三葉抗流感膠囊抗甲型h1n1流感病毒的研究

流行感染（感染）是流感病毒引起的呼吸道感染，通常急性發(fā)作和傳染性物質(zhì)。主要經(jīng)呼吸道飛沫迅速傳播,人群普遍易感,流感抗原容易變異,難于控制。臨床表現(xiàn)來看為發(fā)熱、全身乏力、鼻塞流鼻涕等癥狀。我國多見于18歲以下兒童及青少年,發(fā)達國家好發(fā)于青壯年。一葉抗流感膠囊是中藥組方,臨床主要用于治療流感,曾用名和劑型為金蒿抗流感滴丸,由新疆一枝蒿和貫葉金絲桃兩味傳統(tǒng)藥材經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的復方制劑,其中有效成分一枝蒿酮酸和金絲桃苷報道有利尿、咳嗽、解痙、降低血壓、降低膽固醇、鎮(zhèn)痛和保護心血管等作用。研究發(fā)現(xiàn)該方劑在體內(nèi)外均具有明顯的抗流感病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抑菌的作用。本研究體內(nèi)采用兩株甲型流感病毒(H1N1亞型FM1株和PR8株)感染小鼠造成病毒性肺炎模型,觀察一葉抗流感膠囊治療性給藥和預防性給藥對小鼠病毒性肺炎的抑制作用,觀察其對小鼠生存天數(shù)和死亡率的影響;體外CPE法觀察一葉抗流感膠囊對流感病毒FM1、PR8感染犬腎上皮細胞(MDCK)的作用。1材料表面1.1重41gICR小鼠(SPF/VAF級),體重(14±1)g,雌雄不限。由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物合格證SCXK(京)2006-0009。1.2病毒病控制實驗甲型H1N1流感病毒鼠肺適應株(FM/1/47株和PR/8/34株),購自中國疾病預防控制中心病毒病預防控制研究所,由本生物安全實驗室(ABSL-2)雞胚傳代,TCID50分別為10-4.5,10-4,-80℃保存?zhèn)溆谩?.3細胞MDCK,中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所&北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院細胞中心,本室傳代液氮凍存。1.4cumperfratum兩味藥材的相關問題一葉抗流感膠囊,是由新疆一枝蒿ArtemsiarupestrisL.和貫葉金絲桃Hypericumperforatum兩味藥材按質(zhì)量1∶1經(jīng)乙醇提取,大孔吸附樹脂純化得到,藥材鑒定人為黃華研究員(新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所,專業(yè)為中藥學),其有效成分為一枝蒿酮酸,得率為38.02%,由新疆西部加斯特藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號20130731,性狀:褐色膠囊內(nèi)容物。1.5四川光計劃在四川光計劃設備公司5.利巴韋林顆粒(四川百利藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn),批號130710),抗病毒顆粒(四川光大制藥有限公司,批號1302107-017)。1.6細胞培養(yǎng)液含10%FBS(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司產(chǎn)品,批號TBD31HB),DMEM(Gibco,900162)。1.7美國al.18a2型生物安全柜倒置相差顯微鏡(日本Olympus),CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司),MSC18A2型生物安全柜(美國Thermo),YP/0001電子天平(上海越平科學儀器有限公司),AR204電子天平(美國Chaus)。2方法2.1配置方法體內(nèi)試驗時用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液配制,體外試驗用高純水配制、實驗時用細胞維持液倍比稀釋。2.2小鼠等效劑量一葉抗流感膠囊人臨床劑量為4.8g·d-1,按70kg算,即68.57mg·kg-1·d-1。小鼠試驗用量分別為1.5,0.75,0.38g·kg-1·d-1,分別相當于人臨床用藥量的2倍、等倍和1/2倍;利巴韋林臨床用量為450mg·d-1,換算成小鼠等效劑量為0.07g·kg-1;抗病毒顆粒臨床用量為27g·d-1,換算成小鼠等效劑量為4.24g·kg-1,試驗時各藥物按等容積20mL·kg-1ig給藥。2.3小鼠乙流感染fm1小鼠按體重等級隨機分為7組,分別為正常對照組、病毒對照組、利巴韋林組、抗病毒顆粒組、一葉抗流感膠囊高、中、低3個劑量組(1.5,0.75,0.38g·kg-1),每組12只。除正常對照組外,將小鼠用乙醚輕度麻醉,以15個LD50流感病毒液(FM1和PR8株)滴鼻感染,每只35μL。感染當天開始給藥,每次按20mL·kg-1ig,1次/d,連續(xù)4d,正常對照組和病毒對照組同等條件灌胃給予0.5%CMC。第5天稱體重后解剖稱肺重,計算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。2.4連續(xù)給藥4周小鼠按體重隨機分為7組,分組方法及給藥方式同2.3,每天1次,連續(xù)4d。最后1次給藥后除正常對照組外,對小鼠進行感染,感染方法同2.3。感染后不再給藥,感染后第4天,稱取小鼠體重后解剖,全肺稱質(zhì)量,計算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率。2.5葉抗氣流膠囊組取小鼠按體重等級隨機分為6組,分別為病毒對照組、利巴韋林組、抗病毒顆粒組、一葉抗流感膠囊高、中、低3個劑量組,每組20只。以2個LD50流感病毒液(FM1和PR8株)滴鼻感染,每只35μL。感染當天開始給藥,連續(xù)4d。觀察感染后2周內(nèi)動物的死亡情況,計算死亡率、死亡保護率、平均存活天數(shù)和生命延長率。2.6連續(xù)給藥4周取小鼠按體重等級隨機分為6組,分組方法和給藥方式同2.3,每日1次,連續(xù)4天。最后1次給藥后,對小鼠進行感染,感染方法同2.5。觀察死亡情況方法,統(tǒng)計方法同2.5。2.7mtt法檢測細胞毒性將一葉抗流感膠囊藥物母液用培養(yǎng)液做1∶2~1∶256倍比稀釋后,加到已長成單層的MDCK細胞培養(yǎng)板中,100μL/孔,每個稀釋度藥液做4個復孔,同時設正常細胞對照。將培養(yǎng)板置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48h后每孔加入10μLMTT(5g·L-1),37℃培養(yǎng)4h后,小心吸去培養(yǎng)液,加入100μLDMSO,置搖床上震蕩,結(jié)晶物充分溶解后,測吸光度(A)490nm。找出最大無毒濃度(TC0),并按Reed-Muench法計算50%細胞毒性濃度(TC50)。2.8細胞病變檢測取已長成單層MDCK細胞的培養(yǎng)板,分別接種的不同稀釋度的流感病毒液(FM1株10-2.3稀釋度、PR8株10-2稀釋度),每種毒株100μL/孔,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1h后,加入TC0及以下的3個濃度的一葉抗流感膠囊,100μL/孔,同時設正常對照和病毒對照,并以利巴韋林為陽性對照。置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況。細胞病變按6級標準判斷:-:細胞生長正常,無病變出現(xiàn);±:細胞病變少于整個單層的10%;+:細胞病變約占整個單層細胞的25%以下;ue0d1:細胞病變約占整個單層細胞的50%以下;ue0d2:細胞病變約占整個單層細胞的75%以下;ue0d3:細胞病變約占整個單層細胞的75%以上;當病毒對照組細胞病變?yōu)閡e0d3時記錄試驗結(jié)果,并按Reed-Muench計算50%抑制濃度(IC50)和治療指數(shù)(TI),TI=TC50/IC50。2.9肺指數(shù)、平均存管平均存天數(shù)和死亡率試驗數(shù)據(jù)以ue0af±s表示,采用SPSS13.0進行統(tǒng)計,肺指數(shù)和平均存活天數(shù)采用t檢驗進行統(tǒng)計,死亡率采用卡方檢驗進行統(tǒng)計。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。3結(jié)果3.1模型和模型組肺指數(shù)比較流感病毒FM1和PR8株感染小鼠后,病毒對照組肺指數(shù)明顯增高,與正常對照組比較有顯著性差異;一葉抗流感膠囊進行治療性給藥后,給藥3個不同劑量組肺指數(shù)均有不同程度降低,其中FM1株高、中、低劑量組及PR8高、中劑量組與模型組比較有顯著性差異。給予一葉抗流感膠囊進行預防性給藥后,3個劑量組肺指數(shù)均沒有明顯改變。見表1。3.2對小鼠的毒力流感病毒FM1株感染正常小鼠2周內(nèi),病毒對照組動物死亡率為90%,平均存活天數(shù)為9.20d;治療性給藥后,3個劑量組死亡數(shù)均有一定程度的降低,但與模型組比較沒有顯著性差異;高、中劑量組均能明顯延長感染小鼠存活天數(shù),與模型組比較具有顯著性差異。PR8株感染2周內(nèi),病毒對照組動物死亡率為90%,平均存活天數(shù)為9.25d;治療性給藥后,高劑量組動物的死亡數(shù)明顯降低,與病毒組比較具有顯著性差異(P<0.05);高、中劑量組均能明顯延長感染小鼠存活天數(shù),與病毒組比較具有顯著性差異(P<0.05)。見表2。3.3對小鼠的死亡數(shù)影響流感病毒FM1株感染正常小鼠2周內(nèi),病毒對照組動物死亡率為85%,平均存活天數(shù)為9.35d;預防性給藥后,3個劑量組動物的死亡數(shù)均有一定程度的降低,但與模型組比較沒有顯著性差異;高、中劑量組能明顯延長感染小鼠存活天數(shù),與模型組比較具有顯著性差異(表3)。PR8株感染正常小鼠2周內(nèi),病毒組死亡率為55%,平均存活天數(shù)為11.60d;預防性給藥后,3個劑量組動物的死亡數(shù)、存活天數(shù)均沒有明顯變化。3.4折光性增加規(guī)則加入一葉抗流感膠囊后,MDCK細胞變圓或形狀不規(guī)則,折光性增加;培養(yǎng)48h后,用MTT法測定細胞活性,最大無毒濃度(TC0)為2.5g·L-1,TC50為6.01g·L-1。3.5抗氣流膠囊對fm1的療效光學顯微鏡下可見FM1、PR8病毒對照孔細胞病變效應主要表現(xiàn)為圓縮脫落、少數(shù)畸形、死亡,加入一葉抗流感膠囊后,對FM1所致細胞病變有保護作用,且隨藥物濃度降低病變細胞有增多趨勢,表現(xiàn)為在體外對甲型H1N1流感病毒FM1株有不同程度的抑制作用,其IC50均為0.89g·L-1,治療指數(shù)TI為6.75;而對PR8株無明顯的抑制作用。4抗氣流膠囊治療整合因子染料對小鼠肺指數(shù)的影響一葉抗流感膠囊是一種防治甲型流感的推薦用中藥組方,應用于臨床具有較好的療效。本研究采用兩株甲型H1N1流感病毒感染小鼠造成病毒性肺炎的動物模型和感染易感細胞MDCK造成體外細胞模型,在體內(nèi)外對一葉抗流感膠囊治療流感的作用進行評價。采用甲型H1N1流感病毒FM1和PR8病毒株感染正常小鼠后肺指數(shù)明顯增高,較正常對照組有顯著性差異;感染小鼠2周內(nèi),病毒對照組動物死亡率均為90%,平均存活天數(shù)分別為9.20,9.25d,給予一葉抗流感膠囊治療后能明顯降低流感病毒FM1株和PR8株感染后小鼠的肺指數(shù),對小鼠肺部炎癥有明顯治療作用,高、中劑量組與模型對照組比較有顯著性差異;還降低病毒性肺炎小鼠死亡率、其中PR8毒株感染的高劑量組較模型組有顯著性差異,高、中劑量組還可以明顯延長小鼠的平均存活天數(shù)。中醫(yī)書籍中早已有了瘟疫“治未病、未病先防”的史料記載,強調(diào)預防重于治病,在歷次疫情流行中發(fā)揮著重要的作用。選用一葉抗流感膠囊防治甲型H1N1流感,FM1毒株感染小鼠3個劑量組的死亡數(shù)均有一定程度的降低,高、中劑量組均能明顯延長感染小鼠的存活天數(shù),與模型對照組比較具有顯著性差異。PR8感染小鼠3個劑量組預防給藥動物的死亡數(shù)、存活天數(shù)沒有明顯變化,FM1、PR8感染一葉抗流感膠囊預防組的肺指數(shù)均沒有明顯改變。CPE法通過觀察一葉抗流感膠囊對甲型H1N1流感病毒FM1,PR8感染MDCK細胞的病變