第七課樣品的全息制備第1頁，課件共78頁，創作于2023年2月

蛋白質樣品制備是蛋白質組研究的第一步，無論后續采用怎樣的分離或鑒定手段，樣品制備都是關鍵步驟。從蛋白質組大規模研究的角度而言，要求樣品制備盡可能獲得所有的蛋白質，但由于蛋白質種類多、豐度不一和物化特性多樣等，要達到真正的全息制備是有難度的。當然，樣品制備的方法還必須與后續的分離或鑒定方法相匹配，如采用雙向凝膠電泳，需謹慎使用SDS抽提蛋白質，如果以液相色譜作為分離手段，太多的去污劑和兩性電解質不是一個好的選擇。更重要的是，樣品的來源千差萬別，針對不同來源的樣品(如細胞樣品、動物組織樣品、植物樣品、體液等)，需要采取不同的蛋白質抽提方法。本章就常規樣品的制備和不同來源蛋白質的樣品制備進行詳細闡述。第2頁，課件共78頁，創作于2023年2月實驗室一般使用下列三種方法制備質粒DNA：●氯化銫密度梯度離心法質粒DNA純度高、周期長、設備要求高。●堿溶法質粒DNA純度低、快速、操作簡便。●沸水浴法質粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間。第3頁，課件共78頁，創作于2023年2月質粒DNA的分離純化堿溶法：●用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體；●加溶菌酶裂解細菌細胞壁；●加NaOH和SDS的混合溶液，去膜釋放內含物；●加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質；●離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質；●乙醇或異丙醇沉淀水相質粒DNA；●用無DNase的RNase去除殘余的RNA；第4頁，課件共78頁，創作于2023年2月第一節雙向凝膠電泳常規樣品制備及其改進

一、概述目前蛋白質組研究技術發展很快，新的研究方法和研究手段不斷涌現，如毛細管等電聚焦、多維色譜、分子掃描儀和微流芯片等。而雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis)技術是蛋白質組研究中最早的支撐技術之一。由于雙向凝膠電泳技術具有高分辨率、高重復性、微量分析和制備等性能，仍然是當今蛋白質組分析研究中的一個強有力的工具。因而針對雙向凝膠電泳樣品制備方法的探索也是蛋白質組研究的一個重要方面。所以，在樣品制備過程中，一切影響等電聚焦和凝膠電泳的因素都應該考慮在內。樣品制備絕對是一門藝術，方法可以從簡單的緩沖液溶解，到應用離液劑、還原劑及去污劑來進行復合物提取，以及到更復雜的順序提取(sequenceextracting)和亞細胞分級等。由于實驗需求的不同以及樣品本身的特殊性，沒有一種樣品制備方法能夠廣泛地適用于各種各樣的樣品。所以，對于每一個有著不同要求的樣品，都需要通過大量的實驗來摸索最合適的實驗條件。有效的可重復的樣品制備方法是雙向凝膠電泳成功的關鍵。第5頁，課件共78頁，創作于2023年2月一般來說，一種理想的有效的樣品制備方法應該滿足以下幾點要求。①在合適鹽濃度下，可重復地溶解所有的蛋白質，包括疏水性蛋白質，并使樣品中的蛋白質以分離的多肽鏈形式存在。②避免溶解性低的蛋白質(如膜蛋白)在等電聚焦時由于溶解度降低而沉淀析出。③防止蛋白質的化學修飾，包括蛋白質降解、蛋白酶或尿素熱分解后所引起的修飾。④排除核酸、多糖、脂類和其他干擾分子。⑤獲得的目標蛋白質應在可探測水平，有時需要去除高豐度蛋白質和不相關蛋白質。第6頁，課件共78頁，創作于2023年2月二、樣品裂解液中各種成分分析為獲得最佳的雙向電泳分離結果，樣品一般使用促溶劑、去污劑、還原劑、IPG緩沖液和兩性電解質等將其變性并充分溶解。然而這些化學物質應滿足一些化學和電學要求，如適合IPG膠條的IEF技術、保持蛋白質最大的溶解性和盡可能低的離子強度(等電聚焦加以高電壓時，低離子強度使得電流很低，保證了聚焦的快速和高效)。第7頁，課件共78頁，創作于2023年2月(一)離液劑尿素是最常用的離液劑(chaotropicagent)，它的主要作用是改變或破壞氫鍵等次級鍵的結構，使得蛋白質變性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素聯合使用，可以大大增加蛋白質的溶解性，特別是膜蛋白的溶解性。尿素和硫脲有效地破壞了疏水鍵，防止了聚集作用和二級結構的形成，聚集作用和二級結構的形成會改變蛋白質的遷移性。然而硫脲在水中的溶解性很差，需要高濃度的尿素來助溶，因此在實際應用中，需要高溶解強度時，一般用2mol／L硫脲和5～8mol／L尿素聯合使用。第8頁，課件共78頁，創作于2023年2月(二)還原劑還原劑(reducingagent)主要是用來斷裂蛋白質分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白質的溶解性。常用的還原劑有β—巰基乙醇、DTT或DTE(Dithioerythreit01)和三丁基膦(TBP)等。其中DTT是使用比較廣泛的還原劑，它在50mmol／L時能有效地還原大部分的二硫鍵，但有些蛋白質仍不能完全被還原。但是如果過分提高DTT的濃度，由于它的pKa在8左右，因而會影響到pH梯度。另外，DTT在堿性pH值下會發生去質子化，在等電聚焦時，向陽極發生遷移，使得陰極的DTT損耗而不足，導致二硫鍵復原，蛋白質沉淀。而非離子型還原劑TBP則比DTT更加有效，能大大增加蛋白質的溶解性，在低摩爾濃度下就能使蛋白質得以還原。第9頁，課件共78頁，創作于2023年2月(三)去污劑去污劑的作用主要是破壞蛋白質分子之間的疏水相互作用，提高蛋白質的溶解性，防止在等電聚焦時析出。去污劑有離子型、非離子型和兼性離子型等幾類。經常使用的去污劑有陰離子去污劑SDS，非離子去污劑TritonX-100和NP-40，兩性離子去污劑CHAPS等。原則上去污劑應該是非離子型或者是兼性離子型，這樣才不會影響蛋白質遷移到它們各自的等電點位置。離子型去污劑如SDS不利于等電聚焦，然而由于SDS的緩沖液可抑制蛋白質被內源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白質的溶解性，特別是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于樣品處理的初級階段。在SDS濃度不高于0.3％時，對等電聚焦不會產生太大的影響。現多數以兼性離子去污劑CHAPS代替。CHAPS比其他去污劑溶解疏水性氨基酸殘基的能力更強，其使用濃度一般在1％～2％。然而它在高濃度脲中的溶解度比較低，因此不斷有新的去污劑涌現出來。第10頁，課件共78頁，創作于2023年2月(四)兩性電解質載體在去污劑存在的情況下，某些蛋白質在等電聚焦的時候仍舊容易沉淀在它們的等電點上。為了防止這種現象的出現需要向蛋白質溶液中加入某些鹽類以增加蛋白質溶解度，但是與此同時這些鹽類又會使聚焦效果不理想。為了解決這個問題，通常在緩沖液中加入兩性電解質作為載體。兩性電解質能夠促進蛋白質的溶解，吸附高濃度尿素在溶液中形成的氰酸鹽離子(cyanateions)，離心時還有助于核酸的沉淀。此外，它還可以阻止樣品蛋白質和IPG膠條中固相化的兩性電解質相互作用。一定濃度的兩性電解質會提高蛋白質溶解性，在第一向等電聚焦時，提高極性端蛋白質的聚焦效果。第11頁，課件共78頁，創作于2023年2月以上介紹的是常規使用的各種裂解液成分對樣品蛋白質的作用，保證蛋白質達到最大的溶解度并適合雙向凝膠電泳。關于裂解液的配方，由于不同實驗室有著不同的習慣和需求，配方也千差萬別。Gorg總結了三種裂解液的配方：①9mol/L脲，1％(m/V)DTT，2％-4％(m/V)CHAPS，2％(V/V)兩性電解質，pH3-10和10mmol/LPefabloc蛋白酶抑制劑。②7mol/L脲，2mol/L硫脲，1％(m/V)DTIT，2％～4％(m/V)CHAPS，2％(V/V)兩性電解質，pH3～10和10mmol/LPefabloc蛋白酶抑制劑。③熱的SDS緩沖液：1％(m/V)SDS，100mmol／LTris-HCl，pH7.0，該緩沖液裂解樣品后至少3倍稀釋于1或2的裂解液中。根據目標蛋白質的特性和實驗要求，我們同樣可以摸索出更合適的裂解液配方，進行有效重復的樣品制備。第12頁，課件共78頁，創作于2023年2月三、雙向凝膠電泳常規樣品制備樣品制備時要使用新鮮的樣品或者將新鮮樣品速凍(液氮或—70℃)保存；注意防止污染，佩戴乳膠手套等。整個操作過程在冷庫或冰浴中進行，避免蛋白質的降解、修飾。下面以最簡單的培養細胞的樣品制備為例，介紹操作步驟如下。①常規細胞培養，待長至80％左右密度時，在處理前一天更換新鮮培養液。②吸去培養液，用預冷PBS清洗細胞，重復3次。③按1X106細胞加50t~l的量往培養皿中加裂解液(8mol／LUrea，4％CHAPS，40mmol／LTris，65mmol／LDTT)，刮刀收集。④進行超聲波處理，處理時間為5s，間歇時間為10s，功率為100～120W，超聲處理至溶液清澈無黏稠物為止。⑤4℃、25000g離心1h。⑥取上清測蛋白質濃度后，分裝后—70℃冰箱中凍存。第13頁，課件共78頁，創作于2023年2月四、蛋白質順序提取法由于在2-DE膠中所能顯示出的蛋白質的數量，依賴于細胞中蛋白質的拷貝數、蛋白質的上樣量及電泳后染色方法的靈敏度。為了能夠富集低拷貝蛋白質，很多實驗室采用了樣品預分級的方法，如亞細胞分級、親和分級、蛋白質復合物分級和根據蛋白質溶解性的順序提取法等。另外，窄pH范圍的lPG膠條在一定意義上也可以說是富集了低拷貝蛋白質，提高了低豐度蛋白質在2-DE中的分辨率。這里主要介紹蛋白質順序提取法，它是根據蛋白質溶解性差異，用具有不同溶解能力的溶解液進行順序提取，從而提高了樣品在2-DE中的可檢測范圍。其具體操作步驟如下所述。①溶液A(40mmol／LTris)提取：將細胞裂解，振蕩混勻，12000r／min離心8min，取上清，抽提出細胞中的可溶性蛋白質。②溶液B(8mol／L脲，4％CHAPS，25mmolDTT)提取：在上一步的沉淀物中加入溶液B，振蕩混勻，12000r／min離心8min，取上清。③溶液C(5mol／L脲，2mol／L硫脲，2％CHAPS，2％SB3—10、2mmol／LTBP)提取：上一步的沉淀物用溶液A洗2次，加溶液C，振蕩混勻，12000r／min離心8min，取上清。第14頁，課件共78頁，創作于2023年2月如有必要也可用更強烈的溶解液進行第四步提取，這樣就根據蛋白質溶解性不同，提取出了不同的蛋白質組分，對疏水性很強的蛋白質如膜蛋白和低豐度的蛋白質起了富集作用。順序提取法是目前獲得更多蛋白質點的一種良好策略。，應用雙向凝膠電泳分離手段，一步提取法一般只能獲得1000～2000個不同的蛋白質點；而使用分級順序提取方法，對不同組分進行分離，據報道能夠獲得上萬個不同的蛋白質點。在樣品量充足的情況下，先進行亞細胞器分級，然后對各個分級組分再進行順序提取，可以在一定程度上富集溶解度差及低豐度的蛋白質，盡量把細胞中的全部蛋白質提取出來。第15頁，課件共78頁，創作于2023年2月五、注意事項以上介紹的是雙向凝膠電泳蛋白質樣品制備的一些常規方法。然而這些制備方法并不是十分完善的，相信隨著不斷的實驗探索，會有更理想的制備方法出現。但不管采用什么方法，都應該注意以下問題。①在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重復性。因此，在樣品制備過程中可選擇合適的增溶試劑(如脲、硫脲等)，以減少疏水性蛋白質的損失。②選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質復合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。③盡量除去核酸、多糖、脂類等于擾分子。④防止蛋白質在樣品處理過程中的人為修飾，制備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾(建議加入合適的蛋白酶抑制劑)；含有脲的試劑不要加熱(溫度不高于37℃)，避免尿素分解產生的異硫氰酸鹽引起氨基甲酰化而導致電荷的不均一性；佩戴乳膠手套，減少來自頭發和皮膚的角蛋白污染。⑤裂解液新鮮配置，分裝后置—80℃冰箱中保存，注意不要反復凍融。⑥樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或者直接以液體狀態置-80℃冰箱中保存，但要注意不要反復凍融。第16頁，課件共78頁，創作于2023年2月第二節培養細胞蛋白質樣品的制備在蛋白質組研究中，我們經常利用細胞培養技術，觀察細胞在不同生理條件下的蛋白質動態變化。下面主要介紹關于細胞破碎樣品的幾種制備方法。一、細胞破碎的處理方法細胞破碎主要包括機械和化學方法兩種。由于在細胞破碎時會釋放出一些蛋白酶及其他引起蛋白質修飾的酶。為了避免這種情況，樣品中應加蛋白酶抑制劑，同時盡量將樣品直接加入強變性裂解液中，在低溫及使用預冷的溶液下進行操作。根據裂解程度的不同，細胞破碎方法又可分為以下兩種。

(一)溫和的裂解方法裂解對象主要是一些容易裂解的細胞，如組織培養細胞、血細胞和微生物等。同時溫和裂解方法可用于一些亞細胞分級產物，如線粒體、高爾基體和膜等。有時在制備樣品的時候需要多種裂解方法綜合使用來獲得目標蛋白質。如表13.1所示為溫和裂解方法的應用對象和操作步驟。第17頁，課件共78頁，創作于2023年2月(二)更強烈的破碎方法當破碎不容易破碎的細胞如固體組織中的細胞或有堅韌細胞壁的細胞時，需要采用更強烈的破碎方法對細胞進行破碎裂解。這些方法可使細胞完全破碎裂解，但在操作過程中應避免產熱及產生泡沫。主要的方法如表13.2所示。第18頁，課件共78頁，創作于2023年2月二、培養細胞總蛋白質的提取裂解液裂解方法是很多實驗室常用的裂解組織培養細胞的樣品制備方法。下面就裂解液裂解方法展開討論，以下的操作過程均在冰浴中進行。這里所涉及的裂解液成分為：8mol/L脲，65mmol/LDTT，4％CHAPS，40mmol/LTris。

1．胰酶酶解后裂解細胞培養在直徑為10cm的培養皿中，待培養至80％左右密度時，以含0.02％EDTA的0．05％胰蛋白酶消化，細胞經預冷的PBS漂洗3次，離心收集在1．5ml離心管中，加450μl裂解液，反復吹打。

2．皿上直接裂解細胞培養在直徑為10cm的培養皿中，待培養至80％左右密度時，細胞用預冷的PBS漂洗3次，加450~1裂解液，細胞刮刀收集，用移液器轉移至1.5ml離心管中，反復吹打。第19頁，課件共78頁，創作于2023年2月3．熱SDS裂解細胞培養在直徑為10cm的培養皿中，待培養至80％左右密度時，細胞用預冷的PBS漂洗3次，加450μl熱的SDS裂解液(每10ml中，10％SDS300μl，β-巰基乙醇100μl，1.5mol/LTris·HCl，pH8.8，300μl，去離子水9.3ml)，細胞刮刀收集，用移液器轉移至1.5ml離心管中，反復吹打后，把離心管置人液氮中迅速冷凍。在不加熱情況下，真空離心凍干樣品。用原來體積的樣品緩沖液重新溶解樣品(100ml中，尿素59.7g，NP-404g，DTT1.54g，兩性電解質pH3～105.5g，去離子水44.9m1)。最終所有的樣品用超聲細胞破碎儀超聲處理，超聲時間為5s，間歇時間為10s，功率為100～120W，超聲處理至溶液清澈無黏稠物為止，處理過程在冰浴中進行。超聲處理后，4℃、25000g離心1h。取上清進行蛋白質濃度測量，按實驗所需的量分裝后—80℃冰箱中保存備用。第20頁，課件共78頁，創作于2023年2月以上為貼壁培養細胞的樣品制備方法，至于懸浮培養的細胞(包括植物細胞)，常規的處理方法就是離心收集細胞；用預冷PBS清洗3次；加裂解液進行處理；進行超聲波處理；離心收集上清。注意無論是如何處理細胞，樣品最終的蛋白質濃度不要低于0.1mg/ml，最合適的濃度為1—5mg/ml(一般來說1X107個動物細胞能得到lmg蛋白質)。因為樣品濃度過小，會使相對鹽濃度增大，從而影響了等電聚焦。第21頁，課件共78頁，創作于2023年2月第三節組織樣品制備一、概述以疾病組織為實驗材料的蛋白質組學研究，因為真實地反映機體內環境的情況，既可以為疾病的早期診斷提供新的特異性的候選標志，又能夠為疫苗的研制尋找新的特異性的候選抗原，同時可以監測、跟蹤疾病的發展及預后情況，并為認識發病機制、明確疾病的分型、分級、分期提供線索。因此，疾病組織的蛋白質組學研究有著不可替代的臨床意義及應用前景。另外，由于水稻和擬南芥這些植物基因組序列測定的完成，隨之而來的問題是如何應用高通量的技術去研究其復雜的蛋白質網絡。因此植物蛋白質組研究也越來越受到關注，對農業生產必將會產生巨大的影響，如現在的育種也將從以前的通過個別基因的轉移來改進個別性能，發展到整體性能的改善。植物蛋白質組的研究在以農業為本的國家里，有著更豐富的內涵。然而由于動物組織與植物組織雖然同是組織樣品，但是各有其物化特性，所以制備方法也不盡相同。有些制備方法可以借鑒通用，有些則必須根據其特有的性質和要求做相應的改變。第22頁，課件共78頁，創作于2023年2月二、動物組織樣品的制備對于取材于機體組織樣品的制備，不均一性和易污染性一直是技術發展的癥結所在。如何從多細胞、不均一的體系中獲取特定類型的細胞、亞細胞結構甚至特殊的蛋白質復合體，同時又避免各種血漿蛋白質、基質組分以及壞死組織成分的污染，是各類組織樣品制備方法必須考慮的問題。早期組織樣品采用酶解樣品制備法(enzymatmsamplepreparation，ESP)，即酶解、抽提細胞然后以Percoll梯度離心等方法分離。由于酶解處理會導致蛋白質圖譜的改變，ESP已很少使用。目前，動物組織樣品常采用非酶解樣品制備法、純化法和微切割法進行制備。第23頁，課件共78頁，創作于2023年2月(一)非酶解樣品制備法(nonenzymaticsamplepreparation，NESP)2．試劑RPM11640緩沖液Percoll／PBS溶液，DNaseI溶液，RNaseA溶液，上樣緩沖液第24頁，課件共78頁，創作于2023年2月3．操作步驟

(1)細胞的提取手術切除的組織塊迅速置于冰上，快速切成幾個肉眼可見、無壞死區域的小塊(備份的原材料可用于平行的組織病理學、細胞學、免疫組化等實驗)。用預冷的RPM11640緩沖液洗滌組織小塊數次，根據組織病理學特征及組織塊的大小+選擇合適的細胞提取方法。①壓擠(squeezed)：在約0.5ml預冷的RPM11640緩沖液中，通過切、壓、剁得到微小的碎片，添加緩沖液至1～2ml。②刮擦(scraped)：以鋒利的解剖刀刀鋒輕刮新鮮切出的組織小塊的截面，所得細胞置于1～2ml預冷的RPM11640緩沖液中。③針頭吸取(NeedleAspiration)：用0．7mmol／L孔徑的針頭，收集約1000萬個細胞于1～2ml預冷的RPM11640緩沖液中。第25頁，課件共78頁，創作于2023年2月(2)去除組織碎片及紅細胞①先以兩層直徑10mm的尼龍網眼過濾器重懸細胞。尼龍網眼過濾器上層孔徑為250μm，下層孔徑為100μm(可根據組織細胞的實際大小選擇合適的上下濾器孔徑)。這一步對以刮擦法或壓擠法提取的細胞懸液尤其重要，因為其中不可避免地混有黏連組織和成纖維細胞等雜質成分。②所得的細胞重懸液用1.2mm的長針頭(連在2ml注射器上)轉移至新的Effendorf管中，小心加入1.0—1.5ml預冷的Percoll／PBS溶液，使得重懸細胞浸沒其中。③于4℃，在低加減速率下(1000g)離心10min。第26頁，課件共78頁，創作于2023年2月

(3)收集并洗滌細胞①用連在2ml注射器上0.7mm的針頭挑取收集分界面處的細胞層，注意盡量減少Percoll及RPM11640緩沖液的污染。根據細胞的多少用適當體積的預冷的Percoll／PBS溶液洗滌。②若細胞層薄甚至幾乎透明，洗滌后的細胞收集在體積小于0.4ml的PBS／PIH溶液中，在盛入1.5ml預先稱重的Effendorf管中，加滿PBS／PIH溶液后，4℃、800g離心3min，沉淀物中的細胞顆粒重懸于PBS溶液中。若細胞層較厚，洗滌后的細胞收集在體積小于lml的PBS／PIH溶液中，然后轉移人10～12ml的玻璃離心管中，加入5～6ml預冷的PBS／PIH溶液后，4℃

、800g離心3min，沉淀物中的細胞顆粒重懸于1～2個盛有預冷的PBS溶液并預先稱重的Effendorf管中。③于4℃

、2700g離心5min，小心去除所有的上清及Effendorf管內外管壁黏著的液滴。稱重并計算所得細胞的凈重(wetweight，WW)后—80℃凍存。第27頁，課件共78頁，創作于2023年2月(4)細胞裂解及核酸降解①按細胞凈重(mg)：mQ水(μl)=1:1.89的比例，在凍存細胞中加入相應體積的mQ水，冰上制成細胞重懸液。反復凍融4次以破碎細胞。②依次加入(0.089XWW)μl10％SDS/33.3％Mercapthoethanol，(0.329XWW)μlDNaseI溶液和RNaseA溶液，冰上靜置5min。③冷凍干燥降解核酸后的樣品。④凍干的蛋白質樣品溶解在(6XWW，或3XWV／若WW<10mg)Pl適當的上樣緩沖液中，混勻后靜置3h使樣品中的蛋白質充分溶解(有文獻報道只需5min即可)。4℃12000r／min離心15rain，上清小心轉移入新的Effendorf管中，－80℃凍存。第28頁，課件共78頁，創作于2023年2月(二)純化法由于方法所限，NESP法制備的組織樣品，無法完全去除血漿蛋白質、基質組分以及壞死組織成分的污染，而且也不能排除機體組織中其他類型細胞的干擾。因此，在用NESP法制備成細胞懸液后，常常添加抗體純化、流式細胞儀純化或選擇性的細胞培養建立不同的細胞株系。但純化出單一類型的細胞有可能會丟失一些系統性信息，例如，細胞間基質與細胞間、不同類型細胞間的相互作用等信息。據報道，不經流式細胞儀純化，僅用NESP法制備的組織樣品中基質信息仍可以保留，因此，應注意根據具體情況設計對照和并行實驗。第29頁，課件共78頁，創作于2023年2月1．抗體純化法(antibodypurification)2．流式細胞儀純化法

3．建立細胞株系法第30頁，課件共78頁，創作于2023年2月

流式細胞儀就是進行流式細胞分析的儀器，它集電子技術、計算機技術、激光技術、流體理論于一體，是一種非常先進的檢測儀器。第31頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀的特點單個細胞分析同時多參數分析速度快：10000個細胞/秒統計學意義：提供細胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細胞第32頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀的原理流式細胞儀的應用流式細胞儀的數據處理第33頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀儀器結構液流系統光學系統

激光光源 光收集系統電子系統

光電轉換 數據處理系統第34頁，課件共78頁，創作于2023年2月原理：

細胞被戴上特殊的標記。所用的標記細胞的探針是能夠同待分選細胞表面特征性蛋白(抗原)結合的抗體，而這種抗體又能夠同某種熒光染料結合。被結合的細胞帶上了熒光標記。當稀釋的細胞進入超聲波振蕩器時，極稀的細胞懸浮液形成很小的液滴，一個液滴中只含有一個細胞。液滴一旦形成并通過激光束時，激光束激發結合在細胞表面抗體分子。第35頁，課件共78頁，創作于2023年2月InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid第36頁，課件共78頁，創作于2023年2月熒光染料及其發射波長FITC525nmPE575nmPI630nm自發熒光與特異熒光第37頁，課件共78頁，創作于2023年2月抗體的選擇首選直接標記抗體熒光分子PE最強，適用于弱表達抗原

FITC最便宜，適用于強表達抗原間接標記：一般不提倡用第38頁，課件共78頁，創作于2023年2月實驗對照的設計空白對照：ALL陰性對照：常用同型抗體對照單色分析：設同型抗體對照多色分析：同型對照，單陽性對照（用于儀器校正）陽性對照：檢測陰性時第39頁，課件共78頁，創作于2023年2月實驗標本的處理單細胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標記分子的染色：抗原抗體反應非特異結合的去除：洗滌和封閉封閉：血清和同型抗體第40頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀的樣品要求單細胞懸液被檢細胞或顆粒大小0.2－80um樣品中至少20000個細胞，濃度105-107個/毫升第41頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀的光學系統激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩定光照激光波長:臺式機為固定波長488nm,635nm，大型機波長譜線寬包括325，457.9，488,514.5，520.8，530.9，568.3，633，647nmand紫外光UV。光收集系統是由若干組透鏡,濾波片,小孔組成，將產生的光信號引導至檢測器第42頁，課件共78頁，創作于2023年2月ForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser第43頁，課件共78頁，創作于2023年2月90DegreeLightScatterFALSSensor90LSSensorLaser第44頁，課件共78頁，創作于2023年2月LaserFluorescenceDetectorsFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)PurdueUniversityCytometryLaboratories第45頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀的光學系統第46頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。第47頁，課件共78頁，創作于2023年2月1流式細胞儀的散射光信號FSC:表示細胞大小SSC：表示細胞內顆粒的復雜程度第48頁，課件共78頁，創作于2023年2月外周全血細胞散射光雙參數點圖

（紅細胞溶解后）第49頁，課件共78頁，創作于2023年2月2，熒光信號熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉換為 振動能和熱能 釋放較入射光波長更長的光量子熒光素與特異抗體結合熒光抗體與細胞抗原結合越多，產生的熒光信號越強 第50頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀的電子系統進行信號檢測和分析：當細胞攜帶熒光素標記物,通過激光照射區時,受到激發,產生不同波長的、代表細胞內不同物質的熒光信號熒光信號由光電接收器接收，轉變為電信號，可分析電壓脈沖的高度、面積和寬度電脈沖信號經A/D轉換成數字信號數字信號傳送到計算機，進行儲存、作圖、統計分析第51頁，課件共78頁，創作于2023年2月當含細胞的液滴逐個通過激光束時，受到兩種檢測器的檢測:如果液滴中含有細胞就會激活干涉檢測器(interferencedetector)，只有帶有熒光標記細胞的液滴才會激活熒光檢測器(fluorescencedetector)。當帶有熒光標記的液滴通過激光束時，將兩種檢測器同時激活，引起液滴充電信號使鞘液帶上負電荷。由于液滴帶有負電荷，移動時就會向正極移動，進入到熒光標記細胞收集器中。細胞分選的原理第52頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀

分選系統488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector第53頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀的應用第54頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀的科研應用細胞表型分析胞內細胞因子的檢測染色體分類研究細胞周期和DNA倍體分析流式標準小球定量分選細胞內鈣離子測量第55頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀的數據處理第56頁，課件共78頁，創作于2023年2月數據處理檢測數據的顯示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為細胞數目。對于雙參數或多參數數據，既可以單獨顯示每個參數的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。第57頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀數據分析（1）直方圖分析第58頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀數據分析（2）點圖分析第59頁，課件共78頁，創作于2023年2月流式細胞儀數據分析（3）等高圖和密度圖分析第60頁，課件共78頁，創作于2023年2月Gating第61頁，課件共78頁，創作于2023年2月(三)微切割法1．人工微切割法(manualmicrodissection)2．激光微切割(lasermicrodissection)(四)其他方法1.組織芯片2.質譜成像術

第62頁，課件共78頁，創作于2023年2月激光捕獲顯微切割技術（LCM）激光捕獲顯微切割（LCM）技術，可從所需標本不同成分中獲取純凈的細胞，甚至可從同一標本的不同階段和不同部位獲取材料。目前，LCM廣泛用于腫瘤學、細胞發生學和其他學科的研究

第63頁，課件共78頁，創作于2023年2月第64頁，課件共78頁，創作于2023年2月激光捕獲的原理及過程在顯微鏡下，依據細胞或組織形態學特征、免疫組織化學表型，甚至由雜交技術獲得的基因型，來選擇感興趣的細胞。然后，連同膜一起放入裂解液依據不同的研究目的提取DNA、RNA、酶、或者蛋白質進行分析。

第65頁，課件共78頁，創作于2023年2月LaserCaptureMicrodissection

1.Preparetissue2.Locatecells3.Placecap4.Pulselaser5.Removecap6.Extractmolecules第66頁，課件共78頁，創作于2023年2月激光掃描共聚焦顯微技術激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)是在普通熒光顯微成像基礎上加裝了激光掃描裝置，并利用計算機圖形處理技術，應用紫外或可見光激發熒光探針，得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像。

第67頁，課件共78頁，創作于2023年2月激光共聚焦顯微術的圖像處理功能與應用1．“細胞CT”功能：為分子細胞生物學的深入研究拓寬了視野。2．三維成像與細胞內部結構圖像相結合的功能：可以將斷層圖像與三維重建圖像有機地相結合，能揭示細胞內部的結構和提供細胞的長、寬、厚、斷層面積、細胞體積等參數．給人以三維立體的概念。3．將形態學、生理學與分子細胞生物學的研究相互結合：利用LSCM不但可以觀察細胞形態的動態變化，而且用適當的熒光探針可以觀察細胞內部的生物化學變化。第68頁，課件共78頁，創作于2023年2月WHATISCONFOCALMICROSCOPY

Theresolutionofimagesobtainedwithconventionalmicroscopyareseriouslydeterioratedbythe"contamination"oftheimageplanewithout-of-focuslightWIDEFIELDCONFOCAL第69頁，課件共78頁，創作于2023年2月三、植物組織樣品的制備上面提到的動物組織樣品的制備方法有些對植物組織同樣適用，但應根據植物組織的特點，在應用時而做相應的改進。由于植物組織含有堅韌的細胞壁和復雜的細胞外基質等，所以，在樣品制備時要采用更強烈的破碎方法才能破碎細胞獲得樣品。對于植物材料來說，標準的蛋白質提取方案是在TCA丙酮溶液中沉淀蛋白質，然后用含去污劑的裂解液來溶解沉淀。這種方法的優點是：克服在單位質量的植物組織中蛋白質提取量低的問題；去除了植物次級代謝產物帶來的影響；使植物體內高活性的蛋白酶失活，避免了蛋白質被降解修飾。其缺點在于由于不充分地沉淀和溶解而選擇性地丟失某些蛋白質。第70頁，課件共78頁，創作于2023年2月(一)TCA／丙酮法

簡單的植物樣品制備可在加裂解液的情況下，在TCA的丙酮溶液中進行勻漿破碎處理，然后離心獲得。下面以擬南芥幼葉(greedleave)為例介紹，具體操作步驟：①稱取新鮮的嫩葉200mg，洗凈。②使用液氮速凍，進行研磨，加含0.07％巰基乙醇，10％TCA的丙酮溶液，低溫研磨45min。③35000g離心15min，用0.07％巰基乙醇，1mmol／LPMSF和2mmol／LEDTA溶液清洗沉淀，然后凍干。④每10mg凍干粉末中加250μl樣品裂解液(9mol／L尿素，2％兩性電解質pH3～10，60mmol／LDTT，0.5％TritonX—100和0.003％溴酚藍)。⑤攪拌情況下在37℃溫浴30rain。⑥19000g離心15min，取上清。第71頁，課件共78頁，創作于2023年2月四、注意事項一般而言，無論動物組織還是植物組織，在樣品制備時都必須注意以下幾點。①盡量使用新鮮的組織制樣，如需保存，則應該迅速冷凍保存在液氮或-80℃低溫冰箱中。②使用預冷的緩沖液，整個操作過程應該在冷庫或者冰浴中進行，以避免隨機的物質降解。③大部分的非目標組織應先切成小塊并洗滌除去。④使用蛋白酶抑制劑，避免蛋白質的降解和修飾。⑤少量的核酸不會引起蛋白質聚集影響等電聚焦，但是大量的樣品制備時必須用核酸酶進行處理；另外也要去除多糖等干擾分子。第72頁，課件共78頁，創作于2023年2月第四節分泌蛋白質樣品的制備細胞分泌蛋白質主要包括細胞因子、生長因子和激素等具有重要功能的生物活性分子。分泌蛋白質的重要性決不亞于胞內蛋白質或膜上受體蛋白質，如致病細菌的分泌蛋白質往往含有致病或毒性因子，對于疾病的病理研究和抗生素開發等具有重要意義；真核細胞的分泌蛋白質負責細胞的自反饋調節以及細胞間的近程或遠程的信號傳導，在研究信號傳導通路、癌細胞生長轉移和免疫調節等方面具有十分重要的作用。因此，借鑒蛋白質組的重要意義和手段，分泌組(secretome)這一概念也應運而生，即指一個有機體所有的分泌蛋白質。第73頁，課件共78頁，創作于2023年2月一、真核細胞的分泌蛋白質樣品制備培養細胞的分泌蛋白質就在細胞培養液中，收集分泌蛋白質要注意兩點：一是細胞需無血清培養基培養，或在血清培養基中培養至一定密度后無血清培養，以避免血清中的蛋白質混在分泌蛋白質中；二是脫鹽和濃縮，由于培養液中有大量的鹽，并且體積較大，分泌蛋白質相對濃度很低。通常采用分子超濾膜，將脫鹽和濃縮一次完成，具體操作步驟如下所述:①細胞在含血清的培養基中培養(或直接用無血清培養基培養)。②待細胞密度培養至80％左右時，換無血清培養基，處理6h③收集培養液，離心去除細胞碎片，取上清，加蛋白酶抑制劑。④使用Millipore公司的15ml規格的YM-3超濾管進行超濾濃縮，降低相對鹽濃度。⑤濃縮樣品經稀釋后，再超濾，降低絕對鹽濃度。⑥最終濃縮樣品加常規裂解液，蛋白質定量后，分裝凍存。一般而言，200ml培養液中只能提取到2mg左右的蛋白質。對體積如此之大的培養液進行超濾需要很長時間。為了防止蛋白質降解和修飾，離心超濾過程應該在4℃進行。第74頁，課件共78頁，創作于2023年2月二、細菌分泌蛋白質樣品制備細菌蛋白質分泌是一個復雜的多階段的過程，對細菌的膜和細胞壁的生物合成以及細菌的存活是必不可少的。Economou把細菌分泌途徑分成三個明顯的階段，第一階段為靶向階段，在導航因子的幫助下，靶向細胞膜；第二階段為穿膜階段；第三階段為成熟釋放階段。一般意義上獲得的分泌蛋白質為成熟釋放到培養液中的分泌蛋白質。下面以幽門螺桿菌分泌蛋白質樣品的制備為例，介紹細菌分泌蛋白質樣品的制備過程。①細菌培養到一定密度后，在4℃下20000g離心15min。②取上清，0．45μm濾膜過濾，去除殘余