miR-888和miR-891a的雙重微滴式數字PCR檢測在精液鑒定中的應用

魏孫祥，陳惠香，胡勝，趙一霞，石慧霞，王哲，李文，季安全，孫啟凡1.山西醫科大學法醫學院，山西太原030001；2.公安部鑒定中心現場物證溯源技術國家工程實驗室法醫遺傳學公安部重點實驗室，北京100038確定案發現場遺留的體液斑跡組織屬性對于推斷案件性質、重建犯罪現場等具有重要意義[1-2]，其中精液（斑）是法醫物證鑒定中常見的生物物證，尤其對于強奸、猥褻案件至關重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長度為18～24個堿基的非編碼RNA，具有高穩定性、強保守性、良好的組織特異性、可兼容DNA同步分析等優勢，是法醫學體液鑒定的重要工具[3-8]。微滴式數字聚合酶鏈反應（dropletdigitalpolymerasechainreaction，ddPCR）是一種高靈敏度、高精確性的定量方法，對于低濃度核酸分子檢測結果的可重復性好，可用于miRNA的絕對定量檢測[9-10]。研究[5-6]結果表明，miR-888和miR-891a具有良好的精液特異性，可通過對其表達量的檢測進行精液鑒定，但目前使用的檢測方法均為實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應（realtimefluorescentquantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-qPCR）相對定量法，使用不同的內參基因可能會對檢測結果作出不同的解釋[11]，受抑制劑、檢測平臺和擴增效率影響較大，對結果的解釋不夠直接和客觀[12]。本研究旨在建立可同時檢測miR-888和miR-891a的雙重ddPCR檢測體系，通過絕對定量對miR-888和miR-891a作為精液特異性標記的可靠性進行評估，以期為精液鑒定提供更科學、準確的方案。1材料與方法1.1材料1.1.1主要儀器和試劑QX200AutoDG微滴式數字PCR系統（美國Bio-Rad公司），包括自動化微滴生成器、PX1PCR反應板熱封儀、帶96-深孔反應模塊的C1000Touch熱循環儀和QX200TM微滴讀取器；NanoDrop2000c分光光度計（美國ThermoFisherScientific公司）。miRNeasyMini試劑盒（德國Qiagen公司），TaqManTMMicroRNA逆轉錄試劑盒（美國ThermoFisherScientific公司），ddPCR超混合液（無dUTP，美國Bio-Rad公司）。1.1.2引物、探針設計與標準品RNA合成miR-888、miR-891a的成熟序列[5]及引物和探針信息見表1，探針的報告基團分別采用6-FAM和HEX熒光修飾。自行設計引物、探針后由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-888、miR-891a標準品RNA由寶生物工程（大連）有限公司合成。表1miR-888、miR-891a的成熟序列及引物和探針信息Tab.1Informationofmaturesequences，primersandprobesofmiR-888andmiR-891a1.1.3樣本制備對75名來自中國北方地區年齡在25～35歲的健康志愿者進行樣本采集，收集5種法醫學相關體液樣本共75份，其中精液35份，外周血、月經血、唾液、陰道分泌液各10份。外周血通過靜脈穿刺收集后置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）抗凝采血管內。唾液使用無菌塑料管收集（樣本收集前志愿者禁食1h）。精液使用無菌廣口塑料杯收集（樣本收集前，志愿者禁欲2d）。月經血（于月經周期的第2天或第3天采集）和陰道分泌液使用衛生棉條獲取。所有樣本采集制備后均儲存于-80℃備用。本研究已通過公安部鑒定中心倫理委員會的審查（審批文號：2020-024），所有志愿者均已簽署知情同意書。1.2方法1.2.1RNA提取和定量按照miRNeasyMini試劑盒操作說明書進行總RNA的提取[13]，使用NanoDrop2000c分光光度計測定總RNA的質量濃度和純度（D260/D280）[8]。1.2.2互補DNA（complementaryDNA，cDNA）合成采用莖環反轉錄法[8]，按照TaqManTMMicroRNA逆轉錄試劑盒操作說明書進行反轉錄。每15μL反應體系包括總RNA10ng，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate，dNTP）預混液（100mmol/L）0.15μL，MultiScribeTM逆轉錄酶（50U/μL）1.00μL，10×反轉錄緩沖液1.50μL，RNA酶抑制劑（20U/μL）0.19μL，miR-888逆轉錄莖環引物（1μmol/L）0.15μL，miR-891a逆轉錄莖環引物（1μmol/L）0.15μL，加無核酸酶水（日本TaKaRa公司）至15μL。設置反轉錄陰性對照（用無核酸酶水取代逆轉錄酶）。反應條件：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保持。1.2.3雙重ddPCR檢測體系的建立和優化按照微滴生成、PCR擴增和微滴讀取3個步驟進行體系的建立。首先針對miR-888和miR-891a建立單獨的ddPCR檢測體系，在此基礎上，通過優化退火溫度和熱循環數，建立雙重ddPCR檢測體系。（1）微滴生成。雙重ddPCR檢測miR-888和miR-891a，每22μL反應體系包括探針用ddPCR超混合液（無dUTP）11μL，cDNA1.1μL，通用反向引物（20μmol/L）0.99μL，miR-888、miR-891a特異性正向引物（20μmol/L）各0.99μL，miR-888、miR-891a熒光探針（20μmol/L）各0.275μL，無核酸酶水6.38μL。設置陰性對照（使用無核酸酶水代替cDNA作為模板）。將樣品轉移至96孔板中，于自動化微滴生成器中生成微滴，放置另一96孔板以接收生成的微滴。（2）PCR擴增。將接收微滴的96孔板蓋膜，封膜，PCR擴增。PCR擴增程序：95℃10min；94℃30s，56～62℃60s，72℃30s，45個循環；98℃10min，4℃保持。升降溫速度為2℃/s。miR-888、miR-891a的單獨檢測及雙重檢測均使用此反應條件。（3）微滴讀取。擴增完畢后，在QX200TM微滴讀取器上讀取微滴數據，采用QuantaSoftv1.7.4軟件（美國Bio-Rad公司）獲取目標片段的拷貝濃度。包含10000個以上微滴的反應被視為有效反應，并用于數據分析[14-15]。（4）雙重ddPCR檢測條件優化。優化ddPCR反應條件，包括退火溫度和熱循環數。使用帶96-深孔反應模塊的C1000Touch熱循環儀溫度梯度功能進行PCR擴增退火溫度的優化，設置退火溫度梯度為：62℃、61.6℃、60.9℃、59.8℃、58.4℃、57.3℃、56.5℃、56℃。設置熱循環數為35、40、42、43、45、46個。1.2.4雙重檢測與單獨檢測的結果比較為驗證雙重ddPCR檢測體系的準確性，使用雙重體系與單一體系同時對隨機挑選的4份精液樣本進行miR-888和miR-891a的檢測和拷貝濃度比較。雙重ddPCR檢測體系為在同一反應孔內加入miR-888和miR-891a的正反向引物和探針，其中miR-888和miR-891a的引物濃度配比為1∶1，利用5′端不同熒光修飾的探針可同時檢測這兩種miRNA。單獨miRNA檢測體系為在同一反應孔內僅加入其中一個miRNA的引物和探針，用無核酸酶水代替另一個miRNA的引物和探針，即miR-888和miR-891a在不同反應孔內單獨進行檢測。1.2.5靈敏度檢測對隨機挑選的6份樣本（精液2份、外周血1份、月經血1份、唾液1份、陰道分泌液1份）提取的總RNA從10ng開始進行10倍梯度稀釋，共4個梯度，即總RNA量分別為10ng、1ng、0.1ng、10pg，利用1.2.3節建立和優化后的雙重ddPCR檢測體系進行檢測。1.2.6重復性檢測對miR-888、miR-891a標準品RNA各5ng進行稀釋，稀釋倍數分別為2500、12500、62500、312500倍。以不同濃度的標準品核酸為模板，使用1.2.3節建立和優化后的雙重ddPCR檢測miR-888和miR-891a，每個濃度設立3個復孔，計算其變異系數，以評價檢測方法在不同濃度下的批內重復性。在同樣的反應條件下進行2次試驗（每次試驗每個濃度設置3個重復求平均值作為結果），計算其變異系數，評價該方法的批間重復性。1.2.7數據分析采用配對樣本t檢驗對ddPCR雙重檢測與單獨檢測的結果進行差異性分析，采用Mann-WhitneyU檢驗對精液與其他常見體液中目標片段的拷貝濃度進行差異性分析，通過受試者操作特征（receiveroperatorcharacteristic，ROC）曲線分析，根據曲線下面積（areaunderthecurve，AUC）評估miR-888和miR-891a區分精液的能力，并計算約登指數（Youdenindex）確定最佳的鑒別截斷值。使用GraphPadPrism9.0軟件（美國GraphPadSoftware公司）進行統計分析，檢驗水準α=0.05。2結果2.1總RNA的質量濃度和純度本研究5種體液共75份樣本提取后的總RNA質量濃度和純度見表2。不同類型體液之間的總RNA質量濃度和純度具有一定差別。外周血樣本具有最高的質量濃度，而唾液樣本的質量濃度始終較低。所提總RNA的平均純度在（1.75±0.10）～（1.99±0.06）。表25種體液的總RNA質量濃度和純度Tab.2MassconcentrationandpurityoftotalRNAextractedfrom5bodyfluids（±s）表25種體液的總RNA質量濃度和純度Tab.2MassconcentrationandpurityoftotalRNAextractedfrom5bodyfluids（±s）2.2雙重ddPCR檢測體系的建立和優化如1.2.3節所述，經退火溫度梯度實驗（56～62℃），根據兩個檢測通道陽性微滴和陰性微滴的分離狀態，將退火溫度設為56.5℃；分別嘗試將熱循環數設為35、40、42、43、45、46個，發現當擴增效率較低時，適當增加熱循環數能夠提高陽性微滴信號，并使其更加集中分布，有利于陽性和陰性信號的區分，最終將最優熱循環數設置為45個。經優化后，雙重ddPCR檢測miR-888和miR-891a的擴增圖見圖1。圖1雙重ddPCR檢測miR-888和miR-891a的擴增圖Fig.1AmplificationplotsofmiR-888andmiR-891adetectedbyduplexddPCR2.3雙重檢測與單獨檢測的結果比較4份精液樣本經ddPCR雙重檢測與單獨檢測的結果見表3，經配對樣本t檢驗，兩種方法得出的目標片段拷貝濃度差異無統計學意義（P＞0.05）。表3精液樣本經ddPCR雙重檢測和單獨檢測的目標片段拷貝濃度Tab.3ThetargetfragmentcopyconcentrationsofsemensamplesdetectedbyduplexddPCRandsingleddPCR（copies/μL）2.4靈敏度檢測雙重ddPCR檢測體系的靈敏度檢測結果見圖2。當稀釋100倍后（0.1ng總RNA），該體系仍然能準確地從5種體液中鑒別出精液。當總RNA量為10pg時，該體系在月經血中檢測出1個miR-888陽性微滴、在陰道分泌液中檢測出1個miR-891a陽性微滴從而出現假陽性。因此，使用該體系時，初始總RNA的質量至少需要0.1ng。圖2雙重ddPCR檢測體系的靈敏度檢測結果Fig.2SensitivitytestresultsofduplexddPCRdetectionsystem2.5重復性檢測以4種稀釋倍數的標準品核酸為模板，使用雙重ddPCR檢測miR-888和miR-891a，計算得到miR-888的批內變異系數分別為1.86%、2.12%、5.60%和10.72%，miR-891a的批內變異系數分別為1.56%、0.71%、1.17%和2.03%（表4）；miR-888的批間變異系數分別為2.27%、1.03%、2.39%和3.91%，miR-891a的批間變異系數分別為1.78%、0.78%、6.90%和6.98%。4種稀釋倍數下的批內和批間變異系數均小于15%。表44種稀釋倍數下標準品的拷貝濃度Tab.4Copyconcentrationsofstandardsubstancesat4dilutions（n=3，±s，copies·μL-1）表44種稀釋倍數下標準品的拷貝濃度Tab.4Copyconcentrationsofstandardsubstancesat4dilutions（n=3，±s，copies·μL-1）2.6精液與其他常見體液表達的差異性分析本研究對5種體液共75份樣本進行了雙重ddPCR檢測，結果見表5。將精液分別與外周血、月經血、唾液、陰道分泌液中miR-888和miR-891a的檢測結果進行Mann-WhitneyU檢驗，miR-888和miR-891a在精液中的表達量高于其他體液（P＜0.05）。表55種體液中miR-888和miR-891a的拷貝濃度Tab.5CopyconcentrationsofmiR-888andmiR-891ain5bodyfluids（±s，copies·μL-1）表55種體液中miR-888和miR-891a的拷貝濃度Tab.5CopyconcentrationsofmiR-888andmiR-891ain5bodyfluids（±s，copies·μL-1）注：1）與精液樣本比較，P＜0.05。2.7ROC曲線分析對精液與非精液樣本中miR-888和miR-891a的拷貝濃度進行ROC曲線分析，結果見圖3。miR-888的AUC為0.976，最佳截斷值為2.250copies/μL，此時靈敏度為94.29%，特異性為100%，約登指數為0.943，75份樣本中有2份精液樣本被誤判為非精液，判別正確率為97.33%；miR-891a的AUC為1.000，最佳截斷值為1.100copies/μL，此時靈敏度和特異性均為100%，約登指數為1，75份樣本均被正確判別。圖3ROC曲線分析結果Fig.3AnalysisresultsofROCcurve3討論一直以來，RT-qPCR被認為是檢測miRNA表達量的金標準[16-17]，也是目前基于miRNA進行體液鑒定的主要檢測方法，但該方法一方面需要科學準確地選擇內參基因進行相對定量分析[11]，或通過已知濃度的標準品制作標準曲線以進行絕對定量；同時，qPCR針對不同的目標基因需要設計單獨的檢測體系，復合檢測難度較大，無形中限制了其在法醫學實踐中的廣泛應用。ddPCR是近些年逐漸發展成熟的一種可對微量核酸進行絕對定量檢測的方法，其原理是將待測樣品分成數萬個微滴，每個微滴不含或含有至少1個待檢核酸靶分子，經過獨立PCR反應后，對微滴進行逐個檢測，最終根據泊松分布原理及陽性微滴比例給出待檢靶分子的拷貝濃度[9-10]。本研究將ddPCR技術引入法醫學體液鑒定領域，克服了miRNA序列較短，引物和探針的設計較為復雜等技術難點，自行設計TaqMan探針，分別選擇6-FAM和HEX熒光修飾的報告基團用于兩條miRNA探針，建立雙重ddPCR檢測體系，實現了miRNA的ddPCR雙通道檢測，可同時對miR-888和miR-891a兩種miRNA進行絕對定量分析，經配對樣本t檢驗，ddPCR雙重檢測與單獨檢測結果差異無統計學意義，說明雙重ddPCR檢測結果可信，能夠達到與單獨ddPCR檢測同樣的準確性。經重復性試驗，批內和批間變異系數均小于15%，說明該體系穩定性和重復性良好[18]，檢測結果準確、可靠。探針根據以下原則進行設計：跨越莖環序列和miRNA成熟序列連接處且不與正向引物重疊，盡可能增加長度以提高解鏈溫度（meltingtemperature，Tm）值，同時設計5′報告基團、3′淬滅基團以及3′小溝結合物（minorgroovebinder，MGB）[19]。與傳統的TaqMan探針相比，MGB探針能夠在顯著提高Tm的同時增加特異性，尤其是當錯配發生在MGB區域時，單個堿基不匹配就能顯著降低DNA雙鏈的Tm值[20]。這些性質決定了MGB探針尤其適用于長度較短的核酸（如miRNA）和單堿基突變等研究。miR-888最初被定義為附睪特異性表達的miRNA[21]，是一種前列腺分泌液來源的miRNA，具有促進前列腺細胞增殖、遷移和集落形成的功能[22]，miR-891a的功能