第五章中藥指紋圖譜第五章中藥指紋圖譜1本章學習要求★掌握中藥指紋圖譜分析及評價▲熟悉中藥指紋圖譜研究程序及技術要求●了解中藥指紋圖譜測定方法本章學習要求★掌握中藥指紋圖譜分析及評價2淫羊藿HPLC圖譜

12批次淫羊藿HPLC的指紋圖譜及其共有模式

淫羊藿HPLC圖譜12批次淫羊藿HPLC的指紋圖譜及其共3

淫羊藿對照指紋圖譜淫羊藿對照指紋圖譜4第一節概述定義:中藥指紋圖譜是指中藥經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥特性的共有峰的圖譜，是一種新的中藥質量控制模式。中藥指紋圖譜的基本屬性：整體性和模糊性。整體性：強調多個成分（共有指紋峰）的相對穩定的比例、排列順序及相互的牽制，反映的質量信息是綜合的。模糊性：中藥化學成分復雜性+次生代謝產物化學成分不確定性，具有無法精密度量的模糊性。第一節概述定義:中藥指紋圖譜是指中藥經適5指紋圖譜分析：強調準確的辨認，而不是精密的計算。圖譜比較：強調的是相似性，而不是相同。特點：(1)通過指紋圖譜的特征性，能有效鑒別中藥的真偽。(2)通過指紋圖譜主要特征峰的面積和比例的制定，能有效控制中藥質量，保證中藥質量的相對穩定。指紋圖譜分析：強調準確的辨認，而不是精密的計算。6中藥指紋圖譜的研究成為當前我國中藥基礎研究的重要領域與熱點，研究側重于:

⑴中藥指紋圖譜的理論探討；

⑵測試指紋圖譜的規范化試驗；

⑶構建指紋圖譜的方法學研究；⑷指紋圖譜信息化和知識化研究；

⑸指紋圖譜在提高中藥質控指標方面的研究；

⑹指紋圖譜指導中藥材規范化生產方面的研究；⑺指紋圖譜在開發中藥資源方面的研究；

⑻指紋圖譜用于研制中藥新藥等方面的研究。

中藥指紋圖譜的研究成為當前我國中藥基礎研究的重7一、指紋圖譜的產生與發展

(一)指紋圖譜的產生指紋(fingerprint)概念起源于法醫學，依據每個人的指紋結構上細微處的絕對差別可以鑒識區分不同的人。法醫學的指紋分析強調的是個體的絕對唯一性(absoluteuniqueness)。近代指紋分析的概念結合生物技術的發展延伸到ＤＮＡ指紋圖譜分析，而且應用范圍從犯罪學擴大到醫學和生命科學的領域。生物樣品的ＤＮＡ指紋圖譜分析強調個體的唯一性，側重于整個物種的唯一性。一、指紋圖譜的產生與發展(一)指紋圖譜的產生8中藥指紋圖譜分析借用法醫學“指紋鑒定”的概念，但又不同于常規意義的“指紋”含義。根據中藥化學成分的復雜性（或模糊性）和有效成分的整體性，在現階段還不可能將中藥復雜化學成分搞清楚的情況下，運用多學科交叉綜合技術手段，進行計算機輔助分析檢測和評價，尋找同一藥材群體化學成分的相似性，即物種群體內的唯一性。通過建立中藥指紋圖譜，可以全面反映中藥所含內在化學成分的種類和數量，進而反映中藥的質量。中藥指紋圖譜分析借用法醫學“指紋鑒定”的9

中藥指紋圖譜是以各種波譜、色譜等技術為依托，是一種綜合的、可量化的鑒別中藥的手段，是當前評價中藥真實性、穩定性和一致性的質量控制模式之一。建立的中藥指紋圖譜應滿足專屬性、重現性和實用性的技術要求。中藥指紋圖譜是以各種波譜、色譜等技術為依101.指紋圖譜的發展階段：

初級階段:

是確立指紋圖譜的建立方法及相似度判定。研究重點主要是測定方法的建立，方法穩定性和適用性考察，化學有效部分基礎研究，圖譜多指標控制等，力求基本說清中藥化學基礎及質量控制參數，將中藥質量控制提到整體量化的高度。(二)指紋圖譜的發展現狀1.指紋圖譜的發展階段：(二)指紋圖譜的發展現狀11高級階段:

即指紋圖譜特征和藥效相關性研

究，指紋圖譜的生物等效性研究。中藥指紋圖譜的研究向多學科的相互滲透、從單指標向多指標（多維多息）的綜合發展，最終建立體現譜效關系的指紋圖譜，確保中藥安全、有效和可控。高級階段:即指紋圖譜特征和藥效相關性研12國內，目前還處在初級階段。1.針對中藥注射劑這一相對簡單的體系，進行大量研究和深入探討。2.利用指紋圖譜手段表征中藥注射劑的特性，表達成品的質量，以達到控制工藝操作和原藥材的目的，利用指紋圖譜追尋工藝操作中的問題和實現對原藥材GAP的質量要求。3.通過對大量注射劑的指紋圖譜研究，建立系統的測定方法和全面的指標控制參數，尋找一定的數學模型，最終達到指紋圖譜的可操作，可控，穩定，顯性和量化的目的，提高整個中藥注射劑的質量控制水平。4.逐步建立其它類中藥制劑，中藥復方制劑的指紋圖譜。國內，目前還處在初級階段。13

在國外，指紋圖譜在ＦＤＡ植物藥產品工業指南（2000年草案稿）、ＷＨＯ草藥評價指南（1996年）以及英國草藥典（1986）、印度草藥典（1998）、美國草藥典（1999-2001，Monographs）中均將其列入。目的是解決多數草藥有效成分不明，市場商品無法有效鑒別真偽和控制質量的問題。要求草藥制劑生產商提供半成品的指紋圖譜以保證品種的真實性和產品的指紋圖譜以證明其批間產品質量的一致和穩定。在國外，指紋圖譜在ＦＤＡ植物藥產品工業指南14

2.指紋圖譜的分類指紋圖譜可按應用對象、測定手段進行不同的分類。⑴按應用對象分類：①中藥材(原料藥材)指紋圖譜②中藥原料藥(包括飲片、配伍顆粒)指紋圖譜③中藥中間體（工藝生產過程中間產物）指紋圖譜④中藥制劑指紋圖譜2.指紋圖譜的分類指紋圖譜可按應用對象、測定手段進行不同15按測定方法分類:

①中藥化學指紋圖譜指紋圖譜系指采用色譜、光譜和其他分析方法建立的用以表征中藥化學成分的特征的指紋圖譜。中藥化學指紋圖譜對控制中藥質量具有更直接、更重要的意義。色譜指紋圖譜：TLC、GC、GC-MS、HPLC、HPLC-MS等光譜指紋圖譜：UV、IR、FP、NMR、MS等按測定方法分類:16②中藥生物指紋圖譜包括：中藥材DNA指紋圖譜中藥基因組學指紋圖譜中藥蛋白組學指紋圖譜中藥材DNA指紋圖譜主要是測定各種中藥材的DNA圖譜，由于每個物種基因的唯一性和遺傳性，中藥材DNA指紋圖譜可用于對中藥材的種屬鑒定、植物分類研究和品質研究。它對中藥材GAP基地建設、中藥材種植規范(SOP)、選擇優良種質資源和藥材道地性研究極為有用。②中藥生物指紋圖譜17中藥基因組學圖譜和中藥蛋白組學指紋圖譜系指用中藥作用于某特定細胞或動物后，引起的基因和蛋白的復雜的變化情況，這兩種指紋圖譜可稱為生物活性指紋圖譜。中藥蛋白組學指紋圖譜是指紋圖譜研究的最高級階段，可確定中藥的主要活性物質。中藥基因組學圖譜和中藥蛋白組學指紋圖譜系指用中藥作用于某特定18第二節中藥指紋圖譜測定方法

一、色譜法色譜技術具有極強的分離能力和極大的適應性，中藥指紋圖譜首推色譜法，其常用的方法有：TLC、GC、HPLC、HPCE、SFC等。第二節中藥指紋圖譜測定方法一、色譜法191.薄層色譜(TLC)：可離線、展開劑靈活多選、色譜后衍生TLC獨具的優勢是提供直觀形象的可見光或熒光圖像，較柱色譜多了色彩這一可比“參數”，并可進一步配合色譜掃描或數碼處理得到不同層次輪廓圖譜和相應的積分數據。用固定波長對薄層展開的各斑點進行掃描得到掃描圖譜，比目測的薄層圖譜更為客觀準確，還可計算各峰的峰面積與標準峰的比作量化指標，具有指紋意義。現代薄層色譜技術：如高效薄層色譜（HPTLC）、TLC-GC、TLC-IR1.薄層色譜(TLC)：可離線、展開劑靈活多選、色譜后衍生T20中藥指紋圖譜-課件21中藥指紋圖譜-課件22

2.氣相色譜(GC)：外界影響因素較少，穩定性較好，檢測設備可選性較大。適用于含揮發性成分中藥的指紋圖譜的研究和應用。新技術：如毛細管氣相色譜（CGC）、氣相色譜—質譜聯用（GC-MS）、氣相色譜—傅里葉變換紅外光譜聯用（GC-FTIR）等，其中最引人注目是裂解氣相色譜（用于不能直接使用GC分析的樣品）。2.氣相色譜(GC)：23

3.高效液相色譜(HPLC)：穩定性和重現性好、流動相選擇性廣、檢測器種類多、色譜柱可反復使用等特點，樣品適用范圍廣。目前已成為構建中藥指紋圖譜最主要和常用的方法。3.高效液相色譜(HPLC)：24

新的高效通用檢測器的發展，如二極管陣列檢測器（DAD）、蒸發光散射檢測器（ELSD）、電噴霧電離-質譜（ESI-MS）、質譜-質譜（MS-MS）等設備的引入，使得HPLC適用性與分辨率顯著提高，從而使復雜樣品的分析成為可能，還可對主要色譜峰進行歸屬。

新的高效通用檢測器的發展，如二極管陣列25注射用雙黃連指紋圖譜注射用雙黃連指紋圖譜26相關性相關性27

4.高效毛細管電泳（HPCE）適用于大部分化學成分，特別是生物大分子肽和蛋白的分離，能實現大小分子(如蛋白質和氨基酸)同時分析，得到的指紋圖譜能更多的反映中藥的成分特性，如動物類中藥的指紋圖譜研究。4.高效毛細管電泳（HPCE）28中藥指紋圖譜研究中最常用的兩種模式：毛細管凝膠電泳(CGE)、膠束電動毛細管色譜(MECC)。重現性可通過采用淌度比法、對照品校正法、保留指數法等加以提高。中藥指紋圖譜研究中最常用的兩種模式：毛細管凝膠電泳(CGE)29二、光譜法

光譜法是指用一定波長的光照射或掃描中藥樣品，取得特定的圖譜和數據。其主要方法有：UV、IR、FS、NMR、MS、AAS等。二、光譜法光譜法是指用一定波長的光照射或掃描中藥樣30

1.紫外-可見光譜法（UV-VIS）指紋圖譜的構建：是多種成分特征吸收光譜疊加而成的復合譜。在一定條件下，中藥多成分的復雜組合也有一定規律性，從而在紫外疊加光譜上顯示出一定的特異性和穩定性。光譜特征分析：最大吸收波長、最小吸收波長、肩峰、吸收系數、吸收度比值、吸收峰的數目、峰形、峰高等。如果中藥親緣相近而紫外光譜不易區別，可采用多階導數光譜法提高分辨率。1.紫外-可見光譜法（UV-VIS）31

2.紅外光譜（IR）指紋圖譜的構建：是多種成分在紅外光區域內(4000~400cm-1)總體官能團吸收的疊加。圖譜分析：主要著眼于所測得的紅外光譜的輪廓特征（全譜圖形）的比較，不用將各主要吸收峰歸宿，只要在所掃描的波數范圍內比較吸收峰的波數、同一波數吸收峰的形狀和強度、“指紋區”面貌等方面的差異即可。新技術：如傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、二維相關紅外光譜（2DFTIR）、近紅外光譜（NIR）、傅里葉變換拉曼光譜（FT-Raman）等。2.紅外光譜（IR）32

3.核磁共振波譜法（NMR）在規范的提取分離條件下，植物類中藥的1H-NMR圖譜與植物品種間存在著嚴格的對應關系。可通過對1H-NMR指紋圖上顯示特征共振信號(如化學位移、峰面積、耦合關系等)的分析，來建立中藥的1H-NMR指紋圖譜。3.核磁共振波譜法（NMR）33

4.質譜法（MS）質譜是按照帶電粒子（即離子）的質量對電荷的比值（m/z）和其相對豐度大小依次排列形成的圖譜。中藥特征提取物置質譜儀中進行電子轟擊裂解為不同的碎片，獲得提取物中化學成分的MS圖，不同中藥所含化學成分的種類及組成比例的不同，所得質譜圖顯示的分子離子峰及進一步裂解的碎片離子峰（m/z）亦不一致，故質譜具指紋性較強的特征，可用于中藥指紋圖譜的測定。4.質譜法（MS）34三、聯用技術中藥復方制劑成分復雜采用聯用技術建立多維多息特征譜，可較好地解決如何體現中藥復方制劑的整體性和復雜性的問題。所謂多維，即采用多種分析儀器聯用的方式來測定指紋圖譜，各譜圖間相互補充，可對復雜供試品有更清晰完整的認識。常用的是HPLC或CE／DAD／MS-MS)，所得的多維指紋圖譜包括色譜峰圖，UV圖；一級質譜圖(各個成分的質量)和二極質譜圖(某成分的特征碎片)。（可得到更多的化學結構信息）三、聯用技術中藥復方制劑成分復雜采用聯用技術建立多維多息特征35所謂多息，即指中藥復方制劑的特征譜，包括化學和藥效兩方面的信息。藥效信息即化學成分和藥效相關性，是通過確定中藥復方制劑中的各有效部位(藥效實驗肯定的化學部分)和其所含的有效成分(各種化合物)間量的比例，從這些比例變化來推算藥物的量效關系。多維多息特征譜的建立既能較系統、較完整地解決中藥復方制劑面臨的保證藥效和質量的問題，又為中藥研究中缺乏標準物質的問題提供了一種新的解決途徑。所謂多息，即指中藥復方制劑的特征譜，包括化學和藥效兩方面的信36第三節中藥指紋圖譜研究程序及技術要求一、指紋圖譜的要求（三性要求）中藥指紋圖譜應滿足特征性(專屬性或唯一性)、重現性和可操作性的要求。第三節中藥指紋圖譜研究程序及技術要求一、指紋圖譜的要求（37首先具備專屬性或唯一性。能夠表達某品種特征的性質。在滿足專屬性前提下要有較好的重現性，指同一品種的同一樣品，同一操作條件下，結果的重現性要好，即不同實驗室和不同操作者得到的色譜整體特征應有較高的相似度(0.9以上)。具有可操作性。指針對不同用途，選用不同分析方法來達到不同的要求，選擇的方法和試驗條件應便于推廣和便于操作，要有普遍適用性。首先具備專屬性或唯一性。能夠表達某品種特征的性質。38當一張指紋圖譜不足以表現其全部特征，可用幾張指紋圖譜來表現某種中藥(藥材或復方)的各個不同側面的特征，從而構成其全貌。對每一張圖譜都應有其特征性。當一張指紋圖譜不足以表現其全部特征，可39指紋圖譜II(203nm)指紋圖譜I(280nm)丹參滴丸多元HPLC指紋圖譜指紋圖譜II(203nm)指紋圖譜I(280nm)丹參滴40中藥未知檢品

圖譜測試、分析品質評價方法檢驗評價標準計算機信息處理圖譜評價不同品種來源、產地、采收期或加工炮制的中藥藥效學試驗中藥指紋圖譜確定圖譜參數選擇測試條件方法建立及考察10批次以上中藥樣品固定品種來源、產地、采收期和加工炮制的中藥

代表性均一性預處理供試品溶液預處理圖譜信息圖譜分析相關性二、指紋圖譜的研究程序圖5-1中藥指紋圖譜的構建程序示意圖中藥未知檢品圖譜測試、分析方法檢驗評價41⑴樣品收集：要求有一定的數量，以保證供試品的代表性和均一性⑵方法建立：指選取適當的方法建立指紋圖譜并進行考察⑶數據分析：對研究過程中所獲得數據進行處理，找出共性和不同點，確定評價指標⑷樣品評價：指按所確定指標對樣品進行品質評價⑸方法檢驗：是指在方法確立后的一段長時間內對更多未知樣品進行檢驗，進一步考察方法的可行性和實用性。⑴樣品收集：要求有一定的數量，以保證供試品的代表性和均一性42

（一）樣品收集樣品收集是研究指紋圖譜最初也是最關鍵的步驟，收集的樣品要有足夠的代表性。要求收集10批次以上的樣品。樣品數越多越好，使得到的指紋圖譜更具生物統計學意義。（一）樣品收集43注意：收集藥材樣品“批次”，其含義與工業產品“批次”的含義是完全不同的，它是指相互獨立的樣品，即不能將同一地點或同一渠道同一時間獲得的樣品分成若干批次樣品。不同產地或同一產地不同等級規格的樣品，均可視作不同批次。同一產地的樣品，存在不同的種植園和地塊之差異，也均可視作不同批次。注意：收集藥材樣品“批次”，其含義與工業產品“批次”的含義是44

1．樣品收集的基本要求（1）藥材樣品首先要經品種鑒定，中藥材及其飲片或炮制品，應符合國家藥典、部頒標準、地方標準或飲片炮制規范的規定。樣品應選用正品優質道地中藥材，或選用規范化栽培基地生產的中藥材。中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）1．樣品收集的基本要求中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求45(2)動、植物藥材樣品均應固定品種、藥用部位、產地、采收期、產地加工和炮制方法，礦物藥材樣品應固定產地和炮制、加工方法。對于多品種來源或多藥用部位的中藥材，應固定單一品種或單一藥用部位，同時要進行不同品種來源或不同藥用部位的代表性樣品指紋圖譜分析比較，找出各品種或各藥用部位之間指紋圖譜的共性和特性，采用其共性指紋標定該種藥材的質量，特征指紋標定藥材的品種或藥用部位和該品種或藥用部位藥材的質量。通常固定一個產地或一個采收季節，如固定多個產地或多個采收季節，必須考察不同產地或不同采收季節的代表性樣品指紋圖譜的一致性。中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）(2)動、植物藥材樣品均應固定品種、藥用部位、產地、46(3)樣品應保證其真實性，應有完整采樣原始記錄，內容包括：①藥材名稱：藥材名及其基源（原植、動物的科名、中文名、拉丁學名及藥用部位，或礦物的類、族、礦石名及主要成分）②樣品來源：真實記錄樣品來自何處，傳統產地收集或是資源豐富的產地收集，或者來自GAP基地供應；還是產地購買、市場購買或委托購買等，以便于生產原料的采購選擇和測試數據的可追溯。③收集時間及收集人：樣品收集時間及收集人姓名。④貨源情況調查：貨源是否充足和穩定等。中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）(3)樣品應保證其真實性，應有完整采樣原始記錄，內容包括：中47

⑤基源鑒定及鑒定人：產地或GAP基地收集的藥材結合植物形態鑒定品種。如缺原植物，由熟練的專業人員憑性狀或顯微特征鑒別。商品混亂的品種產區的選擇應縮小范圍，并結合資源選用藥典收載品種中的一種。復方制劑中的君藥及處方量大的藥材必需重點注意品種的鑒定，以避免今后執行指紋圖譜過程中出現難以預料的困難。中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）⑤基源鑒定及鑒定人：產地或GAP基地收集的藥材結合植物形48

⑥質量評估：為了便于對色譜的正確分析，減少試驗結果的判斷誤差，首先藥材需符合藥典或部頒標準規定，并詳細記錄。所有藥材樣品均須編號，必要時附藥材外形照片。

⑦樣品的留樣、貯藏和標簽：由于指紋圖譜研究周期較長，樣品必須在干燥、低溫、避光處貯藏，標簽必須有編號，收集樣品的編號應與貯藏樣品、試驗樣品的編號一致。留樣數量應不少于試驗實際用量的3倍。以保證試驗結果有異議時的可追溯。中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）⑥質量評估：為了便于對色譜的正確分析，減少試驗結果的判斷49（二）供試品溶液制備

根據中藥中所含化學成分的理化性質和檢測方法的要求，選擇適宜的制備方法。制備方法必須確保中藥中的主要化學成分或有效成分在指紋圖譜中得以體現。

（二）供試品溶液制備根據中藥中所含化學成分的50

1.原藥材、飲片或提取物供試品溶液的制備建立原藥材指紋圖譜的主要目的:⑴考察原藥材本身的質量情況；⑵以原藥材的指紋圖譜為參比，提取物及制劑的指紋圖譜與之比較，以考察制劑與原藥材的相關性。中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）1.原藥材、飲片或提取物供試品溶液的制備中藥注射劑51

2.半成品(中間體)供試品溶液的制備根據提取物或中間體中所含化學成分的理化性質和檢測方法的要求，參考制劑和相關產品制備工藝，選擇適宜的方法進行制備。中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）2.半成品(中間體)供試品溶液的制備中藥注射劑指紋52

3.各類制劑和相關產品供試品溶液的制備建立中藥成品指紋圖譜的目的是控制最終產品中的成分，使批與批之間能保持穩定和一致，確保成品的質量。可采用直接使用、稀釋或者溶劑提取的方式制備相應的供試品溶液。中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）3.各類制劑和相關產品供試品溶液的制備中藥注射劑指53(三)對照品(參照物)溶液制備建立指紋圖譜應設立參照物或參照峰。對照品作為參照物：常為供試品中主要成分內標物作為參照物穩定的指紋峰制備：根據檢測方法的需要，選擇適宜的方法進行。(三)對照品(參照物)溶液制備建立指紋圖譜54(四)指紋圖譜試驗研究

指紋圖譜試驗方法和試驗條件的優選，是通過比較試驗，從中選取相對簡單易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征的指紋圖譜，以滿足指紋圖譜的專屬性、重現性和可操作性的要求，并須經過方法學驗證。(四)指紋圖譜試驗研究指紋圖譜試55

首選色譜方法，其中HPLC法適用范圍廣，對含生物堿、蒽醌、黃酮、有機酸、酚類、木脂素等成分的中藥均可采用。提取條件、色譜條件需進行優化，使供試品中所含成分盡可能地被提取并獲得分離，即分得的色譜峰越多越好，使中藥的內在特性都顯現出來，為中藥指紋圖譜評價及其品質鑒定提供足夠的信息。首選色譜方法，其中HPLC法適用范圍56

(五)樣品測試及方法學驗證

中藥材樣品按優化的提取分離方法制備供試品溶液，在優化的色譜條件下進樣測試。為了驗證測試結果的可靠性，儀器精密度、供試品穩定性、實驗方法重復性必須經過嚴格的方法學驗證。(五)樣品測試及方法學驗證571.精密度試驗：主要考察儀器的精密度。取同一供試品溶液，連續進樣5次以上進行檢測，各共有峰峰面積比值的RSD＜3％，各共有峰的相對保留時間應在平均相對保留時間±1min內。或用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”計算，相似度應大于0.9。

1.精密度試驗：58

2.穩定性試驗：

主要考察供試品的穩定性。取同一供試品溶液，分別在不同時間（0、1、2、4、8、12、24、36、48h）檢測，考察色譜峰的相對保留時間、峰面積比值的一致性，確定檢測時間。或用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”計算，相似度應大于0.9。

2.穩定性試驗：59

3.重復性試驗：主要考察實驗方法的重復性。取同一批號的樣品5份以上，分別按照選定的提取分離方法制備供試品溶液，并在選定的色譜條件下進行檢測，各共有峰峰面積比值的RSD＜3％，各共有峰的相對保留時間應在平均相對保留時間±1min以內。或用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”計算，相似度應大于0.9。3.重復性試驗：60指紋圖譜的記錄時間：采用HPLC或GC法一般為60min。但實驗中，應記錄2小時的色譜圖，考察1小時以后的色譜峰情況，以確定記錄時間。指紋圖譜的記錄時間：采用HPLC或GC法一61六、指紋圖譜的建立和辨認

根據足夠樣品數（10批次以上）測試結果所給出的峰數、峰值（積分值）和峰位（保留時間）等相關參數，確定共有指紋峰（相對保留時間、峰面積比值），選取特征指紋峰群（色譜峰組合），制定指紋圖譜。采用阿拉伯數字標示共有峰，用“S”標示參照物峰。六、指紋圖譜的建立和辨認根據足夠樣品數（1062

中藥材指紋圖譜要對不同產地、不同等級規格或不同采收季節等的代表性樣品進行分析比較，從中歸納出中藥材共有的、峰面積相對穩定的色譜峰作為特征指紋峰。對于多來源的中藥材，必須考察品種間的特異性。

再將藥材、半成品、成品之間的圖譜進行比較。中藥材指紋圖譜要對不同產地、不同等級規格63指紋圖譜的辨認應注意指紋特征的整體性，從整體的角度綜合考慮，注意各具有指紋意義的譜峰之間相互的依存關系。指紋圖譜的評價指標是供試品指紋圖譜與該品種對照用指紋圖譜(共有模式)及供試品之間指紋圖譜的相似性。相似性比較可以用“相似度”表達，一般指紋圖譜相似度計算結果在0.9~1.0(或以90~100表示)之間即符合要求。指紋圖譜的辨認應注意指紋特征的整體性，從64

指紋圖譜的相似性從兩個方面考慮:①色譜的整體“面貌是否相似，以判斷樣品的真實性；②供試品與對照樣品或“對照用指紋圖譜”之間及不同批次樣品指紋圖譜之間總積分值作量化比較，如總積分面積相差較大(如±20%)，則說明同樣量的樣品含有的內在物質有較明顯的“量”的差異，這種差異是否允許，應視具體品種、具體工藝的實際情況，并結合含量測定項目綜合判斷。這種比較應在同一臺儀器平行進行測定。指紋圖譜的相似性從兩個方面考慮:65第四節中藥指紋圖譜分析及評價根據指紋圖譜所獲取的信息，建立指紋圖譜分析比較的重要參數，如共有峰、重疊率、n強峰、特征指紋等；計算特征指紋的相似率與差異率，進行指紋圖譜評價；應用主成分分析、聚類分析、人工神經網絡或相似度分析等計算機技術，進行解析、識別圖譜信息以及圖譜相似度評價，以建立可行、實用的HPLC指紋圖譜量化評價標準。第四節中藥指紋圖譜分析及評價根66一、重要參數的建立

1.共有指紋峰

中藥指紋圖譜中，多個樣品所具有的相同相對保留值的色譜峰，即為共有指紋峰。(1)指紋峰的相對保留時間：相對保留時間=tR/tRs。12345678910沒食子酸大黃素圖5-2大黃HPLC指紋圖譜一、重要參數的建立

1.共有指紋峰12345667(2)指紋峰面積比值：指紋峰面積比值=A/As

各共有指紋峰的面積比值必須相對固定。未達基線分離的共有峰，以該組峰的總峰面積計，同時標定該組各峰的相對保留時間。非供有峰：供試品的圖譜與指紋圖譜比較，共有指紋峰以外的相對保留值不同的色譜峰。(2)指紋峰面積比值：指紋峰面積比值=A/As682.重疊率

中藥供試品圖譜與指紋圖譜中的共有峰數乘以2，占有兩者色譜峰總數的百分率，稱為重疊率。其計算公式為：

重疊率反映指紋圖譜的相似程度，重疊率愈大，指紋圖譜愈相似。在實際工作中，應根據具體情況，給重疊率規定一個合理的區間范圍。重疊率是重要的定性依據，為中藥品種鑒定提供了可靠的證據。2.重疊率

中藥供試品圖譜與指紋圖譜中69

3.n強峰

n強峰應視實際的出峰情況、峰面積值而定。n值取決于：(1)

n強峰一般以總峰數的1/5~1/3為宜；

(2)n個強峰總峰面積之和應占整個峰面積之和70%以上。

⑶應注意n強峰中各色譜峰在中藥供試品中出現的頻次和所列的次序。

n強峰反映了中藥供試品中各主要成分的相對含量的情況，是評價中藥質量提供重要的信息和依據。3.n強峰704.特征指紋峰

所有供試品圖譜中均存在的色譜峰，可以認為它們是該中藥品種所特有，故又稱之為特征指紋峰。

特征指紋是指由一系列特征指紋峰所組成的固定峰群，從多組分的角度來反映中藥內在特征，為原藥材或飲片品種鑒定，特別是同屬不同種或含相同有效成分不同種的藥材的鑒別，提供更多更細致的信息和依據。4.特征指紋峰71二、特征指紋的相似率與差異率相似率與差異率是一個表示中藥供試品圖譜與指紋圖譜間相似程度的數值，它將定性信息與定量數據綜合于一體，作為最終鑒定的重要依據。

相似率是以特征指紋為基礎，求出中藥供試品圖譜與指紋圖譜之間的相似程度，通過它可顯示出兩者在特征指紋上的相似性。首先計算每個特征指紋峰間的相似率，其計算公式為：式中Ai供為供試品圖譜中某特征指紋峰峰面積值；Ai指為指紋圖譜中某特征指紋峰峰面積值；二、特征指紋的相似率與差異率相似率與差異率是72式中:n表示特征指紋峰的總數；Σ為求和符號。

特征指紋總相似率應等于或小于1，當相似率等于1時，表示兩者完全相同；當小于1時，則表示兩者的相似程度。若相似率大于1，則失去計算相似率的意義。然后對所有的特征指紋峰相似率求和計算特征指紋總相似率，其計算公式為：式中:n表示特征指紋峰的總數；然后對所有73

差異率是以供試品圖譜中每個特征指紋峰與其相應的指紋圖譜中特征指紋峰的峰面積值間的差與指紋圖譜中該特征指紋峰的峰面積值的比值，表示該特征指紋峰的差異程度。特征指紋總差異率是將每個特征指紋峰的差異率求和即得，顯示出兩者在特征指紋上的差異性。其計算公式為：差異率是以供試品圖譜中每個特征指紋峰與其相應的74第五節中藥指紋圖譜研究實例例1中藥大黃指紋圖譜研究(一)基源為蓼科植物掌葉大黃RheumPalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.exBalf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根及根莖。(二)產地掌葉大黃主產于甘肅、青海、西藏、四川等地；唐古特大黃主產于青海、甘肅、西藏及四川等地。二者商品均稱為“西大黃”、“北大黃”。藥用大黃主產于四川、貴州、云南、湖北、陜西等地，商品稱為“南大黃”、“川大黃”。商品以掌葉大黃產量大，唐古特大黃次之，藥用大黃少見。第五節中藥指紋圖譜研究實例例1中藥大黃指紋75據產地考察及調查，甘肅莊浪、禮縣大黃種植面積約6666.67km2，年產量約5萬噸，資源十分豐富。甘肅主產區大黃資源分布圖據產地考察及調查，甘肅莊浪、禮縣大黃種植面積76

(三)化學成分主含蒽醌類成分：大黃酸(rhein)、大黃素(emodin)、大黃酚(chrysophanol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、大黃素甲醚(physcion)、番瀉苷A、B、C、D、E、F(sennosideA、B、C、D、E、F)、大黃酸-8-葡萄糖苷(rhein-8-mono-β-D-glucoside)、大黃素甲醚葡萄糖苷(physcionmonoglucoside)、蘆薈大黃素葡萄糖苷(aloe-emodinmonoglucoside)、大黃素葡萄糖苷(emodinmonoglucoside)、大黃酚-1-葡萄糖苷(chrysophanol-1-monoglucoside)。還含苯丁酮苷類、鞣質及相關的多元酚類等成分。部分蒽醌及沒食子酸化學結構式如下：(三)化學成分77

R1R2大黃素－CH3－H大黃酚－CH3－OH蘆薈大黃素－CH2OH－H大黃酸－COOH－H大黃素甲醚－CH3－O－CH3

R178

10－10’番瀉葉苷AR=－COOHthreo番瀉葉苷BR=－COOHerythro番瀉葉苷CR=－CH2OHthreo番瀉葉苷DR=－CH2OHerythro沒食子酸

79

(四)實驗儀器和材料儀器:Agilent1100液相色譜儀，DAD檢測器；樣品:大黃采自甘肅省華亭、莊浪、禮縣、宕昌四縣，共15份樣品，采集時間為2001年11月，經品種鑒定為掌葉大黃。對照品:沒食子酸(gallicacid)、大黃素(emodin)均由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，純度分別為98.14%、99.02%。試劑:乙腈（美國Tedia公司，色譜純）、甲醇（上海化學試劑有限公司，分析純；Tedia公司，色譜純）、冰醋酸（南京化學試劑一廠，分析純）、重蒸去離子水（實驗室制備）。(四)實驗儀器和材料80(五)供試品溶液制備精密稱取大黃供試品粉末(過20目篩)2g，加入甲醇50ml，水浴(80℃)加熱回流1h，濾過。殘渣加甲醇50ml，水浴(80℃)加熱回流1h，濾過，合并兩次濾液。置蒸發皿中，水浴揮去部分溶劑，加甲醇溶解并定容至25ml。用微孔濾膜（孔徑為0.45μm）濾過，濾液作為供試品溶液。(六)參照物溶液制備精密稱取沒食子酸、大黃素對照品各5mg，用甲醇溶解并定容至25ml，配成0.2mg/ml的溶液，再將該溶液稀釋10倍，作為參照物溶液。(五)供試品溶液制備81

(七)色譜條件色譜柱:Inertsil?ODS-3分析柱(250mm

4.6mm，5μm)流動相:(A)1%HAc-H2O與(B)1%HAc-CH3CN梯度洗脫0—55minB（％）0→2555—75minB（％）25→5575—90minB（％）55→85流量:1.0ml/min柱溫:30℃檢測波長:280nm參比波長:380nm分析時間:90min(七)色譜條件82(八)方法學考察1.精密度試驗取同一批次供試品（9號樣品：莊浪大黃），連續進樣5次，考察色譜峰相似度的一致性，用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”計算，結果相似度大于0.9，表明儀器精密度良好。2.重復性試驗取同一批次樣品（9號樣品：莊浪大黃），按上法分別制備5份供試品，平行測定，考察色譜峰相似度的一致性，用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”計算，結果相似度大于0.9，表明實驗重復性良好。(八)方法學考察83

3.穩定性試驗取同一批次供試品溶液（9號樣品：莊浪大黃），分別在0，2，4，7，11，16，22，29，36h不同時間點進行檢測，用“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”計算，結果相似度大于0.9，表明供試品在36h內穩定。

(九)供試品溶液測定同一上述實驗條件，測定10批次供試品HPLC色譜圖。3.穩定性試驗84

(十)指紋圖譜及技術參數

1.指紋圖譜的建立根據10批次供試品溶液測定結果所給出的峰數、峰值（積分值）和峰位（相對保留時間）等相關參數，進行分析比較，制定優化大黃指紋圖譜。見圖5-2，彩圖5。(十)指紋圖譜及技術參數8512345678910沒食子酸大黃素圖5-2大黃HPLC指紋圖譜彩圖5大黃三維HPLC指紋圖譜12345678910沒食子酸大黃素圖5-2大黃HPL86

2.共有指紋峰的保留時間及峰面積大黃HPLC可分離出約90個色譜峰，經與參照物對照以及比較所有測定記錄的色譜圖，選取其中10個共有峰作為指紋圖譜的特征峰。其保留時間（min）、峰面積見下表：峰序號12345保留時間7.25

8.95

18.04

30.77

42.54

峰面積965.14207.61898.255824.058354.54峰序號678910保留時間51.6152.6553.0660.7176.44峰面積972.54201.89

2852.43

1336.58

229.68

2.共有指紋峰的保留時間及峰面積峰序號12345保留時間787

3.共有指紋峰標定根據10批次供試品溶液測定結果，標定共有指紋峰。大黃HPLC指紋圖譜中，共有指紋峰10個。與大黃素參照物S峰（10號峰）相比，其他9個共有指紋峰相對保留時間依次為：0.095(1)、0.117(2)、0.2369(3)、0.403(4)、0.557(5)、0.675(6)、0.689(7)、0.694(8)、0.794(9)。

4.共有指紋峰面積比4、5號共有指紋峰面積為共有指紋峰總峰面積的65%，規定4號峰相對峰面積比值為13.7360~25.5096。5號峰相對峰面積比值為19.7041~36.5933。3.共有指紋峰標定885.相似度評價

將測試數據導入中藥指紋圖譜相似度計算軟件，經選峰，設定匹配模板，將譜峰自動匹配；然后設定標準模板，進行譜峰差異性評價和整體相似性評價。掌葉大黃HPLC指紋譜共有模式如圖5-3；華亭、莊浪、禮縣、宕昌四地樣品的相似度較高，大多在0.85~0.95之間，說明四地大黃之間既有較好的相關性，又有區別。5.相似度評價89圖5-3掌葉大黃HPLC指紋譜共有模式圖圖5-3掌葉大黃HPLC指紋譜共有模式圖90主成分分析將色譜數據矩陣的奇異值分解為兩個正交矩陣（U，V）和對角矩陣（S）的乘積，即得3個數值的乘積，取其中2個數值作為投影圖的縱橫坐標。另一數值即為落在投影圖上的投影點。根據投影點位置的不同，可以判別圖譜中主成分變化的規律。在大黃15個樣本中可分為兩類，一類遠偏離主體，其余在主體范圍內（其中樣本13、樣本14為宕昌大黃，樣本11、樣本15為采收期2000年的樣品）。為進一步弄清它們之間的差別，將樣本1（華亭大黃）、樣本10、樣本11、樣本13、樣本14和樣本15抽出來直接觀察它們的指紋圖譜，結果示于單個的色譜圖中。從單個六圖中可以看出，它們的差別主要由保留時間約為42min（星號所注）的色譜峰的大小來決定，因為該峰占總峰面積比較大，對藥材提取物總量的影響較大即權重系數較大，故該峰的大小影響著整個藥材提取物的總量。主成分分析將色譜數據矩陣的奇異值分解為兩個正交矩陣（U，91從六張圖的比較可以看出該峰在樣本1、樣本14、樣本13、樣本10、樣本11和樣本15中逐漸增大，而最大的是樣本11和樣本15，可能是前一年的樣品經貯藏引起化學變化，由其它物質轉化而使該峰增大，使得樣本11和樣本15離主體范圍較遠；樣本14、樣本13中該峰大小雖和樣本1差不多，但由于其它成分濃度的影響，整體相似度與樣本1相差較大，使得樣本14和樣本13離主體范圍較遠；而樣本1和樣本10雖整體相似度接近，但保留時間約為42min的色譜峰大小有差異，因此在投影圖上有一定距離。值得提出的是，總量較低的樣本它在主成分投影圖中處于最左端，隨著在主成分投影圖中的樣本點從左往右移動時，整個色譜指紋圖譜中總峰面積也在不斷提高。從六張圖的比較可以看出該峰在樣本1、樣本14、樣本13、樣本92實例1鹽生肉蓯蓉種植基地藥材補腎助陽整體特征成分的指紋圖譜肉蓯蓉是我國傳統的名貴補益類中藥，在歷代補腎助陽方劑中出現的頻率最高。新疆是肉蓯蓉生長的重要產區之一，在新疆東部和北部主要產鹽生肉蓯蓉。苯乙醇苷類成分為肉蓯蓉屬植物中研究報道最多的一類化合物，在鹽生肉蓯蓉中也如此。藥理實驗已基本明確此類化合物是肉蓯蓉補腎助陽的主要活性成分。本實例采用RP-HPLC技術，設計了一份能全面反映鹽塵肉蓯蓉種植基地藥材補腎助陽整體特征成分的指紋圖譜，該指紋圖譜對肉蓯蓉中的苯乙醇苷類成分進行了較為精細的表達，解析和識別了多個色譜共有峰，在反映功能性和指示成分特性方面要高于普通的指紋圖譜，為藥材全面的質量控制和種植基地GAP生產提供了理論支持和實驗依據。項目符合中藥現代化發展的方向，具有積極的現實意義。實例1鹽生肉蓯蓉種植基地藥材補腎助陽整體特征成分的指紋圖931.補腎助陽功能整體特征成分的HPLC色譜表達與解讀1.1補腎助陽功能整體特征成分的指紋圖譜研究方法1.1.1檢測方法的確定本實例選擇HPLC-UV聯用技術作為種植基地藥材補腎助陽整體特征成分的指紋圖譜研究方法，主要是基于以下考慮：首先，HPLC具有分離效率高、分析速度快、重現性好等特點，能給出高分辨的輪廓圖譜，且由于是封閉的系統色譜，在線操作，受外界影響因素少，因此非常適合于構建中藥的指紋圖譜；其次，苯乙醇苷是肉蓯蓉補腎助陽的主要活性成分，此類成分苷元部分為苯乙醇類，與苷元相連中心葡萄糖的4位或6位連有苯丙烯酰基，2位偶有乙酰基相連，這些特征顯示其分子結構具有數個共軛體系，表明該類成分具有較強的紫外吸收，非常適用于紫外檢測器的檢測。1.補腎助陽功能整體特征成分的HPLC色譜表達與解讀941.1.2儀器與材料1.1.2.1儀器Waters2690高效液相色譜儀(帶自動進樣器)；Waters2487雙波長可見紫外檢測器；Millennium32色譜工作站美國(Waters公司)；HypersilODS-2色譜柱(4.6mmx250mm，5μm；大連依利特有限公司)，SymmetryShieldRPs色譜柱(4.6mmxl50mm，5μm；美國Waters公司)；BSll0S電子天平(德國Sartorius)；SB3200超聲振蕩儀(上海Branson)。1.1.2.2試藥與樣品1.1.2.2.1試藥1.1.2儀器與材料95色譜純甲醇和乙腈(Fisher公司)，重蒸水(樂百氏公司)，其它試劑均為分析純。對照品松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、2’-乙酰基毛蕊花糖苷、管花苷B均從鹽生肉蓯蓉中分離制備，UV、IR、EI-MS、IHNMR、13CNMR數據符合文獻值，含量經HPLC面積歸一化法測定純度大于97％。1.1.2.2.2樣品的采集與加工肉蓯蓉藥材來源見表3-1，所有藥材均經新疆中藥民族藥研究所李佳政研究員鑒定。將肉蓯蓉藥材洗凈，切成薄片，置陽光下曬干(約10天)，把曬干的藥材粉碎，過40目篩，置50℃烘箱干燥至恒重，作為待測樣品。色譜純甲醇和乙腈(Fisher公司)，重蒸水(樂百氏公司)，96表4肉蓯蓉藥材樣品Tab.4OriginofdiffrentspeciesofGenusCistanchesamples

編號 品名產地或收集地生長狀態采收日期1鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地未山土，栽培品2004-05C.salsa2鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛出土未開花，栽培品2004-05C.salsa3鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛出土未開花，栽培品2004-05C.salsa4鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛山土未開花，栽培品2004-05C.salsa5鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛山土未開花，栽培品2004-05表4肉蓯蓉藥材樣品976鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛山土未開花，栽培品2005-04C.salsa7鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛出土未開花，栽培品2005-04C.salsa8鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛山土未開花，栽培品2005-04C.salsa9鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛出土未開花，栽培品2005-04C.salsa10鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地未山土，栽培品2005-04C.salsa11鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地未山土，野生品2004-05C.salsa12鹽生肉蓯蓉吉木薩爾地區剛出土米開花，野生品2004-05C.salsa13鹽生肉蓯蓉吉木薩爾地區剛山土未開花，野生品2005-04C.salsa14鹽生肉蓯蓉吉木薩爾地區剛出土未開花，野生品2005-046鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基9815鹽生肉蓯蓉吉木薩爾地區未山土，野生品2005-04C.salsa16鹽生肉蓯蓉吉木薩爾地區未山土，栽培品2004-05C.salsa17鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地未山土，栽培品2005-04C.salsa18鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地未出土，栽培品2005-05C.salsa19鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地已開花，栽培品2004-05C.salsa20鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地已開花，栽培品2004-05C.salsa21鹽生肉從蓉吉木薩爾種植基地已開花，栽培品2005-04C.salsa22鹽生肉從蓉吉木薩爾種植基地已開花，栽培品2005-0415鹽生肉蓯蓉吉木薩爾地區9923鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地已開花，栽培品2005-04C.salsa24*鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛出土未開花，栽培品2005-04C.salsa25*鹽生肉從蓉吉木薩爾種植基地剛山土未開花，栽培品2005-04C.salsa26*鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種植基地剛出土未開花，栽培品2005-04

C.salsa27管花肉蓯蓉民豐種植基地通貨2005-04C.tubulosa28荒漠肉蓯蓉新疆精河地區飲片2004-05C.deserticola23鹽生肉蓯蓉吉木薩爾種100*24、25、26號樣品分別為同一植株的基部、中部和頂部。1.1.3實驗方法與結果1.1.3.1色譜條件色譜柱：HypersilODS-2柱(4.6mmx250mm，5pm)；流動相：乙腈-0.4％磷酸水溶液梯度洗脫；流速：0.75mL／min；柱溫：25℃；檢測波長：333nm。1.1.3.2對照品溶液的制備分別精密稱取松果菊苷、肉蓯蓉苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、2’-乙酰基毛蕊花糖苷、管花苷B對照品10.0、5.0、5.0、3.0、3.0、3.0mg，用80％甲醇定容于10mL容量瓶，搖勻，備用。1.1.3.3對照品標準圖譜的制定*24、25、26號樣品分別為同一植株的基部、中部和頂部。101分別量取6種對照品溶液各1.5mL，置量瓶中，混勻，進樣lOlaL，以指紋圖譜的色譜條件洗脫，得到對照品標準圖譜(圖3-1)，以此對指紋圖譜的色譜共有峰進行標識。1.1.3.4供試品溶液的制備精密稱取樣品0.3g，置25mL量瓶中，加80％甲醇約20mL浸泡1h，超聲提取20min，取出放冷，加80％甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，續濾液再經0.45gm濾膜濾過，即得。分別量取6種對照品溶液各1.5mL，置量瓶中，混勻，進樣lO102圖5-8對照品HPLC色譜圖Fig.3HPLCchromogramofreferencesubstances圖5-8對照品HPLC色譜圖1031.1.3.5相對保留時間和相對峰面積的計算供試品溶液進樣10gL，記錄色譜圖。以內標物毛蕊花糖苷(11號峰，S峰)的保留時間及峰面積為參照，計算各色譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積。1．1.3.6方法學考察1．1.3.6.1精密度試驗取同一份供試品溶液(3號)，連續進樣5次，記錄色譜圖，測得各共有峰的相對保留時間和單峰面積占總峰面積大于或等于5％的色譜峰相對峰面積比值基本一致，RSD均小于3％。表明精密度良好。1.1.3.5相對保留時間和相對峰面積的計算1041.1.3.6.2穩定性試驗取同一份供試品溶液(3號)，分別于0、2、4、8、16、24h進樣，結果各共有峰的相對保留時間和單峰面積占總峰面積大于或等于5％的色譜峰相對峰面積比值基本一致，RSD均小于3％。表明供試品溶液在24h內穩定。1.1.3.6.2穩定性試驗1051.1.3.6.3重現性試驗取同一批樣品藥材5份(3號)，按照供試品溶液的制備方法制備供試液，分別進樣，檢測色譜圖，結果各共有峰的相對保留時間和單峰面積占總峰面積大于或等于5％的色譜峰相對峰面積比值基本一致，RSD均小于3％。表明有較好的重現性。1.1.3.7樣品測定取肉蓯蓉樣品，按供試品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下，分別進樣101xL，采集80min的HPLC圖譜。以毛蕊花糖苷色譜峰(S峰)為基準，計算其它各峰相對保留時間和相對峰面積。1.1.3.6.3重現性試驗1061.2補腎助陽功能整體特征成分的指紋圖譜的建立與評價1.2.1特征峰的辯認比較了多批次鹽生肉蓯蓉樣品的色譜圖，其中19個色譜峰為各批次樣品所共有，因此標定它們為鹽生肉蓯蓉藥材的特征指紋峰。經與對照品標準圖譜比較，指認了其中的6個色譜峰，分別為松果菊苷(8號峰)、肉蓯蓉苷A(10號峰)、毛蕊花糖苷(11號峰)、異毛蕊花糖苷(13號峰)、2’-乙酰基毛蕊花糖苷(16號峰)、管花苷B(18號峰)。各特征峰峰號及保留時間見表3-3。1.2補腎助陽功能整體特征成分的指紋圖譜的建立與評價107表5鹽生肉蓯蓉HPLC指紋圖譜特征峰峰號及保留時間Tab.5RetentiontimeofcharacteristiccpeaksinHPLCfinlerorintofCsalsa

共有峰號保留時間/min共有峰號保留時間/min18.61147.4214.11248.4314.41353.2415.11454.4516.11559.0617.31665.5723.21771.9837.51873.6942.51977.51043.3表5鹽生肉蓯蓉HPLC指紋圖譜特征峰峰號及保留時間1081.2.2種植基地鹽生肉蓯蓉對照指紋圖譜的建立與技術參數傳統認為未開花的肉蓯蓉為上等藥材，開花結果后藥性下降，故民間有“3月4月采蓯蓉，7月8月莖中空”的說法。現代的質量分析報告也顯示，肉蓯蓉開花結果后苯乙醇苷的含量明顯下降。因此本研究選擇了種植基地有代表性的10個批次未開花的鹽生肉蓯蓉樣品(樣品號1～10)，按照“樣品測定”項下方法采集這10個批次樣品的HPLC圖譜，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，同時利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A版，國家藥典委員會)，以中位數法構建了種植基地鹽生肉蓯蓉藥材的對照指紋圖譜(圖3-2)。圖3-3為10批次藥材的HPLC指紋圖譜，圖3-4為10批次藥材指紋圖譜疊加圖。1.2.2種植基地鹽生肉蓯蓉對照指紋圖譜的建立與技術參數109中藥指紋圖譜-課件110中藥指紋圖譜-課件111中藥指紋圖譜-課件112圖410批次鹽生肉蓯蓉樣品（S1-S10）指紋圖譜

Fig4FingerprintsofC.salsafromdifferentsamples（S1-S10）圖410批次鹽生肉蓯蓉樣品（S1-S10）指紋圖譜

Fi113圖510批次鹽生肉蓯蓉樣品（S1-S10）指紋圖譜疊加圖Fig.5TheoverlappedfingerprintsofC.salsafromdifferentsamples（S1-S10）圖510批次鹽生肉蓯蓉樣品（S1-S10）指紋圖譜疊加圖114根據{中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》中有關注射劑用中藥材指紋圖譜技術要求，以內標物毛蕊花糖苷(11號峰，S峰)的保留時間及峰面積作為參照，計算各色譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積，規定鹽生肉蓯蓉指紋圖譜的技術參數如下：共有指紋峰峰號(相對保留時間)：1(0.198)、2(0.325)、3(0.334)、4(0.349)、5(0.37”、6(0.401)、7(0.535)、8(0.866)、9(0.983)、10(1.000)、11(1.094)、12(1.117)、13(1.230)、14(1.257)、15(1.364)、16(1.513)、17(1.66”、18(1.699)、19(1.790)；根據{中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》中有關注射劑115共有指紋峰峰號(相對峰面積)：1(0.011)、2(0.005)、3(0.006)、4(0.011)、5(0.014)、6(0.023)、7(0.021)、8(4.866)、9(0.053)、10(0.670)、11(1.000)、12(0.090)、13(0.085)、14(0.019)、15(0.169)、16(0.38”、17(0.028)、18(0.012)、19(0.013)；8(4.866)、10(0.670)、11(1.000)，其中8號峰和11號峰(S峰)的單峰面積約占總峰面積的60％和10％：利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A版，國家藥典委員會)，對指紋圖譜的相似度進行了評價分析，結果表明各批次樣品間具較高的相似性。共有指紋峰峰號(相對峰面積)：1(0.011)、2(0.00116

(一)儀器與試藥儀器:Agilent1100液相色譜儀，KQ-250型超聲波清洗器。樣品:通塞脈微丸(自制，批號為050820、051006、051016、051025、051106、051112、051120、051208、051216、051228,分別記為1、2、3、4、5、6、7、8、9和10)。對照品:綠原酸(chlorogenicacid)、阿魏酸(ferulicacid)、甘草苷(liquiritin)及肉桂酸(cinnamicacid),均由中國藥品生物制品檢定所提供，批號分別為110753-200212、0773-9910、111610-200604及0786-9801，甘草素對照品(自制，純度99.5%以上)，哈巴俄苷對照品(Chromadex.Inc.公司，批號08056)。試劑:乙腈（美國Tedia公司，色譜純），重蒸去離子水（實驗室制備）。其余試劑為分析純。例2通塞脈微丸HPLC-UV指紋圖譜研究(一)儀器與試藥例2通塞脈微丸HPLC-UV指117

(二)色譜條件和系統適用性試驗色譜柱:YMC-ParkODS柱(250mm

4.6mm，5μm)流動相:A(乙腈)與B(0.5%磷酸水)梯度洗脫0—10minB（％）90→8610—18minB（％）86→8418—30minB（％）8430—60minB（％）84→7060—75minB（％）70→4075—78minB（％）4078—82minB（％）40→30流量:1.0ml/min柱溫:30℃檢測波長:276nm進樣量:10μL理論塔板數按甘草苷峰計算不低于5000甘草苷與相鄰色譜峰的分離度大于1.5。(二)色譜條件和系統適用性試驗118

(三)供試品溶液制備取通塞脈微丸，混勻研細，取0.5g，精密稱定，置50ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，密塞，稱定重量，超聲30min，冷卻后稱重，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。(四)參照物溶液制備取甘草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每100μg/ml的對