高溫前酵與不同前酵條件下毛霉、根霉復合釀造防腐劑的比較研究

生產周期分為前發(fā)酵和后發(fā)酵。前發(fā)酵是細菌生長、分泌和積累酶系統(tǒng)的過程，并從腐敗中獲得毛囊。毛霉是腐乳主要生產用菌,由于其高溫耐受性差,導致在炎熱季節(jié)生產的腐乳質量不佳。通過對酶系活力及感官性狀的跟蹤檢測,發(fā)現(xiàn)在高溫環(huán)境下采用雅致放射毛霉與米根霉混合釀造腐乳在前酵階段生長良好。風味是衡量腐乳質量的重要參照。腐乳后酵階段各種成分的變化和參與發(fā)酵菌種有著密切關系。在腐乳的后酵階段,坯體中的大分子物質在由微生物所分泌的大量酶系的作用下,降解成小分子成分,從而提高產品的營養(yǎng)和風味。通過對比高溫前酵條件下混菌、單菌釀造的腐乳在后酵階段的主要化學組分、感官評價的變化進行測定,并對后酵階段坯體中蛋白質降解情況及產品風味成分進行分析,從而完成對高溫下腐乳風味化學組分的研究,為指導高溫生產環(huán)境下混菌腐乳的實際生產提供一定理論依據。1材料和方法1.1致放射性毛霉ciccrend與米根霉cicc397的復合釀造腐乳毛坯:在35℃高溫前酵條件下,分別由雅致放射毛霉(CICC3118)與米根霉(CICC3037)以1∶1比例復合釀造,雅致放射毛霉(CICC3118)單菌釀造。1.2試劑與試劑廠SDS試劑盒康為世紀;低分子量標準蛋白,十二烷基硫酸鈉(SDS)、Tris-HCl、考馬斯亮藍R250寶生物工程(大連)公司;超低分子量標準蛋白北京索萊寶科技有限公司;硝酸銀國防科技工業(yè)應用化學一級計量站;甲醛重慶川江化學試劑廠;溴酚藍上海常必鑫貿易有限公司;硼酸成都市科龍化工試劑廠;巰基乙醇天津市光復精細化工研究所。1.3洪紀儀器設備79-1磁力加熱攪拌器金壇市富華儀器有限公司;ATN-300全自動定氮儀上海洪紀儀器設備有限公司;YCZ-24DN垂直電泳槽北京六一儀器廠;HP6890/5975CGC/MS聯(lián)用儀美國安捷倫公司;2cm-50/30μmDVB/CAR/PDMS手動固相微萃取裝置美國Supelco公司。1.4測試方法1.4.1工藝1.4.2主要檢測項目和方法氨基酸態(tài)氮的測定:甲醛滴定法;食鹽的測定:AgNO3滴定法;水溶性蛋白的測定:半微量凱氏定氮法;可溶性無鹽固形物的測定。1.4.3腐敗后的情緒評估品評步驟按照文獻進行,結合行業(yè)標準中感官評定要求制定評分標準,見表1。1.4.4e凝膠的制備凝膠的制備:分離膠和濃度膠均按康為世紀SDS凝膠制備試劑盒說明配制,分離膠濃度分別為12%、20%,濃縮膠濃度為5%,板膠厚0.75mm。溶液配制、上樣及電泳、固定和染色操作均參照相關文獻進行。1.4.5保鮮條件及質譜分析樣品處理:取樣品約10g,置于50mL固相微萃取儀采樣瓶中,插入裝有2cm-50/30μmDVB/CAR/PDMSStableFlex纖維頭的手動進樣器,在85℃左右頂空萃取30min取出,快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250℃)中,熱解析3min進樣。分析條件:色譜柱為ZB-5MSi5%Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane(30m×0.25mm×0.25μm)彈性石英毛細管柱,柱溫45℃(保留2min),以5℃/min升溫至280℃,保持2min;汽化室溫度為250℃;載氣為高純He(99.999%);柱前壓7.62psi,載氣流量1.0mL/min;不分流進樣;溶劑延遲時間:2.0min。質譜條件:采用EI源為離子源;離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;電子能量70eV;發(fā)射電流34.6μA;倍增器電壓1436V;接口溫度280℃;質量范圍20~450amu。檢測方法:采用固相微萃取法和氣相色譜-質譜聯(lián)用法對腐乳風味物質進行檢測。通過質譜計算機數(shù)據系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖,對總離子流圖中的各峰進行分析,確定揮發(fā)性化學成分,并用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質量分數(shù)。選取相對含量較大并有完整質譜數(shù)據的組分為分析對象。2結果與分析2.1自乳化階段以來，主要化學成分的變化2.1.1乳酸發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化經高溫前酵的單菌釀造腐乳、混菌釀造腐乳后酵第1周至第9周氨基酸含量變化情況見圖1。由圖1可知,在腐乳后酵階段,兩組樣品的氨基酸態(tài)氮含量均有了不同程度的上升。混菌釀造腐乳的氨基酸態(tài)氮含量迅速增加,而單菌釀造腐乳的氨基酸態(tài)氮含量增速相對較平緩;這是因為在35℃前酵環(huán)境中,混菌釀造腐乳坯體上的菌體生長更為迅速茂密,所積累的蛋白酶的量與活力也更高。2.1.2其營養(yǎng)比的確定經高溫前酵的單菌釀造腐乳、混菌釀造腐乳在后酵第1周至第9周水溶性蛋白含量變化情況見圖2。由圖2可知,隨著前期發(fā)酵過程中豆腐坯上積累的酶系的作用,蛋白質的降解速度加快,水溶性蛋白質的含量快速上升;后酵進行到7~21天,水溶性蛋白質的含量增長迅速,但混菌釀造樣品增幅更明顯。后酵21~63天期間,單菌釀造腐乳與混菌釀造腐乳水溶性蛋白質含量相比增長較平緩。至63天,單菌釀造腐乳坯體與混菌釀造腐乳的水溶性蛋白含量分別達到10.8g,11.5g/100g。2.1.3可溶性無鹽固對于混菌釀造乳酸發(fā)酵過程中混菌發(fā)酵經高溫前酵的單菌釀造腐乳、混菌釀造腐乳在后酵第1~9周水溶性無鹽固形物的變化情況見圖3。由圖3可知,在21天檢測時兩組的水溶性無鹽固形物均出現(xiàn)了迅速下降的情況,這是由于在第14天檢測時發(fā)現(xiàn)樣品中食鹽含量稍低,補加了食鹽,導致了第21天檢測時水溶性無鹽固形物的驟減和第28天含量的驟增,之后增長速度變緩。此過程中混菌釀造腐乳的水溶性無鹽固形物含量高于單菌釀造腐乳。水溶性無鹽固形物含量的高低可以反映在發(fā)酵過程中有效營養(yǎng)成分的分解利用的情況,含量越高,蛋白質和淀粉的分解就越徹底,口感越柔軟細膩,香味越好,營養(yǎng)成分也越高。2.2高溫、高溫下混菌釀造乳酸的評分通過后酵階段每周對單菌釀造腐乳與混菌釀造腐乳樣品進行感官品評,按照表2的評分要求分別對兩組樣品進行打分。由表2可知,在整個后酵階段,高溫下混菌釀造腐乳的評分一直高于高溫下單菌釀造腐乳的評分。這與后酵階段各主要化學組分的變化情況是吻合的。2.3感官、口感及細菌培養(yǎng)通過對后酵階段各化學組分、感官評價進行對照,盡管在后酵63天兩者的上述指標差別不太大,但混菌釀造腐乳的風味、口感及細膩程度明顯優(yōu)于單菌釀造腐乳。為此,進一步檢測了兩組樣品在后酵階段蛋白質的水解情況,并利用GC-MS測定了產品的風味物質。2.3.1不同發(fā)酵時間對混菌投資發(fā)酵乳酸中蛋白質的降解經歷高溫前酵過程的單菌釀造腐乳與混菌釀造腐乳分別在后酵3,6,9天及毛坯的SDS結果見圖4。在豆腐坯體的后酵階段中,菌體所分泌的蛋白酶對腐乳坯體中的蛋白質進行了水解。隨著發(fā)酵時間的推移,大分子量的蛋白質被水解成小分子量的胨、肽及氨基酸。由圖4可知,后酵3,6,9天兩組樣品的蛋白質降解程度,雖然兩組樣品中的蛋白質都有明顯的降解現(xiàn)象,但混菌釀造腐乳中蛋白質水解更為迅速。至后酵9天,混菌釀造腐乳的蛋白質分子量基本已小于14.3kDa,但單菌釀造腐乳的蛋白質在14.3~20.1kDa范圍內仍有明顯條帶。2.3.2小分子量物質分析高溫下單菌釀造腐乳和高溫下混菌釀造腐乳分別在后酵30,60天的SDS結果見圖5。在后酵后期,隨著成熟時間的延長,腐乳坯體中的蛋白質的水解程度增加,出現(xiàn)了大量的小分子量物質。由圖5可知,在后酵階段進行至30天時,單菌釀造腐乳樣品在分子量為22.0kDa附近有明顯條帶,此時混菌釀造腐乳樣品的分子量已經小于14.4kDa,說明混菌釀造腐乳的蛋白質在后酵后期降解更為迅速。在后酵進行至60天時,混菌釀造腐乳樣品主要以分子量小于7.8kDa的形式存在,單菌釀造腐乳樣品中物質的分子量在0~22.0kDa之間均有分布。表明在后酵后期,混菌釀造腐乳中的蛋白質降解為更小分子量的物質。2.4揮發(fā)性化學成分的種類使用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀對經過9周后酵的高溫下毛霉單菌釀造腐乳及混菌釀造腐乳產品中的風味成分進行分離,并以常溫下單菌釀造腐乳做對比,得到GC-MS總離子圖,分別見圖6~圖8。對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數(shù)據系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖,確定出揮發(fā)性化學成分的種類,用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質量分數(shù),分析結果見表3。各種酯類和醇類構成了腐乳的主要香氣物質。由表3可知,高溫下單菌釀造腐乳產品的風味物質33種,其中,醇類化合物5種,酯類化合物15種;高溫下混菌釀造腐乳產品的風味物質43種,包括醇類化合物6種,酯類化合物18種;常溫下單菌釀造腐乳產品的風味物質42種,主要有醇類化合物7種,酯類化合物12種。高溫前酵條件下混菌釀造的腐乳中,風味物質種類明顯多于高溫前酵條件下單菌釀造腐乳;而與常溫前酵條件下雅致放射毛霉單菌釀造腐乳相差不大。說明高溫下混菌釀造腐乳的風味與常規(guī)生產的產品接近,但比同條件單菌釀造產品更豐富,這與化學組分的測定及感官評分的結果是一致的。3感官及風味變化經高溫前酵的混菌及單菌釀造腐乳在后酵階段主要化學組分、感官評價的變化情況都存在一定差異。至后酵63天,混菌釀造腐乳的氨基酸態(tài)氮高于單菌釀造的0.07g/100g,水溶性蛋白的含量高于0.7g/100g,水溶性無鹽固形物的含量高于0.5g/100g。以色澤、香氣、滋味、質地及組織形態(tài)為感官指標,混菌釀造腐乳的評分一直高于單菌釀造腐乳。對毛坯及后酵階段的樣品進行SDS電泳分析,發(fā)現(xiàn)至后酵60天,混菌釀造腐乳中蛋白質分子量主要集中在7.8kDa以下,而單菌釀造腐乳樣品中物質在分子量0~22.0kDa之間均有存在。說明混菌釀造腐乳較單菌釀造腐乳的蛋白質降解得更快,這是混菌釀造腐乳質地口感更細膩的主要原因。對后酵9周的腐乳的