應用pcr-dgge技術分析炎癥性腸病患者腸道菌群結構

炎癥腸?。╥bd）是一種非特異性慢性腸炎（rc），包括潰瘍性胃炎（tc）和克羅恩病（cd）。近年來我國UC和CD發病率均呈上升趨勢,尤其是UC病例數增加更加明顯。IBD的反復發作給患者帶來了極大的精神和經濟負擔,也極大的占用了社會醫療資源。目前IBD的病因及發病機制尚不十分清楚,近來的研究主要集中在遺傳易感性、免疫異常、腸道菌群改變方面。越來越多的研究認為IBD可能主要由遺傳易感體質決定,免疫調節紊亂是關鍵的直接發病機制,腸道菌群是這種免疫損傷過程中的重要激發因素,環境精神等因素可能是發病的誘因?？梢娔c道菌群在腸道免疫及IBD的發病機制中起到了關鍵的作用。成人腸道包含中有1000多種不同的細菌,總數在1014以上,構成了人體最大的微生物群落。傳統的腸道微生物檢測技術主要是從新鮮糞便中分離微生物進行表型特征測定和生化及血清學鑒定,操作費時耗力,某些特性的測定精確性差,而且不能表達分離物間的系統發育關系。近年來,基于16SrDNA的分子生物學技術促進了微生態學研究的發展,特別是被稱為DNA指紋技術的變性梯度凝膠電泳法(DGGE),能有效分析復雜微生物群落及其多樣性且無須培養微生物,而被越來越多地用于環境及腸道等微生態的研究。本研究以正常健康人和IBD患者糞便為研究對象,運用DGGE技術,從糞便中提取細菌總DNA,依此為模板進行PCR擴增,得到反映腸道菌群結構特征的DNA指紋圖譜,并進行聚類分析及多樣性分析,比較2組之間微生物種群的差異?，F將結果報道如下。1臨床數據1.1患者性別、年齡以2009年12月—2010年4月在本院消化內科就診者18例為檢測對象,其中9例為IBD患者(實驗組),男6例,女3例,平均年齡35歲,均符合文獻中IBD診斷標準。另9例為健康者(對照組),男5例,女4例,平均年齡46歲,內鏡下均未見器質性病變,并排除其他疾病,在檢測前均未長期服用質子泵抑制劑、激素、非甾體類消炎藥。1.2樣本采集所有入組者留取鏡檢前日糞便(10±5)g,樣本采集后6h內送達實驗室,密封后-20℃冷藏保存。1.3screw-capped管的制備將Zoetendal等的方法進行改進,建立“凍融+BeadBeater+試劑盒”的DNA提取方法。稱取0.3g低溫保鮮樣品至已滅菌的含0.3g鋯珠的screw-capped管中混勻,加入1mLTN150和150μL酸性酚,BeadBeater勻漿(5000r/min,3min)。冰上冷卻后,采用北京百泰克生物技術有限公司生產的糞便基因組DNA快速提取試劑盒提取,按試劑盒說明書操作。1.4pcr反應體系在16SrDNA的可變序列區間設計1對細菌通用引物,用于引導16SrDNA第6—8可變區的PCR擴增反應。引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列分別為,F968f-Gc:5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3’;R1401:5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。反應條件:94℃預變性5min;94℃30s,56℃20s,72℃1min,共30個循環;最后56℃延伸5min。反應體系(50μL):dNtp4μL,Buffer5μL,Taq酶0.3μL,ddH2O37.7μL,上下游引物及模板各1μL。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳(0.5mL/L溴化乙錠染色)檢測擴增結果,Uvl凝膠成像系統照相。目的片段理論長度約470bp。無特異擴增時,進行修復PCR擴增。1.5gaacgc-3引物序列分別為,F968f-Gc:5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3’;R1401:5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’。反應條件:94℃預變性5min;94℃30s,56℃20s,72℃1min,共30個循環;最后56℃延伸5min。體系為(50μL):其中的模板為5μL上述PCR產物,dNtp4μL,Buffer5μL,Taq酶0.3μL,ddH2O33.7μL,上下游引物及模板各1μL。1.6胺、尿素、甲酰胺和甘油的電泳參照Muyzer等方法,對細菌16SrDNA的V6—8可變區的擴增產物進行DGGE分析。DGGE用8%聚丙烯酰胺凝膠(含丙酰胺、二丙酰胺、尿素、甲酰胺和甘油),38%～58%變性梯度。電泳采用DcodeDGGE系統(Bio-Rad),電泳緩沖液為40mmol/L的Tris-乙醇(pH8.0),首先在200V電壓下預電泳5～10min,隨后在85V的固定電壓下電泳16h。電泳結束后,進行硝酸銀染色,凝膠顯色定影后于UVI全自動凝膠成像系統(UVItec,USA)拍照。對于DGGE凝膠上感興趣的條帶,可以進行切膠回收并克隆測序。1.7生物多樣性分析DGGE凝膠圖(TIFF格式)采用QuantityOne(Bio-Rad)軟件進行相似性和多樣性分析。相似性分析采用聚類分析;多樣性分析采用豐富度和生物多樣性分析,常用Shannon-Wiener指數進行分析,豐富度(S)表示DGGE圖譜每泳道的條帶數;Shannon-Wiener指數(H)的計算方法為H=-∑Pilnpi,Pi為第i條帶的吸光度與該泳道所有條帶吸光度總和的比值。QuantityOne分析所得數據使用SPSS18.0進行Student-T檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1不同的腸道ge-pcr擴增效果DGGE圖譜見圖1,圖中泳道a1～a9為健康人群糞便總菌PCR樣品,A1～A9為IBD患者糞便總菌PCR樣品。每一泳道代表一個樣品內總菌的DGGE指紋圖,不同位置的條帶代表不同的優勢細菌,條帶亮度反映出該條帶所代表細菌相對量的多少。實驗中每個泳道內都有大量條帶存在,但條帶的數目、位置和亮度都有不同,說明每個個體糞便內細菌都有著豐富的多樣性,優勢菌也不盡相同。相似性聚類分析顯示見圖2,盡管2組間個別樣本有不同程度的菌群相似度交叉,但總體仍可觀察出組內各樣本之間的菌群相似度較高,而組間的細菌組成結構有較大的差異,還可以觀察到IBD患者樣本中有箭頭所示的特異性的條帶缺失。2.2小鼠糞便菌群dppe條帶數條帶標定計數結果顯示:對照組糞便菌群DGGE條帶數目最多25條,最少10條,平均18條;實驗組糞便菌群DGGE條帶數最多20條,最少4條,平均13條。實驗組的Shannon-Wiener指數較對照組明顯下降,具體結果見表1。3腸道菌群與id的關系人體腸道中棲息著種類繁多和數量巨大的微生物,包括真菌、細菌和古細菌,這些微生物與人體相互依存,構成了腸道的微生態系統,對促進食物消化、產生維生素等營養物質、抵御外來致病菌侵入、刺激免疫系統等方面有著重要作用,可視作“人體第二基因組”即元基因組學(Metagenomics),是影響人體健康最重要的后天因素之一。正常情況下,這些微生物對機體無害,或有利于機體的健康。科學證據表明,環境條件的輕微變化即可導致機體微生態系統的變化,造成菌群失調,對宿主的腸道功能產生不良影響。一旦腸道菌群發生紊亂,腸道微生態破壞,就有可能會引起內源性感染。新的“慢性病的腸源性學說”認為腸道菌群可能直接參與了疾病如肥胖、糖尿病、冠心病等的發生和發展。大量研究發現腸道菌群的改變與IBD的發生、發展關系密切,Darfeuille-Michaud等檢測了63例CD患者和16例非IBD對照者的回腸標本,發現21.7%的CD慢性病變可檢測出致病性黏附侵襲性大腸桿菌,而對照者僅6.2%檢出此細菌。GarcíaRodríguez等調查發現1a內有腸道感染者發生IBD的風險是無感染者的2.4倍。隨著微生態學研究的迅猛發展,人們對腸道微生物的了解越來越深入。DGGE技術的原理是根據DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發生變化,從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。理論上認為,只要選擇的電泳條件如變性劑梯度、電泳時間、電壓等足夠精細,僅有1個堿基變異的DNA片段都可被分開。該技術最先由Fischer和Lerman提出用于檢測基因點的突變。自1993年Muzyer等首次將該技術應用于分子微生物學研究領域以來,已有不少應用于消化道及糞便細菌菌群的研究報道。本研究觀察到,16SrDNAV6—8區的PCR-DGGE圖譜能夠對人體腸道主要菌群進行區分。研究中每份樣本的DGGE圖譜均顯示高度的多態性,而且不同樣本間的帶型不盡相同,表明PCR-DGGE能有效地檢測糞便中細菌組成的多樣性,能直觀地反映細菌的組成結構。DGGE圖譜的聚類分析結果顯示IBD患者糞便中的細菌組成結構與健康人群有較大的差異性,存在某些特異性細菌的缺失;多樣性分析結果顯示IB