基于成份和遺傳多樣性的明黨參動態質量評價體系的構建

1ppt課件

研究計劃執行情況概述項目基本按照原計劃執行，內容略有增加：1.高效液相色譜技術（HPLC）分析了不同產地、不同個體明黨參化學成分合成之間的差異，探索了遺傳背景變異和化學成分合成之間的關聯。2.擴增片段長度多愛性的方法（AFLP）研究了不同產地、不同個體明黨參遺傳背景之間的差異。3.考慮到明黨參分布位置復雜，影響明黨參化學成分積累的因素很多，擴大取樣多研究結果的準確性和示范性具有更好的幫助，所以課題額外應用“中藥材產地適宜性分析地理信息系統”(TCMGIS)對明黨參Changium

smymioidesWolff.在全國的生態適宜區進行分析和預測，為以后研究的樣品選擇提供一定基礎。2ppt課件研究工作主要進展和所取得的成果一、HPLC分析不同產地，不同個體化學成分的含量差異二、AFLP分析不同產地，不同個體遺傳背景差異3ppt課件一、HPLC分析不同產地，不同個體化學成分的含量差異1.實驗材料：選擇明黨參主要種植地域江蘇句容和野生明黨參分布區域安徽丫山作為不同產地樣品，分析成分含量差異。同時在不同產地內部隨機選擇不同植株作為不同個體分析化學成分含量差異。4ppt課件2.實驗方法：水溶性成分HPLC分析，供試液制備：精密稱取1.000g明黨參根粉末，加水5mL,浸泡2h后,超聲提取30min,濾過,得到供試品溶液。色譜條件:C18反向色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相乙腈-0.025%磷酸洗脫，洗脫梯度見表1。流速0.8mL·min-1，進樣量25μL。5ppt課件t/min乙腈/%0.025%磷酸水/%04961349663257580496表1HPLC梯度洗脫程序6ppt課件3.不同產地和個體的化學成分組成和含量差異色譜圖及計算結果如下：圖1江蘇句容植株1化學成分液相色譜圖7ppt課件圖2江蘇句容植株2化學成分液相色譜圖8ppt課件圖3江蘇句容植株3化學成分液相色譜圖9ppt課件圖4江蘇句容植株4化學成分液相色譜圖10ppt課件圖5江蘇句容植株5化學成分液相色譜圖11ppt課件圖6安徽丫山植株1化學成分液相色譜圖12ppt課件圖7安徽丫山植株2化學成分液相色譜圖13ppt課件圖8安徽丫山植株3化學成分液相色譜圖14ppt課件圖9安徽丫山植株4化學成分液相色譜圖15ppt課件圖10安徽丫山植株5化學成分液相色譜圖16ppt課件4.從中選擇5種共有化學成分進行含量（峰面積）差異分句容丫山植株1植株2植株3植株4植株5植株1植株3植株3植株4植株5峰數34282435233654263431成分16.1788.3777.03210.6954,4717.42110.49410.9446.8884.41417ppt課件成分221.46133.25728.51320.30836.49016.17418.58631.9279.32616.123成分320.59441.23325.25921.07943.64127.38520.45045.1309.35316.821成分428.47715.04713.45838.08618.32821.57570.03214.32120.23217.707成分559.51769.82651.54743.85273.15672.896117.42864.28511.68816.41418ppt課件

二、AFLP分析不同產地，不同個體遺傳背景差異

1.明黨參基因組DNA提取根據UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0（Takara公司產品）方法提取明黨參總DNA，用TE溶解DNA，待用。

2.DNA濃度與質量測定用eppendorf的Biophotometer6131測定樣品DNA濃度(OD值)。以1.0%瓊脂糖凝膠檢測DNA主帶質量：5μLDNA樣品+1μL10×上樣緩沖液，于5V/cm電壓下電泳80min，EB染色，紫外燈下觀察、拍照。19ppt課件所得DNA樣品的主譜帶清晰，無拖尾、降解現象。紫外分光光度計測定結果:A260/A280值在1.8左右，濃度在100～400ng/μL。圖11

圖11明黨參基因組DNA電泳圖1：明黨參基因組DNA；M15000：DL15000

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20ppt課件3AFLP方法的建立

AFLP體系及程序參照Vos等方法并略有改動。3.1酶切反應

DNA用EcorⅠ和MseⅠ（上海生工生物工程技術服務有限公司）酶切，37℃3小時，65℃2小時。反應體系：DNA200ng，10×Buffer2μL，MseⅠ0.3μL（10U·μL-1），EcorⅠ0.25μL（10U·μL-1），加ddH2O至總體積10μL。21ppt課件3.2連接反應酶切產物在連接酶的催化下和接頭連接，16℃過夜。反應體系：酶切產物5μL，Buffer1μL，MseⅠ接頭（50μmol·L-1，5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，5′-TACTCAGGACTCAT-3′）0.5μL，EcorⅠ接頭（5μmol·L-1，5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，5′-AATTGGTACGCAGTC-3′）0.5μL，加ddH2O至總體積10μL。22ppt課件3.3預擴增反應體系預擴增條件：94℃變性3min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min（26個循環）；72℃延伸5min。反應體系：模板1μL，EcorⅠ（100ng·L-1，5′-GACTGCGTACCAATTC-3′）預擴引物0.3μL，MseⅠ（100ng·L-1，5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′）預擴引物0.3μL，Buffer2μL，dNTP（10mmol·L-1）0.4μL，MgCl2（25mmol·L-1）1.2μL，Tag酶（5u·μL-1）0.2μL，加ddH2O至總體積20μL。23ppt課件圖12預擴增電泳圖12：明黨參預擴產物；M2000：DL2000Marker

24ppt課件3.4優化選擇性擴增反應體系優化選擇性擴增反應條件，設立模板濃度梯度、酶離子濃度梯度、dNTP濃度梯度，擴增結果電泳檢測。選擇性擴增條件：94℃變性3min；94℃變性30s，65℃退火30s（每次循環下降0.7℃），72℃延伸1min（13個循環）；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min（24個循環）；72℃延伸5min。反應體系：EcorⅠ（100ng·L-1，5′-GACTGCGTACCAATTCNNN-3′）選擴引物0.25μL，MseⅠ（100ng·L-1，5′-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3′）選擴引物0.25μL，Buffer2μL，Tag酶（5u·μL-1）0.2μL，加模板、酶離子、dNTP、ddH2O至總體積20μL。25ppt課件3.5聚丙烯酰胺凝膠電泳分析依次量取30%聚丙烯酰胺12mL、5╳TBE6mL、10%過硫酸胺125μL、TEMED90μL，于燒杯中快速混勻（注意不產生氣泡）后，注入已安置妥當的玻璃板之間，插好梳子，膠充分凝結后待用。40W恒功率預電泳0.5h，在選擇性擴增產物中按5：3加入loadingbuffer（98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.125%溴酚藍，0.125%二甲苯氰），95℃變性8min，取出后立即置于冰浴中以防復性。60W恒功率電泳約2.5h。26ppt課件3.6銀染檢測電泳后的銀染檢測程序參照Bas-sam等方法。將有凝膠的短玻璃板放在2L10%冰醋酸中，輕搖約30min，至二甲苯氰顏色褪去。用超純水沖洗3次，每次2min。放入2L銀染液中輕搖，注意避光，以免硝酸銀見光分解，染色30~40min。用超純水迅速沖洗玻璃板10sec，然后放入2L預冷的顯色液中，輕搖至條帶顯現。在背景尚未變深時用10%冰醋酸終止顯色，漂洗，室溫干燥。數碼相機拍攝銀染結果。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測不同模板濃度、酶離子濃度、dNTP濃度對選擇性擴增反應的影響。結果表明：以1μL稀釋10倍的預擴增產物作為模板、1.5mmol·L-1MgCl2、0.6mmol·L-1dNTP進行選擇性擴增反應獲得DNA片段分子量范圍較廣（圖13）。27ppt課件圖13選擇性擴增產物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖模板濃度梯度（1.0.1μL；2.0.2μL；3.0.5μL；4.1μL；5.2μL）；MgCl2濃度梯度（6.1.0mmol·L-1；7.1.2mmol·L-1；8.1.5mmol·L-1；9.1.8mmol·L-1；10.2.0mmol·L-1）；dNTP濃度梯度（1.0.1mmol·L-1；2.0.2mmol·L-1；3.0.4mmol·L-1；4.0.6mmol·L-1；5.0.8mmol·L-1）28ppt課件4.AFLP研究不同產的和植株明黨參遺傳背景差異

AFLP研究結果表明遺傳背景差異上不同產地的明黨參顯著大于相同產地不同植株之間。遺傳距離和化學成分合成之間具有一定的相關性。29ppt課件

句容1句容2句容3句容4句容5丫山1丫山2丫山3丫山4丫山5句容1

0.00860.00630.01100.00820.01440.01860.01760.01370.0182句容20.0086

0.00790.00830.00920.01390.01370.01960.01340.0127句容30.00630.0079

0.00640.00810.00970.01240.01620.00850.0115句容40.01100.00830.0064

0.00730.01460.01280.00790.01180.0147句容50.00820.00920.00810.0073

0.01820.01190.01680.00730.0147丫山10.01440.01390.00970.01460.0182

0.00920.00970.00430.0052丫山20.01860.01370.01240.01280.01190.0092

0.00830.00790.0068丫山30.01760.01960.01620.00790.01680.00970.0083

0.00870.0067丫山40.01370.01340.00850.01180.00730.00430.00790.0087

0.0084丫山50.01820.01270.01150.01470.01470.00520.00680.00670.0084

30ppt課件目前國內學者對明黨參的研究大多集中于分類學、生物學特性、藥用及化學成分、系統進化的研究。迄今為止，有關明黨參遺傳背景的研究十分缺乏，僅有零星報道。進行植物遺傳多樣性研究的分子標記方法很多，其中AFLP技術效果最佳。AFLP操作過程繁瑣，而不同的研究材料有著不同的特性，所以在進行明黨參遺傳多樣性的AFLP標記分析時，建立最佳的反應體系是必不可少的基礎性工作。31ppt課件在PCR擴增反應中，Mg2+終濃度不僅影響TaqDNA聚合酶的活性，還能與dNTP、模板及引物結合，從而影響模板的解鏈溫度、引物與模板的結合效率以及產物的特異性。dNTP是AFLP反應的原料，dNTP濃度過高，導致擴增反應中模板與引物的錯配，使擴增出現非特異性，濃度過低又會影響擴增效率。因此，對于dNTP的最適用量也是需要經過對比分析才能確定的。所以本研究重點對Mg2+終濃度、dNTP濃度、模板用量進行了梯度對照，篩選到了最佳用量配比。擴增產物必須與完善的凝膠檢測手段結合，才會產生理想的AFLP指紋，選用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結合銀染檢測的方法具較強實用性，是一般實驗室可以考慮的方案。32ppt課件本文通過對AFLP分析過程選擇性擴增反應體系的優化，確定了適宜明黨參PCR擴增以及變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染檢測分析的最佳反應條件，獲得了理想的指紋圖譜，為研究明黨參遺傳多樣性及其種質資源保護等提供了良好的技術保障。33ppt課件。存在的問題、縱深研究的建議及其他需要說明的情況建議以部分常用大宗藥用植物為模式加強藥用植物化學成分尤其是有效成分積累與遺傳背景以及環境因子之間的關系研究，探索藥用植物有效成分積累的規律，為藥用植物的有效利用提供一定的理論基礎。34ppt課件論文、出版專著目錄1.基于TCMGIS的明黨參產地適宜性研究，安徽農業科學，已接受（接收函見附件）2.IdentificationofDifferentiallyExpressedGenesInvolvedintheEarlyBoltingofAngelicasinensis