第六節蛋白質的三維結構

蛋白質分子的多肽鏈按一定方式折疊、盤繞或組裝成特有的空間結構，亦稱高級結構。蛋白質的高級結構即蛋白質的構象。

構象是指相同構型的化合物中，與碳原子相連的各原子或取代基團在單鍵旋轉時形成的相對空間排布。構象的改變不需要共價鍵的斷裂和重新形成，只需單鍵的旋轉即可形成新的構象。酰胺平面與α-碳原子的二面角（φ和ψ）

二面角

兩相鄰酰胺平面之間，能以共同的Cα為定點而旋轉，繞Cα-N鍵旋轉的角度稱φ角，繞C-Cα鍵旋轉的角度稱ψ角。φ和ψ稱作二面角，亦稱構象角。肽鏈的主鏈可看成是由被Ca隔開的許多平面組成的。N端C端RHHOCCaNCaCRONOCNCaCRONCaHHHHCaH事實上，一個天然蛋白質多態鏈在一定條件下只有一種或很少幾種構象，而且相當穩定。維持蛋白質分子構象的作用力

離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用力一、蛋白質的二級結構

（一）二級結構的概念蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象

。主要的化學鍵：

氫鍵

1.

a-螺旋(a-helix)

2.

b-折疊(b-pleatedsheet)

3.

b-轉角(b-turn)

4.無規卷曲(nonregularcoil)（二）二級結構單元的種類1）絕大多數天然蛋白質都是右手螺旋。2）每隔3.6個氨基酸殘基螺旋上升一圈；每圈間距0.54nm，即每個氨基酸殘基沿螺旋中心軸上升0.15nm，旋轉100°。α-螺旋結構的主要特點：1.α-螺旋(α-helix)3）每個氨基酸殘基的N-H都與前面（C端）第四個殘基C=O形成氫鍵。

4)螺旋體中所有氨基酸殘基側鏈都伸向外側；鏈中的全部C=O和N-H幾乎都平行于螺旋軸,氫鍵幾乎平行于中心軸;

*R為Gly時，由于Ca上有2個氫，使Ca-C、Ca-N的轉動的自由度很大，即剛性很小，所以使螺旋的穩定性大大降低。R基大(如Ile)也不易形成α-螺旋。*α-螺旋遇到Pro就會被中斷而拐彎，因為脯氨酸是亞氨基酸且有剛性的環狀結構。*帶相同電荷的氨基酸殘基連續出現在肽鏈上時，螺旋的穩定性降低。側鏈在a-螺旋結構的影響：*R基較小,且不帶電荷的氨基酸利于α-螺旋的形成,如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發卷曲成α-螺旋。2.β-折疊(β-pleatedsheet)

β-折疊是由兩條或多條伸展的多肽鏈靠氫鍵聯結而成的鋸齒狀片狀結構。①在

-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距為0.35nm。0.7nm

②-折疊結構的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內氫鍵的交聯，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。（a）平行式（b）反平行式③

-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。后者更為穩定。3.β-轉角（β-turn）

也稱β-回折，存在于球狀蛋白中。其特點是肽鏈回折180°，使得氨基酸殘基的C=O與第四個殘基的N-H形成氫鍵。第二個氨基酸通常是pro。

β-轉角都在蛋白質分子的表面，多數為親水氨基酸組成。4.無規則卷曲（non-regularcoil）

又稱自由卷曲，是指沒有一定規律的松散肽鏈結構，但是其結構是明確而穩定的，常常構成酶的功能部位。

無規卷曲常出現在a-螺旋與a-螺旋、a-螺旋與β-折疊、β-折疊與β-折疊之間。它是形成蛋白質三級結構所必需的。二、蛋白質的超二級結構

（一）超二級結構的概念指蛋白質中相鄰的二級結構單位(即單個-螺旋或-轉角)組合在一起，形成有規則的在空間上能辯認的二級結構組合體?！锍壗Y構在結構層次上高于二級結構，但沒有聚集成具有功能的結構域。：由兩股或三股右手螺旋繚繞而成的左手螺旋：由兩股折疊片，中間加入螺旋而形成的片層結構：由三條或更多的反平行式-鏈通過-轉角或其它的肽段連接而成的結構（二）超二級結構的基本形式超二級結構類型βββααβαβ12345

指多肽鏈在二級結構或超二級結構的基礎上形成三級結構的局部折疊區，它是相對獨立的緊密球狀實體，稱為結構域（domain）。

酵母己糖激酶的三級結構結構域之間有一段柔性的肽鏈相連—鉸鏈區，使結構域之間可以發生相對移動；結構域承擔一定的生物學功能，幾個結構域協同作用可體現出蛋白質的總體功能；結構域間的裂縫常為酶的活性部位，也是反應物的出入口。三、蛋白質的結構域α+β結構域乳酸脫氫酶結構域1α/β結構域

丙酮酸激酶結構域43-P-甘油醛脫氫酶結構域2木瓜蛋白酶結構域1木瓜蛋白酶結構域2無規則卷曲+α-螺旋結構域無規則卷曲+β-回折結構域

三級結構（tertiarystructure）：指的是多肽鏈在二級結構、超二級結構和結構域的基礎上，主鏈構象和側鏈構象相互作用，進一步盤曲折疊形成球狀分子結構。四、蛋白質的三級結構

（一）三級結構的概念（二）球狀蛋白的三級的結構特征含有多種二級結構單元。分子表面往往有一個內陷的空隙，它常常是蛋白質的活性中心。

大多數非極性側鏈埋在分子內部，形成疏水核；而極性側鏈在分子表面，形成親水面。

蛋白質的三級結構具有明顯的折疊層次。

分子呈現球狀或橢圓狀。（三）維持三級結構的作用力二硫鍵

——共價鍵

疏水作用非共價鍵（次級鍵）氫鍵離子鍵范德華力四級結構（quaternarystructure）：由兩條或兩條以上具有三級結構的多肽鏈聚合而成、有特定三維結構的蛋白質構象。每條多肽鏈又稱為亞基(subunit)

。五、蛋白質的四級結構

例如，血紅蛋白的四級結構（一）四級結構的概念（二）蛋白質四級結構的特點1）有多個亞基2）穩定性主要靠亞基間的疏水作用維持3）亞基單獨存在時無生物活性或活性很小，只有通過亞基相互聚合成四級結構后，蛋白質才具有完整的生物活性。4）亞基見具有協同性和別構效應。蛋白質的空間結構

二級結構超二級結構結構域三級結構四級結構六、蛋白質三維結構與功能的關系（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結構Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合，Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。（二）血紅蛋白的構象變化與結合氧肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線1.協同效應(cooperativity)一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象，稱為協同效應。如果是促進作用則稱為正協同效應(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協同效應

(negativecooperativity)O2血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。變構效應(allostericeffect)蛋白質空間結構的改變伴隨其功能的變化，稱為變構效應。2.波爾效應（Bohr）1904年，ChristianBohr發現：增加CO2濃度、降低pH能顯著降低血紅蛋白與O2的結合。？生理意義：波爾效應使血紅蛋白運輸O2的效率提高。2，3—二磷酸甘油酸（BPG）通過與血紅蛋白的兩個β亞基形成鹽鍵穩定了血紅蛋白的脫氧態構象，因而降低了血紅蛋白的氧親合力。3.BPG的別構效應（三）蛋白質構象改變與疾病蛋白質構象疾病：若蛋白質的折疊發生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發生。蛋白質構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。瘋牛病中的蛋白質構象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第七節蛋白質的理化性質與分離純化一、蛋白質的理化性質（一）蛋白質的兩性電離蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。*蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。在等電點時蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。蛋白質的等離子點（特征常數）：指在純水中（即沒有其它鹽類存在）蛋白質的正離子數等于負離子數的pH值。因蛋白質的等電點不是一成不變的，它隨溶劑性質、離子強變等因素而改變。二、蛋白質的膠體性質由于蛋白質分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的顆粒，因而具有膠體溶液的特征（布郎運動、丁道爾現象、不能透過半透膜）。1.蛋白質膠體穩定的因素①可溶性蛋白質分子表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質顆粒表面形成水化層，其可防止分子互碰而聚集；②蛋白質在非等電點狀態時帶同種電荷，在顆粒表面形成電荷層，同性電荷互斥，使分子不能聚集。+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化層++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用

蛋白質的聚沉蛋白質膠體溶液沉淀作用示意圖

2.蛋白質的沉淀作用

如果加入適當的試劑使蛋白質分子處于等電點狀態或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質膠體溶液就不再穩定并將產生沉淀。沉淀方法類別:①高濃度中性鹽（鹽析）②等電點沉淀③有機溶劑沉淀④重金屬鹽類沉淀⑤生物堿試劑和某些酸類沉淀⑥加熱變性沉淀

鹽析(saltprecipitation)是將高濃度硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等中性鹽加入蛋白質溶液，使蛋白質表面水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。*分段鹽析：調節鹽濃度，可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分段析出。例如：血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。3.沉淀類型A.可逆沉淀

在發生沉淀反應時，蛋白質雖已沉淀析出，但它的分子內部、空間結構并未發生顯著變化，基本上保持原有的性質，沉淀因素除去后，能再溶于水溶液中。這種作用稱為可逆沉淀反應。如大多數蛋白質的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質以及利用等電點的沉淀，提純蛋白質時，常利用此類反應。B.不可逆沉淀/變性沉淀在發生沉淀反應時，蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞，失去原來的天然性質，這時蛋白質已發生變性。這種變性蛋白質的沉淀不能再溶解于原來溶劑或水溶液中的作用稱為不可逆沉淀反應或變性沉淀。重金屬鹽、生物堿試劑，強酸、強堿、加熱、震蕩、超聲波、有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉淀反應。

蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩定的條件仍然存在而并不析出，例如：在強酸堿中變性的蛋白質在強酸堿溶液中仍存在電荷效應，所以不表現為沉淀現象。相對地，沉淀的蛋白質也未必都已變性。*蛋白質的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。

（三）蛋白質的變性與復性蛋白質在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。1.蛋白質變性的概念2.變性的本質——破壞非共價鍵，不改變蛋白質的一級結構。3.變性的因素

加熱、有機溶劑、強酸、強堿、表面活性劑（如十二烷基硫酸鈉即SDS）、還原性試劑（尿素、鹽酸胍）、紫外線、機械力等。

4.變性蛋白質性質的改變

①生物學功能的喪失（主要標志）；

②分子形狀改變，肽鏈松散，反應基團增加，易被酶消化；

③疏水基團外露，水化層被破壞，溶解度降低，易形成沉淀析出，粘性增加，紫外吸收改變等；

④喪失結晶能力。應用舉例臨床醫學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。

5.蛋白質的復性若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，可緩慢地重新自發折疊成原來的構象，恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation)，這種變性也稱為可逆變性?？赡孀冃宰饔玫鞍踪|復性（尿素、β-巰基乙醇）（去除尿素、β-巰基乙醇）非折疊狀態，無活性天然狀態，有催化活性（四）蛋白質的分子大小蛋白質是分子量很大的生物分子，相對分子質量大于6000，最高可達40000000（煙草花葉病毒）。目前常用的方法包括：擴散系數、沉降超離心、凝膠過濾、滲透壓、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。1.根據化學成分測定最小相對分子質量

利用化學分析定量測定蛋白質中某一特殊元素的含量，并假定蛋白質分子中含1個這種元素，即可測算最低Mr。如：用化學分析法測定血紅蛋白質中含Fe0.34％，則最低Mr=55.84×100/0.34=16700；用其它方法測定，其實際Mr為16700的4倍，由此可知，血紅蛋白含有4個Fe的原子，而不是1個Fe。2.

超離心法在60000～80000r/min的高速離心力作用下，蛋白質分子會沿旋轉中心向外周方向移動。超離心法最為準確，但需昂貴的超速離心機。用光學方法測定界面移動的速度即為蛋白質的離心沉降速度。蛋白質的沉降速度與分子大小和形狀有關，因為沉降系數S大體上和分子量成正比關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子量，但對分子形狀高度不對稱的大多數纖維狀蛋白質不適用。離心機結構示意圖轉頭轉頭腔沉降樣品驅動馬達真空冷凍沉降系數是溶質顆粒在單位離心場中的沉降速度，用S表示。一個S單位，為1×10-13秒。相對分子質量越大，S值越大。蛋白質的沉降系數：1～200S。超速離心法既可以用來測定蛋白質的分子量也可以用作分離純化蛋白質。

s=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉子角速度（弧度/s）x=蛋白質界面中點與轉子中心的距離（cm）由沉降系數S可根據斯維得貝格〔Svedberg〕方程計算蛋白質分子的相對分子質量：M=RST/D〔1－iρ〕R：氣體常數T：絕對溫度D：擴散系數ρ：溶劑的密度3.凝膠過濾法凝膠過濾所用介質為凝膠珠，其內部為多孔網狀結構。一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外。洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積??；小分子在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大。測定蛋白質分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex洗脫體積：自加入樣品開始到該組分的洗脫峰峰頂（即收集液中該組分濃度最大時）出現時所流出的洗脫液體積。測定樣品蛋白質分子量的方法：

①測得幾種標準蛋白質的洗脫體積〔Ve〕；

②以相對分子質量對數（logM）對Ve作圖，得標準曲線；

③再測出未知樣品洗脫體積〔Ve〕；

④從標準曲線上可查出樣品蛋白質的相對分子質量。4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠：單體—丙烯酰胺（acrylamide,簡稱Acr）和交聯劑—N,N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,簡稱Bis）在加速劑和催化劑的作用下聚合而成的高分子物質，具有三維網狀結構和分子篩性質。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,簡稱PAGE）。SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑普通蛋白質電泳的泳動速率取決于荷質比（凈電荷、大小、形狀）★此方法只能測得亞基肽鏈的相對分子質量方法：①用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質變性（肽鏈伸展）并與SDS結合，形成SDS-蛋白質復合物，使得不同蛋白質分子均帶負電（SDS帶負電），且荷質比相同（蛋白質分子大，結合SDS多；分子小，結合SDS少）；不同蛋白質分子具有相似的構象。②用幾種標準蛋白質相對分子質量的對數值對它們的遷移率作圖③測出待測樣品的遷移率④從標準曲線上查出樣品的相對分子質量二、蛋白質的分離純化蛋白質分離純化的一般原則提純的目標：盡量提高蛋白質的純度或比活性，設法除去變性的和不需要的蛋白質，盡可能提高蛋白質的產量。根據蛋白質的性質加以選擇，如分子大小，溶解度、電荷、吸附性質及生物親和力等。一般程序：

1、從組織細胞中溶解放出蛋白質，并保持天然狀態，常用低溫