胰島素樣生長(zhǎng)因子i受體抑制劑osi-906體外抗細(xì)粒棘球絳蟲原頭作用研究

cyheecec癥也被稱為cyheec癥。這是一種古老的人獸共同病，已經(jīng)成為世界公共衛(wèi)生的一個(gè)重要問題。包蟲病主要有4種,其中95%為細(xì)粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)感染所致的囊型包蟲病(cystisechinococcosis,CE)。CE呈世界性分布,我國(guó)是CE高發(fā)國(guó)之一。手術(shù)切除病灶為包蟲病臨床治療的主要手段,但是當(dāng)囊腫較大或者靠近肝門等血管時(shí)容易發(fā)生原頭節(jié)外溢,造成術(shù)后復(fù)發(fā),因此術(shù)前或術(shù)后藥物輔助治療就尤為重要。然而經(jīng)典藥物阿苯達(dá)唑片劑或脂質(zhì)體藥物因腸道吸收差,血藥、肝藥濃度較低等缺陷而療效欠佳。因此,尋找新的抗CE藥物具有重要意義。OSI-906是OSI藥物公司研發(fā)的一種胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(IGF-ⅠR)抑制劑,目前正作為一種抗癌劑進(jìn)行Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)。該化合物可高度選擇并且有效抑制配體依賴的IGF-ⅠR和ⅠR的自身磷酸化,繼而抑制下游信號(hào)通路成員(如AKT、ERK1/2)的激活從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Zheng等發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球絳蟲中存在胰島素信號(hào)通路成員,但尚不清楚OSI-906等胰島素信號(hào)通路受體抑制劑是否具有抗包蟲作用。本研究用不同濃度的IGF-ⅠR抑制劑OSI-906體外干預(yù)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴,觀察OSI-906對(duì)其生長(zhǎng)的影響,以期用于CE的治療。材料和方法1材料表面1.1樣品1.2dmso和伊紅OSI-906購(gòu)自上海瀚香生物科技有限公司,批號(hào):2014022808;DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;伊紅購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;胎牛血清,青鏈霉素和RDMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。1.3渦流振蕩儀和ms3cdsa3-meloCO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;JA1203型電子天平購(gòu)自德國(guó)賽多利斯股份公司;MS3digital渦旋振蕩儀購(gòu)自德國(guó)IKA公司;DMI4000B倒置熒光顯微鏡、LKB-Nova型超薄切片機(jī)均購(gòu)自德國(guó)Leical公司;JEM-1230透射電子顯微鏡購(gòu)自日本JEOL公司。2方法2.1原65%以上拒染物的測(cè)定用75%酒精消毒感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊肝臟表面,無菌條件下抽取肝包囊內(nèi)囊液并移入無菌瓶中,待原頭節(jié)自然下沉后棄去上清,用PBS(pH7.2)清洗頭節(jié)3~5次,用伊紅染色法檢測(cè)原蚴95%以上拒染。將原頭節(jié)加入細(xì)胞培養(yǎng)基(RDMI1640︰胎牛血清︰青、鏈霉素=89︰10︰1)中于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2.3原頭節(jié)和空白組、溶劑組pbs液、空白組選擇OSI-906100、25和3.125μmol/L濃度組作用4d的原頭節(jié)以及空白組、溶劑組的原頭節(jié),PBS液清洗3次,每次5min;用4%戊二醛固定24h,1%鋨酸固定1h,經(jīng)丙酮酸梯度脫水、EPON812包埋后切片,于銅網(wǎng)上用醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色,透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)變化并拍照記錄。2.4統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用計(jì)量資料隨機(jī)區(qū)組方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1增加原頭節(jié)鈣顆粒OSI-906體外作用1d后,倒置熒光顯微鏡下觀察OSI-906各濃度組細(xì)粒棘球蚴頭節(jié)頂突部分外凸,其中高濃度組(100μmol/L)可見蟲體團(tuán)縮。2d后高濃度組原頭節(jié)鈣顆粒明顯減少,其體積更小。4d后空白對(duì)照組和DMSO組頭節(jié)呈內(nèi)陷型,蟲體體積較大,偶可見原頭節(jié)伸縮活動(dòng)(圖1A和圖1B),伊紅染色均不著色,OSI-906低濃度(50μmol/L)組大部分原頭節(jié)著色(圖1C),高濃度組蟲體嚴(yán)重固縮,體積明顯縮小,部分蟲體發(fā)生解離,未解離蟲體伊紅染色均著色(圖1D)。2空白對(duì)照組osi-906不同作用時(shí)間原頭存活率根據(jù)蟲體計(jì)數(shù)計(jì)算原頭節(jié)活力,結(jié)果見圖2。其中培養(yǎng)第1d空白對(duì)照組和DMSO組活力分別為(92.52±1.36)%和(91.87±1.86)%。1d后各用藥組原頭節(jié)活力均顯著下降,其中100和50μmol/L組不同作用時(shí)間原頭蚴存活率與空白對(duì)照組和溶劑組(DMSO)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.586,P<0.05);其余濃度組間比較原頭蚴存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.953,P>0.05)。培養(yǎng)至第3d時(shí)100μmol/L的OSI-906組原頭節(jié)存活率為(42.38±1.05)%,至第4d時(shí)OSI-906100μmol/L組原頭節(jié)均死亡,25μmol/L組原頭蚴存活率為39.17%,空白對(duì)照組原頭蚴存活率為87.91%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.861,P<0.05)。OSI-906對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴半數(shù)致死濃度(LC50)為26.55μmol/L。3干預(yù)材料的確定透過電鏡觀察正常原頭節(jié)(圖3A)和DMSO組原頭節(jié)(圖3B)角質(zhì)層及生發(fā)層結(jié)構(gòu)清晰可辨,細(xì)胞規(guī)整,微毛排列整齊,皮層細(xì)胞核大且圓,核仁清晰,肌纖維細(xì)胞束結(jié)構(gòu)清晰可辨;OSI-90625μmol/L濃度組干預(yù)4d的原頭節(jié)角質(zhì)層變薄、消失,微毛消失,皮層區(qū)變薄,出現(xiàn)大小不等的空泡,細(xì)胞極少,核形不規(guī)則,核內(nèi)異染色質(zhì)增多,呈粗大團(tuán)塊狀邊集(圖3C)。OSI-906100μmol/L濃度組干預(yù)4d的原頭節(jié)角質(zhì)層與生發(fā)層紋理嚴(yán)重破壞,皮層區(qū)微毛完全消失,細(xì)胞崩解,核膜破損,核仁散開,呈現(xiàn)團(tuán)縮凋亡征象,偶可見破碎的裸核細(xì)胞(圖3D)。osi-906抑制其他配體的誘導(dǎo)表達(dá)OSI-906是OSIPharmaceuticals公司在先導(dǎo)化合物的基礎(chǔ)上,通過混合基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的咪唑并吡嗪類化合物(屬于一類新穎的小分子IGF-ⅠR抑制劑),其抗腫瘤功效十分顯著。目前,OSI-906已用于局部晚期或轉(zhuǎn)移性腎上腺皮質(zhì)癌的臨床Ⅲ期試驗(yàn),同時(shí)與紫衫醇聯(lián)合應(yīng)用于復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌的臨床I/Ⅱ期試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球絳蟲中存在胰島素信號(hào)通路成員,那么開展對(duì)該信號(hào)通路抑制劑的相關(guān)研究就有了更重要和可靠的理論依據(jù)。作為一種多細(xì)胞生物,細(xì)粒棘球蚴也通過胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。其下游的ERK信號(hào)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生物活性的調(diào)節(jié),是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)的傳遞者,因此該通路成為多種疾病研究的重點(diǎn)。對(duì)腫瘤的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),OSI-906抑制腫瘤的生長(zhǎng)主要通過高效抑制配體依賴的IGF-ⅠR和ⅠR自身磷酸化從而破壞配體誘導(dǎo)的下游通路AKT和(或)ERK1/2的激活,最終抑制腫瘤的增殖與擴(kuò)散。Fox等發(fā)現(xiàn)OSI-906通過阻斷MAPK和PI3K/Akt兩條通路選擇性抑制IGF-ⅠR的自身磷酸化從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。鑒于IGF-ⅠR抑制劑對(duì)多種腫瘤的良好治療效果,本研究選擇OSI-906進(jìn)行體外抗細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴作用觀察,結(jié)果顯示OSI-906100μmol/L和50μmol/L組不同作用時(shí)間原頭蚴存活率與空白對(duì)照組和溶劑組(DMSO)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。作用第4d后OSI-906高劑量組(100μmol/L)原頭節(jié)全部死亡,抗原頭節(jié)作用顯著。本實(shí)驗(yàn)觀察到OSI-906干預(yù)后的原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)和類型與文獻(xiàn)[9,10]報(bào)道的原頭蚴超微結(jié)構(gòu)基本一致,但高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等細(xì)胞器少見,這可能與OSI-906抑制配體依賴的IGF-ⅠR和ⅠR自身磷酸化破壞了配體誘導(dǎo)的下游通路AKT和(或)ERK1/2的激活最終導(dǎo)致糖原獲取失敗有關(guān),但尚無充分證據(jù)證實(shí),有待繼續(xù)研究。感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊肝臟取自新疆華凌屠宰場(chǎng)。2.2藥物干預(yù)對(duì)osi-906濃度的影響細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)培養(yǎng)3~5d后,進(jìn)行藥物干預(yù)。將含有原頭節(jié)的培養(yǎng)液加入到96孔板中,每孔約200個(gè)原頭節(jié)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)8個(gè)組,每組平行做3份,分別為:空白對(duì)照組(加入200μlRDMI