Chapter10

基因組學研究技術Capter1Chapter10Capter1物理圖譜基因轉錄圖譜基因組功能分析技術生物信息學技術主要內容物理圖譜主要內容物理圖譜物理圖譜物理圖譜（physicalmap）測定DNA分子，繪制構成基因組的全部基因的排列和間距。

即直接將DNA分子標記、基因或克隆標定在基因組的實際位置。目的把基因的遺傳信息在染色體上的相對位置線性而系統地排列出來物理圖譜（physicalmap）染色體上每個DNA片段的順序以已知核苷酸序列的DNA片段（STS）為“路標”，以堿基對（bp，kb，Mb）作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。

物理圖譜染色體上每個DNA片段的順序物理圖譜物理圖的距離依作圖方法而異

★

輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳(cR)

★

限制性片段作圖與克隆作圖圖距單位為堿基對(bp)。【cR(厘鐳):在確定的輻射劑量下染色體斷裂的百分率。】物理圖的距離【cR(厘鐳):在確定的輻射劑量下染色體斷裂物理圖譜要素

序列

位置長的序列中

▲物理圖：標明各個序列的路標

▲通過分子雜交的辦法利用DNA雙鏈互補特點一個DNA片段雜交在這個位置說明這個位置的結構與它相似~即這個位置的標記

以序列作為標記的位置物理圖譜要素組學研究技術課件物理作圖的方法

★限制酶作圖(RestrictionMapping)

★

基于克隆的基因組作圖(clone-basedmapping)

★熒光原位雜交

(Fish,Fluorescentinsituhybridization)

★

序標位作圖(STS，Sequencetagedsite)物理作圖的方法物理圖譜的意義獲得分布于整個基因組的30000個序列標簽位點（sequencetaggedsite,STS），使基因組每隔100kb距離就有一個標記在此基礎上構建覆蓋每條染色體的大片段DNA克隆

如：物理圖譜的意義●酵母人工染色體

（yeastartificialchromosome,YAC）●細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）●人工附加染色體

（humanartificialepisomalchromosome,HAEC）●人工噬菌體染色體

（P1bacteriophageartificialchromosome,PAC）等連續克隆(Contig)●酵母人工染色體限制酶作圖

DNA鏈的限制性酶切片段的排列順序即酶切片段在DNA鏈上的定位限制性內切酶在DNA鏈上的切口是以特異序列為基礎的，核苷酸序列不同的DNA，經酶切后就會產生不同長度的DNA片段，構成獨特的酶切圖譜(RestrictionMapping)。又稱DNA物理圖譜

DNA分子結構的特征之一

限制酶作圖DNA鏈的限制性酶切片段的排列順序DNA是很大的分子，限制酶產生用于測序反應的DNA片段只是其中的極小部分，這些片段在DNA鏈中所處的位置關系~即DNA物理圖譜解決的問題DNA物理圖譜是順序測定的基礎

指導DNA測序的藍圖

Why???DNA是很大的分子，限制酶產生用于測序反應的D限制性作圖

▼將限制性酶切位點標定在DNA分子的相對位置只能應用于較小的DNA分子

▼上限取決于作圖分子中限制酶位點的頻率

▼采用6堿基對識別順序的限制酶適合﹤50KbDNA分子的精確作圖限制酶作圖

限制性作圖限制酶作圖基本原理

把龐大的DNA先“敲碎”，再拼接以Mb、kb、bp作為圖距以STS（sequencetagssite）探針序列為路標主要是把含有STS對應序列的DNA的克隆片段連接成相互重疊的“片段重疊群（contig）基本原理把龐大的DNA先“敲碎”，再拼接主要是把組學研究技術課件（1）完全降解

選擇合適的限制性內切酶完全降解待測DNA鏈(同位素標記)

凝膠電泳分離→→自顯影→→獲得圖譜即組成該DNA鏈的酶切片段數目和大小基本步驟（1）完全降解選擇合適的限制性內切酶基本步驟同位素標記32P限制性內切酶電泳同位素標記32P限制性內切酶電泳

末端標記待測DNA的一條鏈(同位素)

酶部分降解控制反應條件使DNA鏈上酶切口隨機斷裂避免所有切口斷裂的完全降解電泳分離→→自顯影比較自顯影圖譜根據片段大小及彼此間的差異排出酶切片段在DNA鏈上的位置（2）部分降解末端標記待測DNA的一條鏈(同位素)（2）部分降解12比較排出酶切片段12比較排出酶切片段完整的物理圖譜應包括基因組的不同載體DNA克隆片段重疊群圖大片段限制性內切酶切點圖

DNA片段或一特異DNA序列（STS）的路標圖基因組中廣泛存在的特征型序列等的標記圖（如CpG序列、Alu序列，isochore）

【具有mosaic結構,稱為isochore。即基因組是由一些較長的大片段（平均長度>>300Kb）組成,GC含量相對均勻,而在這些大片段的兩端GC含量是躍變的,而不是漸變的】

完整的物理圖譜應包括組學研究技術課件熒光原位雜交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)將探針用熒光標記，與細胞分裂中期的染色體雜交，用熒光顯微鏡觀察信號所處的位置，將探針標定在連鎖圖上。熒光原位雜交將探針用熒光標記，與細胞分裂中期的染色體雜交熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，FISH）熒光原位雜交

（fluorescentinsituhy熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，FISH）熒光原位雜交

（fluorescentinsituhy熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，FISH）熒光原位雜交

（fluorescentinsituhy熒光原位雜交

（fluorescentinsituhybridization，FISH）熒光原位雜交

（fluorescentinsituhy用DNA纖維分析水稻第4號染色體用DNA纖維分析水稻第4號染色體基于克隆的基因組作圖

大片段DNA的克隆載體◆

YAC:酵母人工染色體230-1700Kb◆

BAC:細菌人工染色體300Kb◆PAC:P1人工染色體300Kb◆

Cosmids:30Kb

重疊群(Contig)

：相互重疊的DNA片段組成的物理圖

Contig組建方法:染色體步移指紋作圖基于克隆的基因組作圖大片段DNA的克隆載體重疊群(克隆作圖構建全基因組DNA基因文庫構建指定單一染色體的基因文庫PCR檢測STS分子標記根據重疊STS標記繪制克隆連鎖圖提取基因組DNA

流式細胞儀分離染色體打斷打斷克隆作圖構建全基因組DNA基因文庫構建指定單一染色體的基因染色體步移原理染色體步移原理chromosomewalking酶切，插入A基因探針篩選亞克隆片段重新篩選亞克隆片段重新篩選λ亞克隆1相鄰λ亞克隆2chromosomewalking酶切，插入A基因探針亞克指紋：確定DNA樣品所具有的DNA片段一個克隆的指紋

即表示該克隆所具有的限定的順序特征克隆指紋分析原理

如果2個克隆彼此重疊它們一定含有相同的序列克隆指紋主要用于重疊群(Contig)的構建指紋：確定DNA樣品所具有的DNA片段克隆指紋分析原理指紋分析方法

限制性帶型(restrictionpatterns)指紋重復順序DNA指紋(repetitiveDNAfingerprints)STS目錄作圖(STS

contentmapping)

重復DNAPCR(repetitiveDNAPCR)

或分散重復順序PCR指紋

(interspersedrepeatelement

PCR,IRE-PCR)

指紋分析方法限制性帶型(restrictionpatt限制性片段指紋重疊順序DNA指紋STS指紋Contig限制性片段指紋重疊順序DNA指紋STS指紋Contig序標位(STS)作圖

長度:100-500bp

序列已知,可以設計PCR反應單拷貝,在染色體上的位置是唯一的

EST

(Expressedsequencetag)

可以作STS

STS：sequencetagsit序標位(STS)作圖長度:100-500bpSTSSTS作圖原理成套片段2個標簽同時出現在6個大片段中只有2個大片段有2個標簽STS作圖原理成套片段2個標簽同時出現在6個大片段中只有2染色體DNASTS作圖原理染色體DNASTS作圖原理尋找STS的方法

表達順序標簽(expressedsequencetag，EST)

從cDNA中找到的小段順序基因家族成員間共有的序列不能用于STSSSLP

（simplesequencelengthpolymorphisrns）隨機基因組順序尋找STS的方法表達順序標簽(expressedse表達順序標簽EST

隨機挑選cDNA克隆進行單向、一步大規模測序所獲得的部分cDNA序列即EST

●

EST是一個cDNA克隆快速大規模測序后所獲得的３’端和５’端部分cDNA隨機片段●

每個EST長度約200～600bp

代表了一個單拷貝基因的部分cDNA表達序列表達順序標簽EST●EST是一個cDNA克隆快速大規模測大多數EST的長度不足400bpWhy？？？一個基因轉錄本的cDNA序列可能包含多個序列重疊的EST一個基因mRNA剪接點不同可以獲得多個cDNA克隆那么，EST既可能對應于一個cDNA的某一部分又可能代表mRNA的不同剪接方式

大多數EST的長度不足400bpWhy？？？一個基基因轉錄圖譜

（transcriptionmap）基因轉錄圖譜（transcriptionmap）轉錄圖譜(基因圖譜)

在識別基因組所包含的蛋白質編碼序列的基礎上繪制的結合有關基因序列、位置及表達模式等信息的圖譜。即利用EST作為標記所構建的分子遺傳圖譜。（genemap）轉錄圖譜(基因圖譜)即利用EST作為標記所構建的分子遺傳Ortranscriptionmap:在人類基因組中鑒別出占2%至5%的全部基因的位置結構與功能。基本原理：蛋白質推測mRNA的序列，mRNA反轉錄為cDNA，然后利用其與所測序列進行雜交，鑒別出與轉錄有關的基因。Ortranscriptionmap:基本原理

生物性狀和疾病→→由結構或功能蛋白質決定已知的蛋白質→→由mRNA編碼

mRNA反轉錄→合成cDNA→

即EST的cDNA片段用這種穩定的cDNA或EST→→作為“探針”進行分子雜交鑒別出與轉錄有關的基因基本原理生物性狀和疾病→→由結構或功能蛋白質決定基本原理或用PolyA互補的寡聚T

或克隆載體的相關序列作為引物對mRNA雙端尾側的幾百個bp進行測序得到EST（表達序列標簽）基本原理或用PolyA互補的寡聚T表達序列標簽（EST）克隆測序獲得EST表達序列標簽（EST）克隆測序獲得EST基本過程細胞/組織高質量mRNA構建cDNA文庫克隆3‘和5’端探針估計全長和復雜性雜交陣列文庫克隆3‘和5’端全長候選基因純化克隆證實5’端基本過程細胞/組織高質量mRNA構建cDNA文庫克隆3‘和基因圖譜的意義1、能為估計人類基因的數目提供可靠的依據。2、提供不同組織、不同時期基因表達的信息（數目、種類及結構功能）。3、提供結構基因的標記，可以作為篩選基因的探針，有直接的經濟價值。4、鑒定病態基因（如癌基因）的變異位置。基因圖譜的意義

單核苷酸多態性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs）

人類是一個具有多態性的群體。不同的群體和個體在生物學性狀（對疾病的易感性／抗性）上的差別，是進化過程中基因組與環境相互作用的結果單核苷酸多態性人類是一個具有多態性的群體。不同

不同個體間在基因水平上的單核苷酸變異，平均每1000對堿基出現一個SNP,2個無關個體間有300萬SNPs.不同個體間在基因水平上的單核苷酸變異，SNP作圖的一般步驟包括：

①獲取DNA序列；

②

從DNA序列確定序列標簽位點（sequencetaggedsites，STSs）；

③掃描STSs或ESTs確定候選SNPs；

④

確定SNPs；

⑤將SNPs定位于染色體特定位置。SNP作圖的一般步驟包括：①獲取DNA序列；特異雜交特異雜交SNP不同于罕見的單堿基突變（Mutation）

◆

SNP等位位點出現的頻率≧1％

◆

位于基因的編碼序列中的SNP稱為cSNP

如果cSNP引起蛋白質重要部位AA變異導致其功能發生改變

◆

位于基因調控序列中的SNP影響基因的表達調控

◆

SNP因連鎖不平衡所形成的單倍型用于關聯研究（Associationstudies）確定與之聯鎖的生物學性狀相關序列SNP不同于罕見的單堿基突變（Mutation）

連鎖分析與基因定位疾病的關聯研究多基因疾病的基因定位個體識別和親子鑒定發病機理的研究個體用藥生物進化和生物間相互關系SNP應用連鎖分析與基因定位SNP應用【例1】

鐮刀型貧血癥（sickle-cellanemia）血紅蛋白的β珠蛋白基因

17位的A突變為T

導致Val變Glu

血紅蛋白構型改變攜氧能力大大降低，引發嚴重貧血SNP與臨床直接導致遺傳病【例1】鐮刀型貧血癥（sickle-cellanemia【例2】靜脈血栓（venousthrombosis）凝血因子5（factorV）基因

1691位的G突變為A

導致Arg變為Glu

封閉了抗凝血因子APC(activatedProteinC)

對factorV的切割位點促使血栓形成【例2】靜脈血栓（venousthrombosis）關聯分析（Associationstudies）

：如果某一因素可增加某種疾病的發生風險即與正常對照人群相比該因素在疾病人群中的頻率較高

那么，該因素與疾病相關聯如非遺傳因素吸煙與肺癌相關遺傳因素中，APOE4與Alzheimer`s相關SNP與遺傳標記研究復雜性狀與疾病的遺傳，以及群體的基因識別

[老年癡呆/阿爾海默癥]關聯分析（Associationstudies）：SNP遺傳標記用于遺傳分析或關聯分析的特征核酸位點SNP數量多，分布廣泛SNP適于快速、規模化篩查SNP等位基因頻率的容易估計易于基因分型遺傳標記同樣藥物的劑量對病人甲有效對病人乙不起作用對病人丙則可能有副作用藥物的療效與副作用方面，病人的反應差異很大

Why？？？病人遺傳學上存在差異（單核苷酸多態性SNP）導致對藥物產生不同的反應SNP與個體用藥同樣藥物的劑量SNP與個體用藥【例

】細胞色素P450酶與大約25%廣泛使用的藥物的代謝有關如果病人該酶的基因發生突變就會對降壓藥異喹胍產生明顯的副作用

那么，查明病人的SNP圖譜檢測病人是那一個或多個基因發生突變對癥下藥→→→個體醫療。【例】細胞色素P450酶美國國立衛生研究院(NIH)提供（NationalInstitutesofHealth）★與癌癥和腫瘤相關的候選SNP數據庫：

/GAI★適于生物醫學研究的dbSNP多態數據庫：

/SNPSNP公用數據庫美國國立衛生研究院(NIH)提供SNP公用數據庫基因組功能分析技術基因組功能分析技術基因分離技術

差異基因分離技術

SAGE

(SerialAnalysisofGeneExpression)

基因芯片技術遺傳連鎖分析位點關聯分析；基因分離技術差異基因分離技術

雙雜交技術蛋白組學基因封閉技術（反義核酸、核酶、RNAi、基因剔除）

基因替代技術（基因轉移、可控性基因表達）

蛋白修飾技術生物信息學分析技術基因功能研究技術雙雜交技術基因功能研究技術◆

變性高壓液相色譜(DHPLC)(denaturinghigh-performanceliquidchromatography)◆

基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF)(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflight)◆

DNAChip◆

SSCP(單鏈構像多肽性)◆

動態特異等位基因雜交

（dynamicallele-specifichybridization）SNP大規模分離檢測技術◆變性高壓液相色譜(DHPLC)SNP大規模分離檢測技新基因功能研究策略新基因功能研究策略基因表達系列分析SAGE

（serialsanalysisofgeneexpression）

1995Velculescu及其同事年創立基因表達系列分析原理來自轉錄物內特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鑒定一個轉錄物特異性的足夠信息，可作為區別轉錄物的標簽（tag）；通過簡單的方法將這些標簽串聯在一起，形成大量多聯體（concatemer），對每個克隆到載體的多聯體進行測序，并應用SAGE軟件分析，可確定表達的基因種類，并可根據標簽出現的頻率確定基因的表達豐度（abundance）。原理1.將5μg含有oligodT（引物）的磁珠與RNA混合。2.合成雙鏈cDNA。

3.用NlaⅢ酶消化形成一條鏈末端有標簽的產物。

4.將樣品分成兩份，連接成含有識別序列的產物，以備用BsmF1消化。5.用MmeI切割每一個樣品形成約60bp的標簽。SAGE步驟磁珠磁珠磁珠磁珠磁珠磁珠識別序列識別序列標簽1.將5μg含有oligodT（引物）的磁珠與RNA混合6.延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標簽。

7.PCR擴增。8.用NlaⅢ酶切130bp產物釋放34bp雙鏈標簽。9.連接片斷形成串聯體。

10.克隆到pZErO-1+里，并測序。

連接擴增6.延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標簽。

7.PCRSAGE實例SAGE實例錨定酶辟分AE一半結合結頭B一半結合結頭A標簽酶辟分TE標簽酶辟分TE