制漿造紙中漆酶的應(yīng)用

油漆是一種含有四個(gè)銅離子的多酚氧化酶。這是1883年yoshida在漆樹上首次發(fā)現(xiàn)的。貝爾特發(fā)現(xiàn)它也存在于真菌中，并被稱為“l(fā)acase”?，F(xiàn)在知道,漆酶廣泛存在于擔(dān)子菌(Baidimycetes)、多孔菌(Polyporus)和子囊菌(Asomycetes)中,但其中最主要的生產(chǎn)者是擔(dān)子菌中的白腐菌。近年來,漆酶作為一種具有很大潛在應(yīng)用價(jià)值的酶越來越引起國內(nèi)外的重視。它主要分布在一些高等植物如漆樹及一些真菌如白腐菌中。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道。有些細(xì)菌也可以產(chǎn)生漆酶。一般來說真菌漆酶研究得最廣泛。它是一種胞外酶?？梢酝ㄟ^微生物培養(yǎng)或基因工程的方法大量生產(chǎn)得到。漆酶是近年發(fā)現(xiàn)在造紙工業(yè)中最具潛力的生物酶,具有催化氧化木素的能力。漆酶能選擇性地催化木質(zhì)素降解,不會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì),并且生產(chǎn)在常溫、常壓的溫和條件下進(jìn)行,節(jié)約設(shè)備和能耗。木材中的親脂性抽出物是指木材中的樹脂成分,這些樹脂包括單寧、脂肪酸、樹脂酸以及甘油三酸酯等。漆酶在一定程度上可與這些樹脂反應(yīng),漆酶是一種非專一型多酚氧化酶酶,可以催化氧化好氧污染物的酚羥基基團(tuán),生成苯氧自由基和水。StinaKarlsson等使用來自毛栓菌(TrametesHirsuta)和長絨毛栓菌(Trametesvillosa)的兩種不同漆酶處理樹脂酸和脂肪酸懸浮液,通過色譜分析觀察到諸如亞油酸、油酸、松香酸和新松香酸的數(shù)量明顯減少,它們產(chǎn)生的漆酶似乎非常有效地氧化這些含共軛雙鍵的結(jié)構(gòu)反應(yīng)。漆酶可以催化空氣中的氧氣直接氧化分解各種酚類染料、取代酚、氯酚、硫酚、雙酚、芳香胺等。在漆酶介體(HBT、ABTS等)存在下,漆酶還可以催化降解與木質(zhì)素相關(guān)的二苯基甲烷及二噁英等。由于它具有相當(dāng)廣泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性。因此漆酶在造紙工業(yè)廢水等方面有著非常巨大的應(yīng)用前景。1反氯酚衍生物改性法傳統(tǒng)制漿廢水的生物處理方法,是利用好氧及厭氧生物,但該法處理氯漂廢水時(shí),只能部分去除一些碳水化合物,而對(duì)氯酚等芳香化合物去除能力極為有限。造紙廢水中的酚類化合物以及它們的衍生物是有毒性的,是高危險(xiǎn)的污染物,傳統(tǒng)的去除氯酚及其衍生物毒性的方法是使用物理化學(xué)方法,包括溶劑抽提、超濾、活性炭吸收、化學(xué)法氧化。但這些方法存在許多缺點(diǎn),比如:高成本、效率較低以及只能處理酚類濃度有限的廢水。在處理此類造紙廢水方面,漆酶及能產(chǎn)生漆酶的真菌已顯示出它特有的作用。與一般方法相比,采用漆酶處理造紙廢液中有機(jī)氯化物,具有催化效能高,反應(yīng)條件溫和,對(duì)反應(yīng)條件及反應(yīng)設(shè)備的要求不苛刻等優(yōu)點(diǎn)。1.1漆酶氧化非酚型木素的反應(yīng)途徑漆酶催化木素酚類物質(zhì)的氧化反應(yīng)途徑如圖1所示。漆酶利用分子氧,氧化木素酚型結(jié)構(gòu)單元成為酚氧游離基,同時(shí)還原分子氧生成水。酚氧游離基可以提高酚型木素模型物的降解反應(yīng)速率,但酚氧游離基同時(shí)具有聚合和解聚的兩種傾向。解聚反應(yīng)可由該酶催化反應(yīng)使芳香-烷基鍵斷裂,生成醌類化合物和Cα-羰基木素的形成,為進(jìn)一步使木素解聚打下了基礎(chǔ)。另一種酚氧游離基聚合反應(yīng),形成更高分子量的木素結(jié)構(gòu)。漆酶只能氧化酚型木素,其主要原因是它的氧化還原電位較低,不足以氧化非酚型的木素。漆酶在介體的參與下,對(duì)非酚型木素結(jié)構(gòu)單元具有較強(qiáng)的氧化能力。其反應(yīng)速度是LiP和MnP的10~100倍,其聚合作用也受到限制。圖2為漆酶/ABTS介體系統(tǒng)氧化非酚型木素的反應(yīng)途徑。漆酶在反應(yīng)介體和氧存在的前提下,該氧化反應(yīng)才能進(jìn)行。介體ABTS的作用可能是通過電子轉(zhuǎn)移使酶激活,使O2還原成水,木素非酚型化合物則生成酚氧游離基。而后的非酶催化反應(yīng)使烷基-芳基鍵斷裂,生成醌類木素化合物或者是形成α-羰基木素化合物,為木素的進(jìn)一步降解打下基礎(chǔ)(如圖2所示)。付時(shí)雨研究了漆酶/NHA對(duì)葦漿殘余木素的作用,殘余木素在反應(yīng)后甲氧基、酚羥基減少,醇羥基和羰基增多,木素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了開環(huán)反應(yīng)。1.2真菌產(chǎn)漆酶的能力氯化木素及其氧化產(chǎn)物是漂白廢水顏色和毒性的主要來源。據(jù)DecJ等研究發(fā)現(xiàn),漆酶的去毒作用是通過酚的聚合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的,漆酶可催化氯酚生成低聚物,聚合產(chǎn)生的不溶性沉淀可以通過沉降、過濾去除,這樣可以去除濃度高達(dá)1600mg/L的取代酚。另外,研究表明,各種真菌系統(tǒng)中的漆酶都能迅速地將許多有毒的多氯酚和愈創(chuàng)木酚部分脫氯,但2-氯酚和4-氯酚除外。據(jù)林鹿等研究發(fā)現(xiàn),漆酶可以脫除桉木硫酸鹽漿CEH漂白廢水中40%以上的有毒物質(zhì)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,芬蘭制漿造紙研究院以磺化木素為底物對(duì)一系列真菌產(chǎn)漆酶的能力進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),研究表明:被測的24種真菌中有16種在培養(yǎng)中對(duì)亞硫酸鹽廢液中的木素有顯著的聚合作用。亞硫酸鹽漿廢液經(jīng)超濾后,加入漆酶后曝氣1h,曝氣前分子量>500000g/mol的木素磺酸鹽分子所占比例<1%,曝氣后分子量>500000g/mol的木素磺酸鹽分子所占比例超過40%。其中擔(dān)子綱(basidiomycete)白腐菌處理含有高濃芳香類化合物廢水已廣泛研究,選擇各種菌對(duì)來自制漿和漂白過程中的廢水進(jìn)行除色和解毒,其中包括黃孢原毛平革菌(Phanerochaerechrysosporium),彩絨革蓋菌(Coriolusversicolor)和裂褶菌(Schiophyllumcommune),能顯著降低廢水顏色和COD含量。廢水中的木素和多酚類化合物先通過與漆酶反應(yīng)被氧化形成游離基或反應(yīng)活性的醌類物質(zhì),然后這些物質(zhì)互相偶合或發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)生成高分子化合物,降低這些有毒物質(zhì)的溶解度,從而除去含氯物質(zhì),減少其毒性。利用白腐菌漆酶去除水中的氯酚類化合物時(shí),加入適量的愈創(chuàng)木酚和2,6-二甲基苯酚,能有效地使氯酚類化合物沉淀下來,可提高酶去污效率;另外,XavierFont等使用白腐菌處理造紙廢水,除去其中的顏色、芳香族化合物以及COD含量,結(jié)果表明漆酶的產(chǎn)量與毒性的減少呈線性關(guān)系。另外,木材剝皮廢水中含有有色的酚型化合物,使用漆酶處理該廢水,通過催化氧化聚合反應(yīng),可去除90%以上的鞣酸類和其他酚型化合物,廢水經(jīng)硫酸鋁絮凝后,可除去82%的色度。同樣的混合廢水經(jīng)漆酶處理1h隨后經(jīng)硫酸鋁絮凝,由色譜分析證實(shí)86%的氯代酚、99%的氯代愈瘡木酚和80%的氯代香草醛、92%的氯代兒茶酚可被去除掉。2化合物的結(jié)構(gòu)表征至今為止人們對(duì)漆酶在木質(zhì)素降解過程的機(jī)制和作用還不完全清楚。作為一種多酚氧化酶,它可催化氧化酚類或芳胺類等多種底物。氧化酚或芳胺時(shí)先失去一個(gè)電子生成自由基,后者發(fā)生一系列非酶反應(yīng),氧化成醌,在有O2存在時(shí),還原態(tài)漆酶被氧化,O2還原成水。底物自由基不穩(wěn)定,可進(jìn)一步發(fā)生鍵的斷裂或生成,導(dǎo)致裂解或聚合反應(yīng)。因此,底物分子可進(jìn)一步聚合生成復(fù)雜的產(chǎn)物,也可催化芳香環(huán)支鏈Cα-Cβ鍵斷裂。木素中主要的易受漆酶攻擊的特征功能基是苯環(huán)上的酚羥基和甲氧基,尤其是酚羥基,特別容易受漆酶的攻擊。一般認(rèn)為,漆酶處理有機(jī)氯化物的機(jī)理是:在有氧條件下,氯酚底物先通過與漆酶反應(yīng)被氧化形成游離基或反應(yīng)活性的醌類物質(zhì),然后這些物質(zhì)互相偶合或發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)生成高分子化合物,降低這些有毒物質(zhì)的溶解度,從而除去含氯物質(zhì),減少其毒性。這一反應(yīng)機(jī)理包括酚上一電子和一質(zhì)子轉(zhuǎn)移形成一自由基,該自由基具有3種共振形式,化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定。如圖3。如果苯環(huán)上的三個(gè)活性位置有兩個(gè)被取代基取代時(shí),則反應(yīng)通過中間體聯(lián)苯酚形成聯(lián)對(duì)苯醌,如圖5所示。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,愈創(chuàng)木酚的氧化產(chǎn)物既有醌型化合物又有非醌型化合物,如圖6所示。付時(shí)雨等為了了解酚型與非酚型化合物在相同漆酶催化體系中的反應(yīng)性能差異,利用具有酚羥基的對(duì)-香豆酸和阿魏酸在漆酶和ABTS存在下進(jìn)行了反應(yīng)。結(jié)果具有酚羥基的兩種酚酸皆發(fā)生聚合反應(yīng),而酚羥基被保護(hù)后卻不能發(fā)生反應(yīng)。說明酚羥基的存在可以提高木素模型化合物的反應(yīng)活性,但是反應(yīng)不是使化合物發(fā)生降解,而是有利于聚合。這可能是由于具有酚經(jīng)基的化合物經(jīng)漆酶催化作用后形成了酚氧自由基,酚氧自由基發(fā)生聚合或偶合形成高分子化合物。阿魏酸在苯環(huán)上比香豆酸多一個(gè)甲氧基,因此它形成的酚氧自由基活性更高,所以反應(yīng)后的聚合物分子量可能更大。漆酶對(duì)酚類化合物的活性取決于它們的氧化還原電位,鄰位帶有兩個(gè)羥基基團(tuán)或?qū)ξ灰粋€(gè)羥基和一個(gè)甲氧基的酚類表現(xiàn)出高的活性,而香草醛的活性相對(duì)較低,因?yàn)樗龓в辛u基和甲氧基還帶有一醛基,具有強(qiáng)烈的吸電子能力,增強(qiáng)了香草醛的氧化還原電位。但在漆酶與活性之間無直接聯(lián)系。因此漆酶對(duì)氫醌[氧化還原電位:+0.57V]比對(duì)愈創(chuàng)木酚(電位:+0.77)或者香草醇表現(xiàn)出較低的反應(yīng)活性。而在間位有一羥基的酚類沒有檢測到活性,因?yàn)樗鼈儧]有被氧化成醌,具有較高的電位。而且pH值在4.5時(shí),漆酶對(duì)含羰基(如香草醛)或者羧基(如香草酸)的復(fù)合物的活性最大。3利用化學(xué)方法與直接利用微生物處理廢水相比,酶催化反應(yīng)具有以下優(yōu)點(diǎn):分解效率高;毒性小、易操作,微生物常常具有致病性,而酶對(duì)環(huán)境很友好;使用范圍寬。酶的主要缺點(diǎn)是價(jià)格高。且易受各種因素(如鹽的濃度、pH及有機(jī)溶劑等)的干擾變性失活。通過使用新型的酶固定化技術(shù),可明顯提高酶的使用穩(wěn)定性和重復(fù)利用率,從而可進(jìn)一步降低其使用成本。固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學(xué)的方法固定在有機(jī)或無機(jī)的載體上。形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。其中物理方法主要有物理吸附法、包埋法和離子吸附法三種:化學(xué)方法主要有共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)結(jié)合法兩種?？偟膩碚f,吸附法對(duì)酶的破壞小,但結(jié)合不牢固,易于脫落;化學(xué)交聯(lián)法是酶以共價(jià)鍵與載體結(jié)合,因而對(duì)酶的破壞力大,但其結(jié)合牢固,重復(fù)性和可操作性好。固定化漆酶能夠延長漆酶的使用壽命、提高漆酶的穩(wěn)定性及其對(duì)環(huán)境的耐受性,因此它具有比游離漆酶更好的使用性質(zhì)。通過使用新型的酶固定化技術(shù),可明顯提高酶的使用穩(wěn)定性和重復(fù)利用率,從而可進(jìn)一步降低其使用成本。D’Annibale等用殼聚糖吸附漆酶后,再以1.0%的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)固定,所得固定化漆酶的熱穩(wěn)定性得到了很大的提高,在75℃和80℃,固定化酶分別保持了65.0%和50.0%的相對(duì)酶活,而自由酶僅有35.0%和12.0%的相對(duì)活性。固定化漆酶在制漿、造紙、廢水處理中的應(yīng)用技術(shù)成本較低,對(duì)反應(yīng)條件、反應(yīng)設(shè)備的要求不像微生物處理那樣苛刻。有研究表明,采用活性炭吸附與海藻酸鈣凝膠包埋相結(jié)合的方法固定漆酶,操作條件溫和,不造成酶活力的損失,固定化酶的性能穩(wěn)定;與游離酶相比,固定化酶反應(yīng)的pH值和溫度范圍更寬,其穩(wěn)定性得到了明顯改善。4漆酶/介體生物活性化合物漆酶的氧化還原電勢比較低,為300~800mV(對(duì)標(biāo)準(zhǔn)氫電極),只能氧化降解木素中的酚型結(jié)構(gòu)單元,而不能氧化占木素90%的非酚結(jié)構(gòu)。它需要一些低氧化還原勢的化合物作為介體,從模型化合物的研究得知,介體的存在是漆酶氧化非酚型木素結(jié)構(gòu)單元的必要條件。介體在酶的作用下會(huì)形成活性高且有一定穩(wěn)定性的中間體,這些活性中間體能從氧分子中獲得電子傳遞給木素分子從而使木素氧化降解。LMS(Laccase/MediatorSystem)即漆酶/介體系統(tǒng),指漆酶在介體和氧氣存在下進(jìn)行脫木素或漂白的過程。已報(bào)道的有效介體主要有ABTS、HBT、NHA及NHA的衍生物:NHB、NHTB、NNPH、BPHA、CMNHA、CNHA等。但由于介體價(jià)格比較高,使得這項(xiàng)技術(shù)難以工業(yè)化推廣,需要尋找廉價(jià)高效、應(yīng)用面廣的介體。5其他廢水處理方面的研究在漆酶存在下進(jìn)行曝氣處理可有效去除制漿造紙工業(yè)廢水中的溶解性木素及酚型化合物,也就是廢水中的有色物質(zhì)和有毒物質(zhì)可被有效去除。一旦酶的流失、失活及成本問題得到解決,漆酶有望在造紙工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。漆酶在制漿造紙工業(yè)中的應(yīng)用研究已滲透到制漿造紙工業(yè)的諸多方面,但大多還停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。漆酶在造紙廢水處理中的研究還處于初級(jí)階段,其催化氧化木素的機(jī)理尚需進(jìn)一步探討?；蚬こ痰倪\(yùn)用及新技術(shù)、設(shè)備的不斷出現(xiàn)將會(huì)有效地促進(jìn)漆酶在造紙工業(yè)和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的應(yīng)用。為了進(jìn)一步揭示漆酶的表達(dá)本質(zhì)并實(shí)現(xiàn)分子改性,應(yīng)加強(qiáng)漆酶的基因克隆及表達(dá)調(diào)控等方面的研究,使其更符合工業(yè)生產(chǎn)的需要。如何使漆酶的應(yīng)用更加實(shí)用化,如何拓展漆酶在造紙廢水處理中新的應(yīng)用技術(shù)和應(yīng)用途徑