道,已提交GenBank數據庫,序列號為AY678108,與GenBank雉科其他19個屬物種的序列比對中共有變異位點481個,其中353個為簡約信息位點,在密碼子的第三位存在152個變異,占總變異位點的31.6%.T、C、A、G的平均含量為25.1%、34.8%、27.9%、12.3%,堿基組成的百分比中顯示出G的相對缺乏.21個物種轉換與顛換的平均比值為2.1(見表1),顛換的平均百分比為4.29%,經MEGA軟件包進行遺傳距離的運算后得到表1矩陣.表1中:1.暗腹雪雞(Tetraogallushimalayensis);2.日本鵪鶉(Coturnixjaponica);3.石雞(Alectorischukar);4.黑鷓鴣(Francolinusfrancolinus);5.灰胸竹雞(Bambusicolathoracica);6.紅原雞(Gallusgallus);7.彩雉(Catreuswallichi);8.紅腹錦雞(Chrysolophuspictusobscurus);9.藍馬雞(Crossoptilonauritum);10.藍鷴(Lophuraswinhoii);11.環頸雉(Phasianuscolchicus);12.黑頸長尾雉(Syrmaticushumiae);13.剛果孔雀(Afropavocongensis);14.藍孔雀(Pavocristatus);15.大眼斑稚(Argusianusargus);16.血雉(Ithaginiscruentus);17.棕尾虹雉(Lophophorusimpejanus);18.眼斑孔雀雉(Polyplectrongermaini);19.勺雞(Pucrasiamacrolopha);20.紅腹角雉(Tragopantemminckii);21.灌叢塜雉(Alecturalathami)3討論3.1tc、ac和act的基因序列及密碼子的基暗腹雪雞的Cytb序列的A、T、G、C含量在密碼子第一位沒有較大偏差,而第二位富含T,第三位G的含量很少.這和哺乳動物細胞色素b基因序列的特點非常相似.第三位C的含量特別高,接近50%.核苷酸堿基的變異也存在著很大的差異,其中T?C的轉換大于A?G,A?C和A?T的顛換明顯高于T?G和C?G.本文研究的雉科中不同物種間,轉換顛換比的平均值為2.1,接近轉換顛換比的臨界值2.0.說明雉科中這些物種的線粒體Cytb基因序列的突變已經接近飽和狀態.本文研究的所有序列中,顛換幾乎都發生在密碼子的第三位上(89.8%),而轉換分布在第一(19.8%)、第三位密碼子上(75.2%),第二位上很少(5.0%).說明密碼子第二位在雉科的進化中十分保守,很少發生突變.3.2暗腹雪雞屬系聚的構建目前,雪雞屬被歸于雉科只是基于其形態特征、地理分布、生活習性的研究,本文把雪雞的Cytb全長序列與雉科中的其他19個屬的物種和塜雉科的灌叢塜雉(Alecturalathami)做了比較,計算了各物種間的遺傳距離,如表1所示.雪雞與雉科的各物種的距離為11.6%～16.9%,雉科中屬和屬之間的遺傳距離一般大于9%,遺傳距離說明雪雞屬與雉科中其他物種的差異已經達到屬的水平,符合目前的分類系統,是雉科中的一個有效屬,支持了形態學分類結果.在系統進化樹的研究中,很難用一種系統進化樹正確得出系統關系,為此,本文構建了3種進化樹:NJ、MP、ML樹.在任何分析中,自舉置信水平(BCL)值小于50%的進化枝可信度不高,而當BCL值大于等于70%時,形成的進化枝正確的可信度高達95%.從構建的系統樹圖2中(圖中數字為自舉置信水平Bootstrap值,1000次重復檢測.若Bootstrap值小于50,結點不顯示)可以明顯地看到暗腹雪雞首先和日本鵪鶉類聚在一起,兩者互為單系,然后再和石雞聚在一起形成單系群,這個結果在3種樹中都非常一致,而且暗腹雪雞和日本鵪鶉形成的進化枝自舉置信水平(BCL)值較高,在NJ、MP、ML樹中分別為了80%、66%、75%,表1中顯示的數據中,暗腹雪雞和日本鵪鶉的遺傳距離最小為11.6%.這兩者與石雞形成的進化枝雖然自舉置信水平(BCL)值不是很高,在NJ、MP、ML樹中分別為77%、50%、55%,但均大于50%.陳愛葵等人對鵪鶉和石雞的核型及C帶進行過研究,表明這兩種鳥類親緣關系相近.Kimball等人通過Cytb和D-Loop的研究也證明了鵪鶉屬與石雞屬這一進化枝的存在.本文在增加了雪雞這一物種后研究的結果也基本相同.所以本文得出的結論是在雉科中,雪雞屬與鵪鶉屬的親緣關系最近,其次是和石雞屬,這3者形成一個單系群,再和雉科中的其他屬相類聚.3.3種進化樹之間的聯系作者發現在NJ、MP、ML樹中都形成了由黑鷓鴣、灰胸竹雞和原雞構成的進化枝(見圖2),置信水平很高,分別為93%、86%、90%.Johnsgard(1986)認為原雞進化枝只包括Gallus一個物種.而Kimball(1999)等人認為鷓鴣屬-竹雞屬-原雞屬屬于同一進化枝.本文的研究表明鷓鴣屬-竹雞屬-原雞屬進化枝的存在,同Kimball的結果一致.另外,在3種進化樹中還形成了一個置信度較高的分支,即彩雉、紅腹錦雞、藍馬雞、藍鷴、雉雞、黑頸長尾雉六者形成的置信度分別為100%、98%和99%的分支.這個進化枝明顯與雉科雉族其他物種分離,結果提示這些雉族可能存在特定關系,有待進一步研究分析.剛果孔雀和藍孔雀類聚的置信度在3種進化樹中分別為100%、97%和99%,證實了雉科中孔雀族確實在進化關系上一致.3.4雪雞屬與克氏原螯蝦屬的系統發育鳥類的mtDNA進化速度很慢.Cytb的核苷酸大約每百萬年變化5%～7%.在1143bp中,雪雞與日本鵪鶉的差