考克氏菌木聚糖酶的誘導及影響因素研究

木聚糖是半纖維素的重要組成部分，占細胞干重的15%35%。這是其次是維生素素的第二大可再生原材料。木聚糖的有效利用與轉化是解決能源和資源短缺以及環境污染等諸多問題的良好途徑。木聚糖酶是木聚糖降解酶系的關鍵酶,其作用是水解木聚糖主鏈生成不同長度的木寡糖。木聚糖酶在飼料、食品、造紙等多個行業有廣泛的應用產木聚糖酶的微生物分布廣泛,在細菌、放線菌和多種真菌中都有相關報道。但是,與陸地微生物相比,海洋微生物產木聚糖酶的研究相對較少。對于陸地微生物的相關研究,曾青蘭等11.1藥品及培養基考克氏菌(樺木木聚糖和木糖購自Sigma公司,玉米芯木聚糖自制,其它試劑和藥品均為國產或進口分析純。高鹽LB培養基:酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl30.0g,用HCl和NaOH調pH7.0,定容至1000mL。木聚糖培養基:木聚糖12.0g,NaCl6.0g,K1.2工業酒精浸泡濾渣以玉米芯為原料,按10mL蒸餾水中加入1g玉米芯粉的比例進行混合,在120℃條件下蒸煮30min,8000r/min離心20min,收集濾渣,然后用工業酒精浸泡濾渣過夜。次日再以8000r/min離心20min,收集濾渣,用10%NaOH溶液在110℃條件下浸提30min,冷卻后在8000r/min離心20min收集濾液,用HCl中和至pH7.0。此時取一半上清直接離心,收集沉淀得水不溶性木聚糖,另一半用等體積的工業乙醇沉淀,離心收集沉淀得水不溶性和醇不溶性混合木聚糖。1.3液體培養基hlb將固體木聚糖培養基中的考克氏菌接入液體HLB培養基中進行活化,約3d后HLB為紅色即表示該菌體已活化好。1.4木聚糖酶活性測定取0.2%菌液到不同底物的發酵培養基中,置搖床以28℃,200r/min培養14h后測定木聚糖酶活性,以后每隔6h測定1次,進行連續測定,分別改變碳源、氮源,測定酶活力;在測定不同pH及不同濃度的Tween80,TritonX-1001.5粗酶系統中樺木木聚糖的制備采用DNS法測定考克氏菌株粗酶液木聚糖酶活性。發酵液8000r/min離心10min后,得到上清即為粗酶液。取10μL粗酶液加入90μL50mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液配制的1%樺木木聚糖溶液中(pH8.5),50℃水浴反應30min后,加入100μLDNS溶液終止反應并沸水浴10min顯色,冷卻后在540nm波長下測定吸光值。同時以木糖制作標準曲線,每分鐘水解樺木木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量即定義為1個酶活力單位(IU)。22.1不同碳源對發酵液酶的影響木聚糖酶是一種誘導酶。經過不同木聚糖的誘導和液體發酵連續培養表明,以水不溶性和醇不溶性混合木聚糖為碳源時,連續發酵20h后,發酵液酶活最高,達到68.7IU/mL;以水不溶性木聚糖為碳源時,32h后發酵液酶活達到最高,為46.0IU/mL(圖1)。2.2氮源種類對考克氏菌影響木聚糖酶的影響以水不溶性和醇不溶性混合木聚糖作為唯一的碳源,分別以牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、醋酸銨為氮源,研究了4種不同氮源對考克氏菌產生木聚糖酶的影響。結果表明,發酵62h后,以牛肉膏為氮源的發酵液酶活最高,為86.7IU/mL(圖2)。2.3初始ph對產酶的影響在優化碳源、氮源基礎上,研究了培養基初始pH值在6～10范圍時對考克氏菌產木聚糖酶的影響,發現初始pH8.5時產酶最佳(圖3),這表明該菌株在偏堿環境下能更好的產酶。在該pH值時,發酵62h,發酵液上清的酶活力可達88.8IU/mL。2.4tri鄉村型菌株對考克氏菌產酶的影響以水不溶性和醇不溶性木聚糖作為唯一的碳源,以牛肉膏為唯一氮源,同時添加不同體積分數的TritonX-100,研究TritonX-100對考克氏菌產酶的影響。結果表明,TritonX-100對產酶不僅沒有促進作用,反而有很強的抑制作用(圖4)。2.5tween80對基因型的影響通過添加不同體積分數Tween80對考克氏菌產酶的影響,結果表明,添加0.2%的Tween80對產酶具有促進作用,發酵62h后,酶活可達到112.5IU/mL(圖5)。2.6正交試驗結果依據產酶單因子試驗的結果,對影響產酶的主要條件進行四因素(碳源、氮源、pH、吐溫80)三水平的正交試驗(表1),結果表明,第8組的組