目錄2.1菌株的分離純化 12.1.1菌株的分離 12.1.2菌株的純化 12.2菌株的鑒定 22.2.1革蘭氏染色鏡檢 22.2.2菌株的生化鑒定 22.3藥敏試驗 32.3.1藥物的配制 32.3.2質控 42.3.3MIC（最小抑菌濃度）實驗 42.4CTX-M型基因的PCR擴增模板的提取 72.5CTX-M型基因的PCR擴增 72.5.1PCR擴增引物及條件 72.5.2電泳檢測PCR擴增產物 82.1菌株的分離純化2.1.1菌株的分離2.1.1.1實驗的準備1.分離管的準備：本實驗需要100個50ml離心管（1）用過的離心管，將蓋子擰開，加入清潔劑，沸水浴10min，毛刷清潔；（2）沒入加入清潔劑的水中，灌滿水，不要留有大氣泡；（3）放入超聲清潔機中超聲清潔45min，25℃（4）倒出管中水，灌滿去離子水，再超聲20min，25℃（5）倒出管中水，重復（4）一次；（6）倒出管中水，放入60℃（7）待烘干后裝入保鮮袋中，扎孔通氣，再用報紙或牛皮紙包好，放入高壓鍋中高壓滅菌，121℃，20min；（8）高壓后取出放入烘箱中，烘干后待用。2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所選試劑的規格進行配制，再送入高壓鍋中高壓滅菌，高壓后放入烘箱中烘干待用。注意瓶裝液體高壓前一定要蓋子擰松。3.試管的準備：本實驗需要100根試管（1）塞子拔出，與試管一起放入清潔劑水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清潔；（2）10個一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，報紙或牛皮紙包好，高壓；（3）取出后烘干待用。4.LB肉湯培養液的準備：本實驗需要100根LB管根據所選購商品說明配制，將配制好的LB培養液，分裝到100根干凈試管，每根3ml，包好后于121℃5.麥康凱瓊脂培養基的準備：按所選商品說明配制，121℃2.1.1.2（1）每個分離管裝入20mlBPW；（2）三點取樣剪取100份待檢肉樣分裝到100個分離管中，按肉樣的標號在分離管上標號，放入37±1℃（3）取分離管中的菌液50μL加入LB管中，標號，37±1℃溫箱搖床上培養10-12h，200r；（4）用接種環取一環菌液畫到麥康凱瓊脂培養基上，標號，37±1℃2.1.2菌株的純化2.1.21.伊紅美蘭（EMB）瓊脂培養基的準備：按所選商品的規格配制，121℃2.LB肉湯培養液的準備：同2.5.1.1.1中LB肉湯培養液的準備。2.1.2（1）接菌：用2.5μL或10μL移液槍的槍頭挑取麥康凱瓊脂培養基上的單菌落，將槍頭打到LB管中，標號，37±1℃（2）劃板：用接種環取一環菌液畫到麥康凱瓊脂培養基上，標號，37±1℃（3）用接種環挑取麥康凱瓊脂培養基上的單菌落劃到EMB板上，標號，37±1℃2.2菌株的鑒定2.2.1革蘭氏染色鏡檢在麥康凱瓊脂上長出紅色的菌落，在伊紅美蘭瓊脂上長出黑色、帶金屬光澤的菌落。挑取典型菌接種于MH肉湯培養基，37±1℃培養12-24h，取出12.2.2菌株的生化鑒定1.實驗準備生理鹽水、液體石蠟高壓進行滅菌，待用。提前復活菌株，吸取30-50μL甘油保存菌液于LB肉湯，搖床培養3-5h（時間因菌株活性不同做適當調整，此步主要是保證菌株全部復活）。純化菌株：將LB肉湯復活的菌株接種到麥康凱板，37℃2.實驗過程（1）接種前準備安瓿瓶：從包裝盒中取出安瓿瓶，朝易折點(瓶頸上藍點)反方向用力折開安瓿瓶，或用砂輪劃一圈安瓿瓶瓶頸處，然后用力掰開安瓿瓶，插入安瓿瓶架或雙面板中。試管：從包裝盒中取出試管，插入試管架中。注：如果染菌或變色，則不能使用，重新拿一支。折開安瓿瓶時最好包裹紗布，以免劃傷手指。（2）接種方法直接接種：用接種針從平板上挑取已純化分離的菌落接種于需要試驗的安瓿瓶（試管）中。菌懸液法：取一內盛有2ml無菌水試管，用接種針從平板上挑取已純化單個菌落至無菌水中仔細研磨制成0.5麥氏濁度的均一細菌懸液，滴入需要試驗的試管（安瓿瓶）中，每管3滴。注：如內容物為半固體或半固體生化管，采取直接穿刺接種。（3）接種完后用封口膜封口放于37±1℃注意，腸桿菌科葡萄糖鑒定管接菌后封口，倒放置進行培養；氨基酸類的要先用石蠟封口。(4)讀生化鑒定的結果，根據腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊查找到菌株的菌名以及陽性機率。生化反應判斷標準見表1，其中蛋白胨水需加靛基質溶液，苯丙氨酸需加三氯化鐵溶液，之后觀察顏色變化。葡萄糖產酸為陽性變成黃色標記A，不產酸則為陰性顏色不變，產氣則標記G，即產酸產氣標記為AG，產酸不產氣標記為A，產氣不產酸標記為G。表1腸桿菌科細菌生化反應判斷標準結果葡萄糖賴氨酸鳥氨酸硫化氫蛋白胨水乳糖衛茅醇苯丙氨酸尿素枸櫞酸鹽陰性紫色黃色黃色無色無色紫色紫色無色黃色綠色陽性黃色紫紅紫紅灰褐紅色黃色黃色綠色環紅色藍色經生化反應鑒定為大腸桿菌者，用大接種環在接有分離純化菌株的LB瓊脂平板上輕輕刮取菌落，接到含1mL30%甘油肉湯的EP管中；放于-20℃冰箱中保存，便于后續實驗用。如要長久保存，可用磁珠式菌種保藏管于2.3藥敏試驗2.3.1藥物的配制2.3.11.儲藥管的準備：用50ml離心管做為儲藥管，其準備過程同2.5.1.1.1中分離管的準備。2.慮管的準備：慮管用保鮮膜包好后放于燒杯中，報紙或牛皮紙封口，于121℃高壓20min2.3.1本實驗所用藥品需要配制成濃度為5120μg/mL，體積40mL。（1）稱藥：根據所購藥品的包裝上的濃度計算所要稱量的藥品量。如果包裝上沒有注明藥品濃度可根據瓶裝藥品按5120×40/90%=0.2276g稱取；袋裝藥品按5120×40/95%=0.2156g稱取。（2）溶解藥品：根據每種藥品的溶解方法來溶解以及定容稱量好的藥品；如氨芐西林（AMP）用超純水溶解即可，然后定容到40ml；氯霉素（CHL）用95%的乙醇溶解后，定容到40ml；環丙沙星（CIP）用10%的醋酸溶解后，定容到40ml。表2抗菌藥物的質控范圍及稀釋濃度梯度抗菌藥物溶劑質控范圍稀釋濃度梯度氨芐西林AMP超純水2-80.5-512頭孢噻呋CTFPBS+PBC0.25-10.125-512頭孢噻肟CTX超純水0.03-0.120.008-512頭孢他啶CTZ超純水0.06-0.50.03-512頭孢曲松CTR超純水0.03-0.120.008-512頭孢西丁CXT超純水2-80.25-512慶大霉素GEN超純水0.25-10.25-512卡那霉素KAN超純水1-40.5-512四環素TET超純水0.5-20.25-512環丙沙星CIP10%醋酸+超純水0.004-0.0150.004-512恩諾沙星ENR超純水0.004-0.030.004-512萘啶酸NAL1molNaOH+超純水1-40.25-512鏈霉素STR超純水2-80.5-1024阿米卡星AMI二甲基甲酰胺（DMF）+PBS0.5-40.25-512氟苯尼考FLF95%乙醇0.03-0.120.5-512氯霉素CHL95%乙醇+超純水2-160.125-512喹乙醇OQX超純水0.25-512（3）濾藥：在無菌的條件下進行，將高壓過的離心管、濾管，注射器，平皿，標簽紙，鑷子等在無菌超凈臺中紫外照射15min；①將配好的藥液倒入平皿中，注射器抽取，用鑷子在火焰上滅菌后夾取濾管的粗管處，安裝到注射器上；②注入到高壓過的儲藥管中；③用鑷子將濾管取下，再抽取藥液重復①②，直至藥液完全濾完；過濾另一種藥液時，要將平皿、注射器、濾管全部換新，不可重復用；④貼標簽：要注明藥品名稱、濃度、配制時間；如AMP5120μg/mL2013.4.2。放于—20℃2.3.2質控2.3.2MH肉湯培養液按其商品說明進行配制，配制好后于121℃高壓20min，放于超凈臺中待用。大腸桿菌標準菌株ATCC25922,購自中國獸醫藥品監察所2.3.2（1）復活大腸桿菌標準菌（ATCC25922）：取大腸桿菌ATCC25922接入LB肉湯試管中37±1℃（2）計算初始濃度：根據藥品的質控計算出第一孔所要稀釋的濃度；（3）第一孔中加入180μLMH肉湯，其余用排槍每孔加100μLMH肉湯，；（4）藥液的稀釋：用去離子水或MH肉湯稀釋，初始濃度=512/（n+2）以2μL藥液為初量進行稀釋，n為稀釋藥液所加MH肉湯的量；n:2即為藥品稀釋的倍數。（5）加藥液：取出稀釋的藥液20μL加入第一孔；每種藥物做兩行，96孔板的最后一行不加藥液也不加菌液，作為陰性對照。（6）倍比稀釋：取第一孔100μL液體移加到第二孔，從第二孔開始倍比稀釋，最后一孔吸取100μL棄去。（7）加菌液：用排槍除最后一排外每孔加100μL菌液；（8）蓋好96孔板，放于37±1℃（9）讀取結果。2.3.3MIC（最小抑菌濃度）實驗參照2012版CLSI(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，臨床實驗室標準研究所）指導原則和執行標準，用瓊脂二倍稀釋法，測定63株大腸桿菌對17種常用抗菌藥物的敏感性。用二倍稀釋法把各種藥物稀釋到所需的各個濃度梯度，分別定量加入高壓滅菌過的MH瓊脂在平皿中輕輕搖晃使之混合均勻，冷卻凝固，制成含所需藥物濃度的瓊脂平板。把稀釋至含菌量約為1.0×106CFU/mL的菌液用微量多點接種儀接種到MH瓊脂平板上，于37℃培養箱中倒置培養2.3.3MH瓊脂、MH肉湯培養液分別按其商品說明進行配制，121℃高壓20min；20ml移液管兩支包好于121℃高壓20min,烘干后待用；去離子水裝入瓶中于121℃2.3.3.2實驗過程第一天1.復活菌株：吸取30-50μL甘油保存菌液于到LB肉湯，搖床培養3-5h（時間因菌株活性不同做適當調整，此步主要是保證菌株全部復活）。復活的菌株包括47種受試離菌株和1株質控菌株。不同的菌種的質控菌株是不一樣的，參照CLSI上選取合適的質控菌株。2.純化菌株：將LB肉湯復活的菌株接種到麥康凱板，37℃過夜培養，18-24h。（所有受試菌株必須是單一的菌落形態而且有單個菌落存在）3.準備無菌室中過夜紫外照的物品：（1）高壓滅菌過的移液管（20或25ml，至少兩支）；（2）過夜泡酸并清洗過的96孔板（至少兩塊），烘干后，過夜照；（3）稀釋藥用的去離子水（已高壓）， MH肉湯（已高壓，稀釋菌液用）；（4）1ml槍頭，1ml槍，高壓過的章（接種儀）；（5）酒精燈，酒精棉，口罩，實驗服，記號筆，打火機，帶有濃度稀釋梯度的紙；（6）一次性平皿（藥物及濃度均標記好）。4.根據CLSI上每種藥物的質控范圍和耐藥臨界值來確定的藥物的濃度梯度，大到應該設置到耐藥臨界值上的1-2個梯度，小到應該設置到包括質控范圍內的1-2個濃度或設置到質控范圍的最小值下一個梯度，計算每種藥物所需的一次性平皿個數，計算時要各加一個空白板。5.準備足量的的MH瓊脂（20ml/平皿），壓好后置于60℃第二天1.將無菌室調至抽濕模式至少30min，一人在超凈臺接菌，挑單個菌落至MH肉湯中，搖床培養3-5h；一人在無菌室寫板，稀釋藥液。2.寫板時，在平皿底部一端寫出每種藥的稀釋度。若同時做兩個組份時，則應用不同顏色標記區分開；板上必須寫清藥名、濃度梯度。3.除512、256外，余下的濃度中各加入1ml水；需注意鏈霉素（STR）中，除1024外均加入1ml水。此時，要檢查有無漏寫的濃度；注意整個過程需在酒精燈附近操作。4.濃度編號為512、256、128，均加1ml原藥，從128開始倍比稀釋，最后一板棄去1ml。注意，此處根據自己設定的濃度，應有所變化，一般是依照自己所要設定的板上濃度、原藥濃度、最后加入瓊脂的體積來計算；且整個過程需在酒精燈附近操作。5.加瓊脂：512的藥板加9ml，其余加19ml，邊加邊搖晃，藥物均勻散在瓊脂板中，自然吹干；鏈霉素（STR）中均加19ml瓊脂。注意，瓊脂應當是冷卻到50-60℃6.收板：待平皿蓋上無水汽或有較少水汽時，從大濃度到小濃度收板即收好后每種藥物的小濃度板置于最上面，正放。7.稀釋菌液：超凈臺中酒精燈附近進行操作（6行8排），菌液濃度為0.5麥氏比濁時，按1：100的比例將各菌液濃度稀釋到1×106CFU?mL-1；并記錄96孔板上各菌株的順序。注意，所用96孔板，必須是打開蓋子過夜照過紫外或是新的已經滅過菌的；若菌液濃度不同，應當有所調整；吸取不同的菌液時，要換槍頭。8.接種細菌（又稱蓋章）：酒精燈旁，把接種儀放入96孔板中，先上下抽取混勻后，由低濃度至高濃度開始蓋，每次蓋三塊板，最高濃度后換下一種藥物時，加蓋空白板，從而緩沖前面藥物的高濃度對下一個藥物的低濃度的影響。9.蓋好后，約半個小時，等菌液全部吸收好后，將其倒置于37±1℃10.處理實驗用過的物品（煮章、煮菌液、移液管），洗凈后，包好，高壓，待下次用。第三天1.讀板將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，空白對照板上菌株應該是生長良好且無污染時，以抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。以三個或三個以下小型單菌落或出現了云霧狀的薄層菌落，為判斷為抑制生長。如果出現有3個以上菌落生長于含藥濃度高于終點水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現象，則應檢查培養物純度或重復試驗。2.在Excel表中輸入實驗結果；煮板。注：1.進無菌室首先帶上口罩，酒精棉擦手滅菌。2.盡量少說話，避免雜菌污染。3.加瓊脂時，要在酒精燈附近操作，注意看好移液管量程，以防加錯。另外要防止加瓊脂時瓶中瓊脂溫度過低，使得平板中瓊脂有凝塊而造成藥液不能均勻分布。所以，有凝塊的瓊脂不要使用。4.建議在做一批菌株時，先做一個平行，只要這個結果中的質控菌株對藥物的敏感性在質控范圍內，那么這次結果即有效，不用再做第二個平行；如不能滿足上述條件，那么將不滿足條件的藥物再重新做。5.實驗中所用的菌液必須是新鮮的，不能使用已經放置過很久的菌株。6.實驗中，要時刻記住無菌操作，避免污染。2.3.3.3參照2010版CLSI(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，臨床實驗室標準研究所）指導原則和執行標準，用瓊脂二倍稀釋法，測定63株大腸埃希菌對18種常用抗菌藥物的敏感性。以敏感、中介、耐藥3種形式對MIC大小作出解釋,判定標準如表3所示。表3大腸桿菌耐藥判定標準抗菌藥物AntibacterialagentsMIC解釋標準（μg/mL）S（Susceptive）I（Intermediate）R（Drugresistant）氨芐西林AMP ≤8 16≥32頭孢噻呋CTF*≤816≥32頭孢噻肟CTX≤12≥4頭孢他啶CTZ≤48≥16頭孢曲松CTR≤12≥4頭孢西丁CXT≤816≥32慶大霉素GEN≤48≥16卡那霉素KAN≤1632≥64四環素TET≤48≥16環丙沙星CIP≤0.060.12-0.5≥1恩諾沙星ENR*--≥2萘啶酸NAL≤16-≥32鏈霉素STR*--≥64阿米卡星AMI≤1632≥64氟苯尼考FLF*--≥32氯霉素CHL≤816≥32喹乙醇OQX*--≥64注：根據文獻報道，頭孢噻呋(CTF)的耐藥轉折點為8μg/mL；氟苯尼考(FLF)的耐藥轉折點32μg/mL；恩諾沙星(ENR)的耐藥轉折點為2μg/mL；鏈霉素(STR)的耐藥轉折點為64μg/mL[10]。喹乙醇(OQX)的耐藥轉折點為64μg/mL[20]。CLSI根據細菌學、藥動學和臨床資料設定并定期修訂抗生素對不同細菌敏感折點，通過折點將細菌分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。敏感（S）指被測菌株能被使用推薦劑量在感染部位通常可達到的抗菌藥物濃度所抑制。中介（I）指抗菌藥物最低抑菌濃度MIC接近血液和組織中通常科達到的濃度，療效低于敏感菌。還表示藥物在生理濃集的部位具有臨床效力（如尿液中的喹諾酮類和β-內酰胺類）。另外，中介還作為緩沖區，以防止微笑的技術因素失控導致較大的錯誤結果，特別是對那些藥物毒性范圍窄的藥物。耐藥（R）指被測菌株不能被常用劑量抗菌藥物所抑制，和/或抑菌環直徑落在某些特定的微生物耐藥機制范圍（如β-內酰胺酶），臨床療效不可靠。2.4CTX-M型基因的PCR擴增模板的提取（1）將LB管中的菌液倒入1.5mlEP管中，標號，離心，13000r，5min；（2）倒掉上清液，再將LB管剩余液體倒入EP管中，離心，13000r,5min；（3）倒掉上清液，每管均加入1ml去離子水，且將EP管中的的沉淀吹起，使之重懸，再離心13000r，5min；（4）倒掉上清液，每管均加入100μL去離子水，且將EP管中的的沉淀吹起，使之重懸；（5）放于—20℃（6）取出后離心，13000r，5min；（7）取上清液于新的EP管中，編號，—20℃2.5CTX-M型基因的PCR擴增2.5.1PCR擴增引物及條件根據目的基因的cDNA全長序列設計引物，采用PCR技術擴增目的基因。引物的序列為CTX-M（上游引物）：5'TTT