第四章DNA重組和基因轉移第一節目的基因與載體的連接一粘末端DNA片段的連接（一）具有相同粘末端的DNA分子之間的連接

使用堿性磷酸酶處理載體DNA，去掉其5’末端的磷酸基，以防質粒DNA的自身環化。（二）具有不同粘性末端的DNA分子之間的連接

用兩種不同的限制性內切酶對載體和外源DNA進行切割后，在它們兩端會產生非互補的突出端，經DNA連接酶連接后即產生定向重組體。

HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI對載體酶切HindIIIEcoRI對基因酶切質粒載體的定向重組二平末端DNA片段的連接1直接用T4連接酶連接2同聚物加尾法3銜接物連接法銜接物是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成，具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。所謂載體與DNA片段酶切位點不匹配，指載體與待克隆的DNA片段上的酶切位點不相同，因而用一種或兩種酶切制造不出可互補的粘性末端。

1按照平末端連接方法加上接頭2將凹端變為平端（1）使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3′凹端完全補平。（2）用S1核酸酶去除3′突出末端產生平端DNA分子

三載體與DNA片段酶切位點不匹配的連接3使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補平3′凹端轉變成粘端。載體經XhoI酶切形成：外源基因用San3A酶切形成：用Klenow酶部分補平二者的3′凹端，形成：TCGAAGCTGATCCTAGCTTCAGGA這樣，就可以實現有效重組。TCGAAGCT3′3′5′5′GATCCTAG3′3′5′5′四cDNA與載體的連接通過依次加入、連接合成的DNA接頭進行cDNA克隆第二節重組DNA分子的篩選與鑒定外源基因與載體連接后轉化大腸桿菌可能的三種情況：（2）（3）（1）轉化E.coli一遺傳檢測法（一）根據載體表型特征選擇重組體分子1抗藥性標記插入失活篩選法例：pBR322如果外源基因插入到tetr基因內部，tetr抗性消失，表型為不抗四環素（tets）、而仍抗氨芐青霉素（ampr），這樣的轉化細胞在含有

amp的培養基仍可生長，但在含有四環素的培養基上不能再生長；反之，如果ampr基因由于外源基因插入其內部而失活，帶有重組DNA分子的轉化細胞在含有tet的培養基平板上生長，在含有

amp的培養基不能生長。

例:pUC質粒在LacZ—的大腸桿菌中，在平板培養中，菌落是白色的。若在該細胞中引入pUC質粒，其上有LacZ′，質粒和大腸桿菌DNA可實現α—互補，菌落呈藍色。如果在質粒的多克隆位點的某個酶切點上克隆了外源基因，則LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。

（二）根據插入序列的表型特征選擇重組體

進入受體細胞的重組DNA分子中的外源基因如果在宿主細胞中能實現功能表達，產生出有功能活性的基因產物，那么鑒定此種重組體最簡便的方法就是表型特征的直接選擇法。

2α—互補二物理檢測法凝膠電泳檢測法三核酸雜交檢測法

例：原位雜交篩選重組體菌落(或噬菌斑)四免疫化學檢測法

免疫化學檢測法是利用抗體與抗原結合的高度特異性來鑒別基因的。如果某個重組克隆中的外源基因能夠表達，在這個克隆中就存在著這個基因的特定蛋白，即可用特異性抗體來檢測。常用的有標記抗體測定法和免疫沉淀測定法兩種。標記抗體測定法的步驟：轉化菌落影印平板置于含氯仿飽合氣體的容器細菌裂解，抗原釋放覆蓋吸附有未經標記的抗體的NC膜形成抗原抗體復合物將NC膜與I125標記的抗體溫育

放射自顯影與母板對照，挑取所需的重組克隆

用免疫化學法檢測克隆在表達載體pUC8上的基因第三節基因轉移方法一重組DNA導入大腸桿菌

（一）轉化

將外源DNA分子導入某一宿主細菌細胞的過程都叫轉化。

為了有效地使細菌吸收外源的DNA分子，我們通常要對它們進行一些物理或化學的處理，處理后的細胞吸收外源DNA的能力大大提高，被稱為感受態細胞。對于大腸桿菌細胞，一般采用50mmol/L的CaCl2溶液來制備感受態細胞。（1）吸附階段：完整的雙鏈DNA分子吸附于感受態細胞表面（2）轉入階段：雙鏈DNA分子解鏈，以單鏈形式進入細胞，而另一鏈則被降解

（3）自身穩定階段：外源質粒在細胞內又復制成雙鏈環型DNA（4）表達階段：即目的基因隨質粒的復制子一起復制