肺動脈高壓分子機制的研究進展

低氧對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內

鈣離子濃度的影響及機制

Recentadvanceinmolecularmechanismofpulmonaryarterialhypertension

RoleofhypoxiaonintracellularCa2+concentrationinpulmonaryarterysmoothmusclecells(PASMCs)

JianWang(王健)JohnsHopkinsUniversity廣州醫學院

肺動脈高壓分子機制的研究進展

低氧對大鼠遠端肺動脈平滑肌前言(Introduction)我國40歲以上人群COPD總患病率高達8.2%，大部分患者最終經慢性低氧性肺動脈高壓（chronichypoxicpulmonaryhypertension,CHPH）而發展成為慢性肺源性心臟病。兩個環節:肺血管急性低氧性收縮反應和慢性低氧性肺血管結構重建是CHPH發生的主要機制。前言(Introduction)我國40歲以上人群COP前言(Introduction)急性低氧導致包括大鼠、豬、狗、綿羊、雪貂、牛等多種動物肺動脈的強烈收縮，慢性低氧引起包括人類、大鼠及綿羊肺動脈的結構重建。細胞內Ca2+濃度（[Ca2+]i）在引起肌細胞的收縮和增殖的復雜機制中起至關重要的作用。

前言(Introduction)急性低氧導致包括大鼠、豬VDCCROCCCa2+Ca2+Ca2+SOCCIP3RCa2+Ca2+ATPCa2+ATPCa2+Na+DAGOAGCPATGIP3Ca2+STIMSOCEVDCCROCCCa2+Ca2+Ca2+SOCCIP3RCa前言(Introduction)Storeoperatedcalciumchannel(SOCC)主要由經典型瞬時受體電位（TRPC）蛋白家族成員組成,TRPC家族包括TRPC-1至TRPC-7。SOCE和TRPC蛋白在肺動脈平滑肌[Ca2+]i調節中發揮重要作用。前言(Introduction)Storeoperat前言急性低氧性肺動脈收縮時[Ca2+]i的增加部分是由于SOCE通過由TRPC組成的SOCC而造成。慢性低氧大鼠肺動脈平滑肌[Ca2+]i和SOCE增加，TRPC蛋白參與慢性低氧誘導的肺動脈平滑肌[Ca2+]i升高。前言急性低氧性肺動脈收縮時[Ca2+]i的增加部分是由于SOCHPH急性低氧SOCE[Ca2+]i血管收縮？？PA肺循環外周阻力TRPCCa2+內流[Ca2+]i血管重塑慢性低氧？？PA？CHPH急性低氧SOCE[Ca2+]i血管收縮？？PA肺循環研究目的(Aims)

以大鼠遠端肺動脈平滑肌、遠端PASMCs及CHPH大鼠模型為研究對象，深入探討性低氧對大鼠遠PASMC[Ca2+]i的影響及機制。研究目的(Aims)以大鼠遠端肺動脈平滑肌、遠端PA急性低氧對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內鈣濃度的影響

Effectofacutehypoxiaoncalciumsinglinginpulmonaryarterialsmoothmusclecells急性低氧對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內鈣濃度的影響

Eff方法(Methods)酶消化法原代培養大鼠遠端PASMCs形態學、免疫學及功能鑒定PASMCs細胞內鈣濃度檢測系統觀測急性低氧(4%O2)對大鼠遠端PASMC[Ca2+]i的影響方法(Methods)酶消化法原代培養大鼠遠端PASMCsPhasecontrastmicroscopyofdistalPASMCsculturedfor3-6days.Cellsshowedspindle-shapedmorphology.Smoothmusclespecifica-actinantibodyidentifieda-actin(showninred)in>95%culturedcells.ThenuclearmarkerYO-PRO-1isshowningreen.ImmunocytochemistryRatDistalPASMCsMorphologyPhasecontrastmicroscopyofd高鉀KRBS溶液對大鼠遠端PASMC[Ca2+]i的影響及5μM硝苯地平的干預作用

-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedAB＊§-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedAB-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed-500501001502000510152025Time(min)Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedcontrolKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+Nifed050100150200250Δ[Ca2+]i(nM)controlKCLKCL+NifedcontrolKCLKCL+NifedAB＊§A：時間曲線，B：峰值。control組n=5,細胞數=138；KCL組n=6，細胞數=171；KCL+Nifed組n=5，細胞數=145。＊：P＜0.01vscontrol；§：P＜0.01vsKCL。高鉀KRBS溶液對大鼠遠端PASMC[Ca2+]i的影響及急性低氧對大鼠遠端PASMC[Ca2+]i的影響

4%O216%O2-200204060800102030timeΔ[Ca2+]i(nM)A0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊B4%O216%O2-200204060800102030timeΔ[Ca2+]i(nM)4%O216%O24%O216%O24%O216%O2-20020406080-200204060800102030timeΔ[Ca2+]i(nM)A0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊BA0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊0204060801004%O216%O2Δ[Ca2+]i(nM)＊＊BA：時間曲線，B：峰值。4％O2組n=8，細胞數=166；16％O2組n=6，細胞數=133，＊：P＜0.001。急性低氧對大鼠遠端PASMC[Ca2+]i的影響4%O21小結1(Summary1)原代培養PASMCs是研究低氧造成肺動脈病理生理及病理改變的首要前提。在低氧及各種血管活性物質刺激下，肺動脈發生的血管收縮反應和結構重建主要定位于肺內遠端肺動脈(肺內4級分支以下的肺動脈)。培養細胞呈長梭形，表現典型的血管平滑肌細胞生長特點，即“峰谷”狀生長。60mM高鉀溶液使培養的PASMC[Ca2+]i增高，5μM硝苯地平能完全阻斷此反應，說明培養的PASMC表達具有完好功能的VDCC通道。小結1(Summary1)原代培養PASMCs是研究低小結2Ca2+是重要的第二信使，調節細胞的許多生理過程，也包括肺血管平滑肌的急性收縮反應和慢性增殖過程。無論外部各種因素調控肺血管平滑肌細胞收縮和增殖的機制如何復雜，最后都歸結于各種因素對于肺血管平滑肌細胞[Ca2+]i的影響。小結2Ca2+是重要的第二信使，調節細胞的許多生理過程，也小結3急性低氧能使大鼠、羊、貓、人等肺動脈平滑肌細胞的[Ca2+]i升高。我們發現：急性低氧也能使大鼠遠端PASMC[Ca2+]i升高，提示急性低氧可能通過升高[Ca2+]i參與肺動脈平滑肌的急性低氧性收縮反應。小結3急性低氧能使大鼠、羊、貓、人等肺動脈平滑肌細胞的[C小結急性低氧[Ca2+]i小結急性低氧[Ca2+]i二.急性低氧對大鼠遠端肺脈平滑肌細胞內鈣濃度影響的機制二.急性低氧對大鼠遠端肺脈平滑肌細胞內鈣濃度影響的機制方法PASMCPA正常SOCE的檢測急性低氧對SOCE的影響TRPC表達硝苯地平對急性低氧誘導PASMC[Ca2+]i升高的干預恢復細胞外鈣錳熒光焠滅SOCC拮抗劑干預熒光定量PCRWestern-blot[Ca2+]i檢測系統方法PASMCPA正常SOCE的檢測急性低氧對SOCE的5μM硝苯地平對急性低氧誘導大鼠遠端PASMC[Ca2+]i升高的影響

A：時間曲線，B：峰值。4％O2組n=7，細胞數=146；4％O2+Nifed組n=6，細胞數=128，＊：P＜0.0010204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊AB-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)4%O24%O2+Nifed0204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊AB0204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊0204060801000204060801004%O24%O2+NifedΔ[Ca2+]i(nM)＊AB-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)4%O24%O2+Nifed-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)-200204060800102030time(min)Δ[Ca2+]i(nM)4%O24%O2+Nifed4%O24%O2+Nifed4%O24%O2+Nifed結果(Results)5μM硝苯地平對急性低氧誘導大鼠遠端PASMC[Ca2+]大鼠遠端肺動脈平滑肌組織及培養的PASMC’sTRPC的mRNA表達的PCR結果

大鼠遠端肺動脈平滑肌組織及培養的PASMC’sTRPC的大鼠遠端肺動脈平滑肌組織及培養的PASMC的TRPC1、TRPC4和TRPC6的Western結果

大鼠遠端肺動脈平滑肌組織及培養的PASMC的TRPC1、TR恢復細胞外鈣法檢測大鼠遠端PASMC’sSOCE

A：時間曲線，B：峰值。Nifed+CPA組n=8，細胞數=239；Nifed組n=6，細胞數=168，＊：P＜0.001

SOCE恢復細胞外鈣法檢測大鼠遠端PASMC’sSOCEA：時間錳熒光焠滅法檢測大鼠遠端PASMC’sSOCE

A：時間曲線，B：峰值。+CPA組n=7，細胞數=177；-CPA組n=5，細胞數=137，＊：P＜0.001。錳熒光焠滅法檢測大鼠遠端PASMC’sSOCEA：時間曲恢復細胞外鈣法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠遠端PASMC’sSOCE的影響

恢復細胞外鈣法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠錳熒光焠滅法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠遠端PASMC’sSOCE的影響

錳熒光焠滅法觀測SKF-96365和NiCl2

分別對大鼠遠SKF,Ni2+andLa3+對高鉀KRBS溶液誘導大鼠遠端PASMC[Ca2+]i升高的影響

SKF,Ni2+andLa3+對高鉀KRBS溶液誘導大急性低氧對大鼠遠端PASMC’SOCE的影響

急性低氧對大鼠遠端PASMC’SOCE的影響不存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠端PASMC錳熒光焠滅的影響

A：時間曲線，B：峰值。16％O2（noMn2+）組n=5，細胞數=141；16％O2組n=5，細胞數=114，與16％O2（noMn2+

）組比較P＞0.4；4％O2組n=5，細胞數=136，與16％O2組比較P＜0.001。607080901001100510F/F0at360nM(%)4%O216%O216%O2(noMn2+)Time(min)Nifed+0Ca2+Mn2+(200μM)0-10-20-30-4016%O216%O24%O2Mn2+＊F/F0at360nM(%)AB607080901001100510F/F0at360nM(%)4%O216%O216%O2(noMn2+)4%O216%O216%O2(noMn2+)Time(min)Nifed+0Ca2+Nifed+0Ca2+Mn2+(200μM)Mn2+(200μM)0-10-20-30-4016%O216%O24%O2Mn2+＊0-10-20-30-4016%O216%O24%O2Mn2+＊F/F0at360nM(%)AB不存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠端PASMC錳熒光焠滅存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠端PASMC錳熒光焠滅的影響

A：時間曲線，B：峰值。16％O2組n=5，細胞數=119；4％O2組n=5，細胞數=112，＊：P＜0.001-30-40-50-60-7016%O24%O2F/F0at360nM(%)＊B405060708090100110051016%O24%O2F/F0at360nM(%)Mn2+(200μM)Nifed+CPA+0Ca2+A-30-40-50-60-7016%O24%O2-30-40-50-60-7016%O24%O2F/F0at360nM(%)＊B405060708090100110051016%O24%O216%O24%O2F/F0at360nM(%)Mn2+(200μM)Mn2+(200μM)Nifed+CPA+0Ca2+A存在CPA的情況下，急性低氧對大鼠遠端PASMC錳熒光焠滅的SKF-96365和NiCl2分別對急性低氧誘導的大鼠遠端PASMC’s

SOCE的影響

SKF-96365和NiCl2分別對急性低氧誘導的大鼠遠端急性低氧使大鼠遠端PASMC[Ca2+]i升高，而VDCC拮抗劑硝苯地平只能部分抑制急性低氧引起的PASMC[Ca2+]i升高,提示急性低氧通過激活大鼠遠端PASMC的VDCC和另外的非VDCC依賴的通道導致Ca2+內流，進而引起[Ca2+]i升高。SOCE在調解細胞內鈣平衡發揮重要作用,廣泛存在于星形膠質細胞、氣道平滑肌細胞、心肌細胞、主動脈平滑肌細胞、肺動脈平滑肌細胞及肺動脈內皮細胞等。

小結1急性低氧使大鼠遠端PASMC[Ca2+]i升高，而VDCC拮我們運用恢復細胞外鈣法和錳熒光焠滅法,發現CPA能使PASMCs中的[Ca2+]i迅速顯著升高，錳熒光焠滅增強，且能被SOCC拮抗劑顯著抑制，表明大鼠遠端PASMC存在SOCE。TRPC蛋白參與組成SOCC，大鼠遠端肺靜脈平滑肌主要表達TRPC-1、TRPC-4和TRPC-6，且尤其以TRPC-1和TRPC-6的蛋白表達最強。小結2我們運用恢復細胞外鈣法和錳熒光焠滅法,發現CPA能使PASM用含有CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，急性低氧不僅能顯著增加由恢復細胞外鈣所引起的[Ca2+]i升高，而且能顯著增加錳熒光焠滅。以上兩種反應均能被SOCC拮抗劑阻斷。急性低氧通過增強由SOCC介導的SOCE，進而引起PASMC的[Ca2+]i升高。小結3用含有CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，急性低氧不用不含CPA但含硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，常氧時，錳熒光焠滅與細胞的熒光自發衰減量沒有差異，而在急性低氧時，錳熒光焠滅顯著增加，且此反應能被SOCC拮抗劑顯著抑制，表明急性低氧能夠誘發SOCE。急性低氧時用含有CPA和硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMC，錳熒光焠滅顯著增加，且能被SOCC拮抗劑顯著抑制，表明急性低氧能夠放大由CPA誘導的SOCE。急性低氧的這些作用可能由于低氧加速了Ca2+從肌漿網清空，也可能是由于低氧增強了與肌漿網鈣耗竭信號耦聯的SOCC的活性。小結4用不含CPA但含硝苯地平的無鈣溶液孵育PASMCs，常氧時，小結TRPC-1TRPC-4TRPC-6SOCE急性低氧[Ca2+]iSOCE小結TRPC-1TRPC-4TRPC-6SOCE急性低氧[C三.慢性低氧對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內鈣濃度的影響三.慢性低氧對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內鈣濃度的影響方法常壓持續低氧（10%O2）21天的方法建立CHPH大鼠模型，觀測MPAP、RVSP、RV/(LV+S)及肺血管形態學改變。分離正常大鼠和CHPH大鼠的遠端PASMCs，細胞內鈣濃度檢測系統檢測正常大鼠和CHPH大鼠PASMCs[Ca2+]i。方法常壓持續低氧（10%O2）21天的方法建立CHPH大鼠模結果n=6，*:P﹤0.01MPAP（mmHg）PVSP（mmHg）RV/(LV+S)正常組10.8±0.6325.3±1.020.27±0.01低氧組26.5±0.84*54.6±1.87*0.56±0.04*慢性持續低氧對大鼠MPAP、RVSP及RV/(LV+S)的影響結果n=6，*:P﹤0.01MPAP（mmHg）PVSP（m慢性低氧對大鼠肺內血管結構重建的影響

A:低氧組，B:常氧組慢性低氧對大鼠肺內血管結構重建的影響A:低氧組，B:常慢性低氧對大鼠遠端PASMC[Ca2+]i的影響

常氧組n=5，細胞數=112，低氧組n=5，細胞數=104，＊：P＜0.001

050100150200NormoxiaHypoxiaBasic[Ca2+]i(nM)＊050100150200NormoxiaHypoxiaBasic[Ca2+]i(nM)＊慢性低氧對大鼠遠端PASMC[Ca2+]i的影響常氧組n=討論本實驗以10%O2飼養大鼠3周，低氧大鼠MPAP﹑RVSP及RV/(LV+S)較正常大鼠明顯增高，肺內血管較正常大鼠明顯增厚，提示慢性低氧通過直接或間接作用導致肺血管重構，肺動脈壓升高，右心室肥大。常壓持續低氧能很好復制CHPH模型。慢性低氧能使大鼠遠端PASMCs中[Ca2+]i的升高，提示慢性低氧誘導的[Ca2+]i升高參與慢性肺血管結構重建。討論本實驗以10%O2飼養大鼠3周，低氧大鼠MPAP﹑RVS小結慢性低氧[Ca2+]iCHPH小結慢性低氧[Ca2+]iCHPH四.慢性低氧對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內鈣濃度影響的機制四.慢性低氧對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內鈣濃度影響的機制方法10%O2或常氧3周PAPASMCTRPC表達熒光定量PCRWestern-blotCPA誘導OAG誘導恢復細胞外鈣錳熒光焠滅[Ca2+]i檢測系統方法10%O2或常氧3周PAPASMCTRPC表達熒光定結果TRPCgene&proteinexpression結果TRPCgene&proteinexpressi慢性低氧對CPA誘導的大鼠遠端PASMC[Ca2+]i變化的影響

慢性低氧對CPA誘導的大鼠遠端PASMC[Ca2+]i變慢性低氧對CPA誘導的大鼠遠端PASMC錳熒光焠滅的影響

BasalMn2+quenching(Ca2+entry)inPASMCs慢性低氧對CPA誘導的大鼠遠端PASMC錳熒光焠滅的影響B討論慢性