甲型h1n1病毒樣顆粒的免疫原性和保護效果研究

呼吸道感染是最嚴重的呼吸道感染之一，在全世界引起了高度的發病率和死亡率。截至2010年7月18日,爆發于墨西哥的甲型H1N1流感已在全球214個國家造成18336人死亡。疫苗是防控流感最為有效的手段。現今廣泛使用的流感病毒裂解疫苗雖然具有較高的免疫原性和良好的保護效果,但是由于其生產工藝依賴于雞胚,相應帶來了生產周期長,質量控制困難,病毒培養條件苛刻,至今無法用于兒童、老人及特殊人群等諸多問題。因此,研發一種安全、有效的新型流感疫苗成為疫苗發展的重要保證。病毒樣顆粒(virus-likeparticle,VLP)是一種由病毒蛋白自組裝形成的新型亞單位重組疫苗,其最大程度的模擬了病毒天然的存在形式,能夠高密度的富集病毒表面抗原并且不含病毒遺傳物質,因此VLP不但能夠有效的誘導機體產生免疫應答而且其安全性更為可靠。同時,由于可以選取原核或真核等多種表達系統,VLP疫苗還具有易于大規模生產的優點。國外已有許多關于VLP疫苗的研究報道,其中流感VLP候選疫苗的報道包括了H9N2、H3N2、H5N1、H1N1等多種亞型。然而目前還沒有甲型H1N1VLP候選疫苗與現行裂解疫苗進行比較的相關報道,也沒有報道使用國內的甲型H1N1流行株對其保護效果進行評價。本研究使用昆蟲-桿狀病毒表達系統表達包含A/California/07/2009(H1N1)病毒血凝素(Hemagglutinin,HA),神經氨酸酶(Neuraminidase,NA)以及基質蛋白1(Matrixprotein1,M1)的VLP,以甲型H1N1裂解疫苗作為對照,使用A/Beijing/501/2009(H1N1)作為攻毒毒株,初步評價甲型H1N1VLP候選疫苗的免疫原性和保護效果,為研發不依賴雞胚生產工藝的高效流感疫苗提供新的思路。1材料和方法1.1骨、細菌、細胞和病毒1.2主試劑1.3實驗動物1.4序列設計與基因合成1.51-na-ha-1m鏈式顆粒的結構1.6重組人組織型細胞培養、分離、表達1.6.1重組桿狀病毒的獲得參照Invitrogen公司Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統操作手冊,將pFastBac1-NA-HA-M1轉化大腸桿菌DH10感受態,提取重組桿粒并轉染sf9昆蟲細胞;轉染72h收集細胞培養上清,作為P1代重組桿狀病毒。連續傳代P1代桿狀病毒,收集P2、P3代桿狀病毒。1.6.2甲型H1N1VLP的大規模表達使用P3代桿狀病毒大規模表達VLP。27℃水浴搖床懸浮培養sf9細胞,當細胞密度達到1×106細胞/ml左右時以MOI=3接入重組桿狀病毒,感染72h后收獲上清并且4℃30000r/min超速離心4h濃縮上清。1.7免疫擴散法檢測bps-pa1.7.1甲型H1N1VLP的純化使用DEAE陰離子交換介質對VLP樣品進行初步純化,1mol/LNaCl梯度洗脫VLP。將洗脫液超濾濃縮,使用Sepharose4FF凝膠介質進一步純化VLP。12%SDS進行鑒定。1.7.2Westernblot檢測純化VLP的免疫活性將純化的VLP進行免疫印跡分析,一抗為滴鼻免疫A/Beijing/501/2009(H1N1)病毒的鼠抗血清(1:1000),二抗為羊抗鼠IgG-HRP抗體(1:6000)。1.7.3紅細胞凝集實驗測定甲型H1N1VLP血凝滴度在96孔血凝板中每孔加入50μl生理鹽水,連續倍比稀釋純化后的VLP,每孔再加入50μl1%雞紅細胞,室溫靜置30min后觀察并判定結果。以++孔為終點,將該孔的稀釋度表示為血凝滴度,方法參見文獻。1.7.4單向免疫擴散實驗測定甲型H1N1VLPHA抗原含量使用去污劑處理標準抗原及待測VLP樣品,將處理后的樣品稀釋并滴加到含有甲型H1N1HA抗原標準血清的1.5%瓊脂糖凝膠板中,使樣品在室溫下擴散過夜。PBS浸泡瓊脂糖凝膠4h之后考馬斯藍染色瓊脂糖凝膠,量取抗原-抗體沉淀環的直徑,計算甲型VLPHA的含量。1.7.5電鏡觀察病毒樣顆粒將純化后的甲型H1N1VLP樣品進行2%磷鎢酸負染色,使用透射電鏡觀察VLP形成情況。1.8盔甲1d1vlp隨機原因評估1.9抗膽紅素hi實驗的評價1.10型1d1vlp對免疫保護的影響的評價1.11統計分析2結果2.1pcr構建和鑒定1-na-hao1穿層顆粒和破碎桿粒2.21.1vlp的純度2.3p1v1證書和電視觀察的結果2.4干預v130的血凝滴加和ha含量2.5盔甲1d1vlp隨機原因評估2.6型1d1vlp對免疫保護的影響的評價3流感疫苗的免疫原性和保護2009年3月以來,甲型H1N1流感在全球大規模蔓延,研究顯示同時期的季節型流感疫苗在不同年齡組人群中均無法提供對抗甲型H1N1流感病毒的交叉免疫保護,再一次顯示快速生產特異株型流感疫苗的重要性。然而傳統流感疫苗的生產依賴于雞胚,難以應對流感大規模爆發對疫苗的需求,且老年人、兒童及特殊人群還沒有理想的流感疫苗,因此現有流感疫苗的生產工藝亟待更新。VLP作為一種新型的候選亞單位疫苗,普遍具有免疫原性好,安全性高,易于大規模生產等特點。VLP已經被應用于人乳頭瘤病毒,輪狀病毒,伊波拉病毒等疫苗的研發。昆蟲細胞生產的針對人乳頭瘤病毒的宮頸癌VLP疫苗已經獲準應用于臨床。由昆蟲細胞衍生的流感VLP是最有希望替代現有流感疫苗的候選疫苗。sf9細胞表達的,包含流感病毒HA、NA以及M1蛋白的VLP候選疫苗能夠在動物模型中有效的誘導保護性免疫。已有報道稱包含HA和M1的甲型H1N1VLP候選疫苗能夠在Balb/c小鼠上誘導保護性免疫。然而,HA和NA是流感病毒感染宿主細胞的決定性因素,高滴度的HA和NA特異性抗體是流感疫苗產生保護性免疫的關鍵因素,HA抗原單獨存在難以有效誘導全面的免疫保護。本實驗重組出的甲型H1N1VLP包含HA、NA和M13種抗原分子,能夠在小鼠體內有效的誘導以Th2(IgG1)型免疫為主,兼顧Th1(IgG2a)型的特異性免疫應答。BrightRA等報道,與滅活全病毒以及重組HA相比較,流感VLP能夠誘導更為全面的免疫反應。本實驗則證實,甲型H1N1VLP候選疫苗能夠比甲型H1N1裂解疫苗誘生更高水平的IgG抗體滴度。HI實驗則證實,甲型H1N1VLP候選疫苗與甲型H1N1裂解疫苗能夠產生相同的保護性免疫。使用北京流行株A/Beijing/501/2009(H1N1)進行攻毒實驗證實,甲型H1N1VLP候選疫苗與甲型H1N1裂解疫苗的保護效果相當。綜上所述,昆蟲細胞表達的甲型H1N1VLP不但具有良好的免疫原性和保護效果,還成功的規避了傳統流感疫苗生產周期長,安全性難以保證等問題,是值得進行深入研究的流感候選疫苗。pFastBac1穿梭質粒,大腸桿菌DH10以及Sf9細胞株均購自Invitrogen公司;甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009(H1N1)來自本室;甲型H1N1裂解疫苗由華蘭生物公司提供。SF-900II培養基購自GIBCO公司;T4DNA連接酶,限制性內切酶RsrII和HindIII購自NEB公司;CellfectinII昆蟲細胞轉染試劑購自Invitrogen公司;膠回收試劑盒購自Promiga公司,質粒提取試劑盒購自博大泰克公司;羊抗鼠IgG-HRP抗體購自BETHYL公司;Sepharose4FF凝膠介質及DEAE陰離子交換介質購自GE公司;1%雞紅細胞,甲型H1N1標準血清及抗原均來自本室。4～6周齡雌性Balb/c小鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心。將Genbank報道的A/California/07/2009(H1N1)病毒NA、HA和M1蛋白基因序列分別克隆于苜蓿銀紋夜蛾多(核殼體)核型多角體病毒多角體蛋白啟動子下游并將3條序列首尾相接。基因序列兩端分別添加RsrⅡ和HindⅢ酶切位點并由上海生工合成。擴增并提取pUC57-NA-HA-M1質粒,使用內切酶RsrⅡ和HindⅢ進行雙酶切,膠回收目的片段。使用T4DNA連接酶將NA-HA-M1基因片段克隆于pFastBac1質粒中,轉化大腸桿菌DH5α感受態,PCR篩選陽性克隆并送上海生工測序。如圖1所示,穿梭質粒經PCR擴增可得到4630bp大小的目的片段,顯示成功構建了穿梭質粒pFastBac1-NA-HA-M1。使用M13通用引物對重組桿粒進行PCR鑒定,得到7060bp大小的特異性條帶,顯示成功構建了含有NA-HA-M1基因的重組桿粒。使用DEAE陰離子交換介質對表達產物進行純化,1000mmol/LNaCl梯度洗脫目的VLP(圖2a),在300mmol/L出現目的洗脫峰1。將洗脫峰1的收集液樣品濃縮并進行凝膠層析(圖2b),2峰為目的VLP。以1:4比例將小鼠血清樣品與受體破壞酶(RDE)混合,37℃孵育17h以消除非特異凝集抑制因子,之后56℃50min滅活RDE。將處理后的樣品與生理鹽水1:1混合,在96孔血抑板中連續倍比稀釋樣品,之后每孔加入4HAU/25μl的A/Beijing/501/2009(H1N1)滅活病毒,室溫孵育40min。孵育后每孔再加入25μl1%雞紅細胞,震蕩混勻,室溫靜置30min。最后一個未凝集孔稀釋度的倒數即為HI效價選用A/Beijing/501/2009(H1N1)作為攻毒毒株,ReedMuench法測定毒株的半數致死劑量(LD50)。以50LD50劑量滴鼻攻擊各組小鼠,連續觀察14d,記錄死亡率,評價病毒樣顆粒的保護效果。采用GraphPadPrism5軟件進行單因素t檢驗分析,P<0.05視為差異具有顯著性。使用滴鼻免疫A/Beijing/501/2009(H1N1)病毒的鼠抗血清對純化的甲型H1N1VLP進行Westernblot鑒定,結果如圖3所示,顯示甲型H1N1VLP具有良好的免疫活性;使用透射電鏡觀察甲型H1N1VLP結果如圖4,結果顯示形成的甲型H1N1VLP大小100nm左右,與文獻報道相符。對純化后的甲型H1N1VLP進行紅細胞凝集實驗,以++孔為終點,將該孔的稀釋度表示為血凝滴度,經測定純化后的甲型H1N1VLP血凝滴度為1:512;對純化后的甲型H1N1VLP進行單向免疫擴散實驗,以甲型H1N1標準抗原為參考,測定甲型H1N1VLPHA的含量為92.9μg/ml。將小鼠隨機分組,每組5只。以10μgHA/只劑量分別進行甲型H1N1VLP候選疫苗和甲型H1N1裂解疫苗的腹腔注射免疫,共免疫2次,間隔2周。末次免疫10天后取小鼠尾靜脈血,采用間接ELISA法測定血清中IgG抗體水平。使用間接ELISA法檢測小鼠二免10d后尾靜脈血清中IgG抗體效價,結果如圖5所示,虛線代表小鼠血清中IgG抗體的本底值,甲型H1N1VLP免疫組的IgG和IgG1終點滴度分別為7.9×103和4.6×103,顯著高于甲型H1N1裂解疫苗免疫組(