知識目標：

掌握發酵生產青霉素條件控制，及青霉素提取與精制控制點。重點:掌握發酵生產青霉素工藝流程難點:青霉素提取與精制控制點青霉素的生產工藝流程專家講座第1頁什么是青霉素青霉素又被稱為青霉素G、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀等。青霉素是抗菌素一個，能破壞細菌細胞壁（革蘭氏陽性菌）并在細菌細胞繁殖期起殺菌作用一類抗生素，是第一個能夠治療人類疾病抗生素。青霉素是β-內酰胺類抗生素經典代表。青霉素結構青霉素的生產工藝流程專家講座第2頁青霉素理化性質1、穩定性：固體青霉素鹽穩定性與其含水量和純度有很大關系；2、溶解度：青霉素游離酸在水中溶解度很小，易溶于有機溶劑如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其鉀鹽、鈉鹽易溶于水和甲醇，可溶于乙醇；3、降解反應：青霉素是很不穩定化合物，遇酸堿或加熱易分解而失去活性，并發生分子重排。青霉素的生產工藝流程專家講座第3頁（a）最早發覺產生青霉素原始菌種是點青霉菌，生產能力很低，不能滿足工業生產要求，所以被淘汰。現在主要采取產黃青霉菌。（b）為了提升產黃青霉青霉素產量使用誘變劑如：二環氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亞胺、亞硝酸、X射線等。菌種：青霉素的生產工藝流程專家講座第4頁產黃青霉：Penicilliumchrosogenum深層培養菌絲形態菌落：平坦或皺褶，圓形。分生孢子：鏈狀；顏色絲狀菌球狀菌黃孢子絲狀菌綠孢子絲狀菌：發酵單位85000U/mL綠孢子球狀菌白孢子球狀菌：發酵單位高，對原材料、設備要求高，提煉收率低。青霉素的生產工藝流程專家講座第5頁青霉素的生產工藝流程專家講座第6頁青霉素的生產工藝流程專家講座第7頁青霉素發酵工藝1.發酵工藝流程青霉素的生產工藝流程專家講座第8頁青霉素的生產工藝流程專家講座第9頁孢子制備1、將沙土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成培養基進行斜面培養，經傳代活化，得單菌落。2、再傳斜面，培養7天，制得斜面孢子。3、再移植到優質小米或大米固體培養基上，25oC，相對濕度45%-50%，生長7天，大米表面長出顯著小菌落時要再振搖均勻，使菌絲在大米表面能均勻生長，制得綠色小米孢子。注意：①每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及檢驗雜菌情況。②斜面孢子和米孢子培養要注意濕度控制青霉素的生產工藝流程專家講座第10頁種子罐培養工藝一級種子發酵：發芽罐，孢子萌發，形成菌絲。培養基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油消沫劑等；接種量:>200億孢子/t培養基空氣流量:1：3（通氣量與發酵液體積比）（m3/m3·min）；攪拌轉速:300-350r/min；溫度：27±1℃；時間:40h。質量：菌絲濃度達40%，菌絲形態正常青霉素的生產工藝流程專家講座第11頁二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。培養基：葡萄糖、玉米漿、碳酸鈣，玉米油，消沫劑等；接種量：10％；空氣流量：1:1-1.5（m3/m3·min）；攪拌轉速：250-280r/min；pH：自然；溫度：25±1℃；時間：10-14h；質量：菌絲濃度達40%，殘糖1.0%以下，菌絲粗壯，III期（脂肪粒，積累貯藏物），無雜菌，效價在700u/ml左右。青霉素的生產工藝流程專家講座第12頁生產罐培養工藝三級罐：生產罐；培養基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.青霉素的生產工藝流程專家講座第13頁培養基碳源青霉菌能利用多種糖，如：葡萄糖、乳糖。當前采取淀粉水解糖，糖化液進行流加。氮源可采取玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等有機氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無機氮源。前體為生物合成含有芐基基團青霉素G，需要在發酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。因為它們對青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采取屢次加入方式。無機鹽包含硫、磷、鈣、鎂、鉀（前少后多，氮源轉為氨基酸）等鹽類。鐵離子對青霉素有毒害作用，應嚴格控制發酵液中鐵含量在30ug/mL以下。青霉素的生產工藝流程專家講座第14頁溫度控制適宜菌絲生長溫度普通為27oC，分泌青霉素20℃20℃青霉素破壞少，周期很長。變溫控制，不一樣階段不一樣溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產階段適當降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制22℃青霉素的生產工藝流程專家講座第15頁pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，防止超出7.0直接加酸或堿：自動控制流加葡萄糖：速度取決于pH改變快慢。pH下降：補加CaCO3、通氨、尿素或提升通氣量pH上升：補加糖（補糖控制可依據殘糖量及發酵過程中PH值或最好是依據排氣中CO2及O2量來控制。普通在殘糖降至0.6%左右，PH值上升時開始補糖。）、生理酸性物質（硫酸銨、油脂）恒速補糖，用酸或堿控制方式

青霉素的生產工藝流程專家講座第16頁溶氧控制＜30％飽和度，產率急劇下降；＜10％，造成不可逆損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜攪拌速度:確保氣液混合，提升溶氧青霉素的生產工藝流程專家講座第17頁各階段供氧比較一級種子階段二級種子階段發酵階段空氣流量（m3/m3

·min）1：31:1-1.51：0.8－1.5攪拌轉速（r/min）300-350250-280150-200青霉素的生產工藝流程專家講座第18頁消沫天然油脂：玉米油；化學消沫劑：泡敵。前期:主間歇攪拌,少加油中期:攪拌、加油、稍微降低通氣量（必要時），策略：少許屢次，一次過多影響呼吸代謝。后期:盡可能少加消沫劑，可加水稀釋青霉素的生產工藝流程專家講座第19頁提煉工藝過程１．青霉素不穩定，遇酸、堿、熱分解失活２．水溶液中不穩定，非極性溶劑中穩定３．易溶于有機溶劑，水中溶解度很小４．青霉素鹽很穩定；降解產物含有致敏性５．預防降解，條件溫和、快速。青霉素的生產工藝流程專家講座第20頁預處理青霉素存在部位：發酵液濃度較低：10－30Kg/M3含有大量雜質：菌體細胞、核酸、雜蛋白質、細胞壁多糖等、殘留培養基、色素、鹽離子、代謝產物等目標：濃縮目標產物，去除大部分雜質，改變發酵液流變學特征，利于后續分離純化過程。預處理:發酵液加少許絮凝劑沉淀蛋白青霉素的生產工藝流程專家講座第21頁過濾鼓式真空過濾機過濾：草酸或黃血鹽一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質含量0.5-2.0%。板框式過濾機過濾：硫酸調整pH4.5-5.0，加入0.07%PPB（溴代十五烷吡啶），0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提取（收率90％）青霉素的生產工藝流程專家講座第22頁溶劑萃取原理：青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而青霉素鹽易溶于水。萃取劑：青霉素分配系數高有機溶劑。工業上通慣用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質：加0.05-0.1%乳化劑PPB(溴代十五烷吡啶)。萃取：2－3次。青霉素的生產工藝流程專家講座第23頁逆流萃取過程正相萃取：酸化pH1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式離心機分離（濃縮1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。重復萃取2－3次，到達結晶要求。萃取條件：10℃下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。青霉素的生產工藝流程專家講座第24頁青霉素萃取方式多級逆流萃取

青霉素的生產工藝流程專家講座第25頁脫色1.萃取液中添加活性炭，除去色素。2.過濾，除去活性炭。青霉素的生產工藝流程專家講座第26頁結晶——直接結晶加醋酸鈉－乙醇溶液反應：得到結晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。薄膜蒸發工藝圖青霉素的生產工藝流程專家講座第27