生物化學蛋白質2生物化學蛋白質胰島素的一級結構：A鏈由21個氨基酸殘基組成;B鏈由30個氨基酸殘基組成

A鏈含一個鏈內二硫鍵A鏈與B鏈之間有二個二硫鍵SerGlyIleValGluGlnCysCysThrIleCysSerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsnPheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGlyGlyGluArgPhePheTyrThrProLysThrNH215101520COOHA鏈NH2151015202530HOOCB鏈3生物化學蛋白質

表中九種動物之間胰島素分子一級結構中存在的氨基酸殘基組成的差異不影響胰島素的生物活性。臨床上曾經應用豬和牛的胰島素治療人的糖尿病，取得了顯著的療效。

胰島素分子中氨基酸殘基的差異部分來源氨基酸殘基的差異部分A8A9A10B30人ThrSerIleThr豬TheSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrSerIleSer牛AlaSerValAla羊AlaGlyValAla馬ThrGlyIleAla抹香鯨ThrSerIleAla

鯨AlaSerThrAla4生物化學蛋白質（三）一級結構的種屬差異與分子進化不同生物細胞色素C的氨基酸差異數（以人為基數）

差異數差異數黑猩猩0響尾蛇14猴子1海龜15免9金槍魚21豬10小麥35牛10酵母51狗11驢12雞135生物化學蛋白質

動物體細胞色素C一級結構的進化樹圖中的數字表示該類動物與其祖先相比細胞色素C一級結構氨基酸殘基的差異數6生物化學蛋白質（四）一級結構與分子病

例鐮刀狀紅細胞貧血

HbAβ肽鏈N-Val.his.leu.thr.pro.glu.glu….C(146)

HbSβ肽鏈N-Val.his.leu.thr.pro.val.glu….C(146)這種由蛋白質分子異常引起的疾病，稱分子病7生物化學蛋白質8生物化學蛋白質9生物化學蛋白質二、肌紅蛋白和血紅蛋白的空間結構與功能的關系（一）肌紅蛋白的空間結構與功能的關系

肌紅蛋白（myoglobin,Mb）是由153個氨基酸殘基組成的單一多肽鏈的蛋白質，含8個螺旋（A、B、C、D、E、F、G、H），其輔基為血紅素。10生物化學蛋白質11生物化學蛋白質1221NCNC血紅蛋白的四級結構成人血紅蛋白由2條鏈和2條鏈組成,各亞基分別含一個血紅素.12生物化學蛋白質血紅蛋白空間結構與功能的關系

成人血紅蛋白由2個亞基與2個亞基組成的四聚體（22），每個亞基含1個血紅素分子。血紅蛋白每1個亞基可結合1個氧分子。一分子血紅蛋白4個亞基可結合運輸4個氧分子。13生物化學蛋白質14生物化學蛋白質

肌紅蛋白與血紅蛋白的帶氧曲線肌紅蛋白的氧飽和曲線為距形雙曲線,血氧飽和度為20%時仍能帶氧,肌肉缺氧時(氧飽和度為5%)大量釋放氧,以供肌肉收縮需要;血紅蛋白的氧飽和曲線為S形曲線,表明血紅蛋白四個亞基對氧的結合具有正協同效應。15生物化學蛋白質血紅素與氧結合：血紅素是4個吡咯環形成的鐵卟啉化合物，2價鐵離子居于中央。鐵離子有6個配位鍵，其中4個與4個吡咯環的N原子相連，1個與F8（-螺旋F中第8個殘基）組氨酸（93）相結合，氧分子則與第6個配位鍵相結合，血紅素未結合氧時，Fe偏離卟啉平面約0.06nm，偏向-螺旋F8組氨酸側，當結合氧后，Fe被拉入卟啉環中，這樣帶動F8發生位移，進而引發一系列構象改變。

16生物化學蛋白質17生物化學蛋白質氧分子與血紅蛋白的結合具有正協同效應

緊張態（T態）：鐵原子偏離卟啉平面約0.06nm,偏向F8His側，

121與22呈雙重對稱排布，對氧的親和力低。

松弛態（R態）：鐵原子被氧分子拉入卟啉環中，牽動作用Hb亞基三維結構發生改變，

亞基間鹽鍵斷裂，亞基間結合疏松，

121與22之間移位15°，對氧的親和力高。18生物化學蛋白質

血紅蛋白T態與R態血紅蛋白4個亞基的排布是1/1和22呈雙重對稱排布。緊張態（T態）Hb對氧的親和力低。當血紅蛋白結合氧時，由于鐵離子的位移帶動-螺旋F做相應的移動，進而引發亞基間的鹽鍵斷裂，使亞基間的結合松弛，1/1和22之間移位15；松弛態（R態）的Hb亞基對氧的親和力高，容易與氧結合。

15°11222112+O2–O2T態R態19生物化學蛋白質20生物化學蛋白質21生物化學蛋白質22生物化學蛋白質

正常朊病毒蛋白結構（顯示-螺旋）

朊病毒結構（顯示-片層結構）朊病毒蛋白（prionprotein,PrP）存在于人體神經原、神經膠質細胞等多種細胞的細胞膜上的糖蛋白。朊病毒是正常朊病毒蛋白空間構象由螺旋變成折疊所致。朊病毒本身不能自我復制，但可以攻擊大腦的正常朊病毒蛋白，使之構象改變并與其結合，形成朊病毒二聚體、四聚體。周而復始，腦組織中朊病毒不斷積蓄，造成腦組織發生退行性病變。23生物化學蛋白質第四節蛋白質的理化性質及其提取、純化原理24生物化學蛋白質25生物化學蛋白質26生物化學蛋白質（一）蛋白質的兩性電離

NH+3NH+

3NH3PPPCOOH

COO-COO-

蛋白質的陽離子蛋白質的兼性離子蛋白質的陰離子（等電點）+OH-+H++OH-+H+27生物化學蛋白質28生物化學蛋白質蛋白質膠體的性質：（1）粘度大（2）擴散速率慢（3）不能透過半透膜水化膜:帶電物質在水中存在時形成的界限膜,

有固定作用,使物質具有不能自由通透性,

使蛋白不易沉淀29生物化學蛋白質

蛋白質的沉淀、變性、凝固穩定蛋白質親水膠體性質的兩個因素：水化膜顆粒表面電荷30生物化學蛋白質31生物化學蛋白質Denaturation(變性)定義:

蛋白質的特定空間構象被破壞,從而導致其理化性質改變和生物活性喪失,稱蛋白質變性.32生物化學蛋白質33生物化學蛋白質變性蛋白質理化性質：（1）溶解度降低（2）粘度增加，結晶能力消失（3）生物活性喪失（4）容易被蛋白酶水解34生物化學蛋白質35生物化學蛋白質36生物化學蛋白質

牛胰核糖核酸酶分子的變性與復性變性：蛋白質在一些理化因素的作用下，其正常的空間構象遭到破壞，主要是次級鍵或二硫鍵發生破壞，導致蛋白質的理化性質的改變（如溶解度下降、粘度增加）和生物學活性的喪失。蛋白質的變性不影響其一級結構。37生物化學蛋白質38生物化學蛋白質變性物理因素：加熱、紫外線照射、超聲、劇烈震蕩等化學因素：強酸、強堿、有機溶劑、重金屬鹽等沉淀改變pH至pI破壞水溶液中蛋白質的水化膜和中和電荷（變性蛋白質）（蛋白質未變性）凝固加熱（變性，不再溶解）變性不一定沉淀沉淀不一定變性凝固均變性并不溶解加熱39生物化學蛋白質40生物化學蛋白質41生物化學蛋白質

酚試劑呈色反應（Lowrytest）：除蛋白質分子中肽鍵與堿性Cu2+發生二縮脲反應外，蛋白質分子中的色氨酸與酪氨酸殘基還將試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸鹽還原生成藍色化合物（鉬藍）42生物化學蛋白質43生物化學蛋白質蛋白質的理化性質與常用的純化方法理化性質相應的分離純化方法分子大小和形態差速離心、超濾、分子篩、透析溶解度鹽析、萃取、分配層析、結晶電荷差異電泳、等電聚焦電泳、離子交換層析生物功能專一性親和層析44生物化學蛋白質A：根據蛋白質分子大小分離純化蛋白質45生物化學蛋白質透析46生物化學蛋白質超濾（ultrafiltration）:

在一定的壓力下，使蛋白質溶液在通過一定孔徑的超濾膜時，小分子量物質濾過，而大分子量的蛋白質被截留，從而達到分離純化的目的。這種方法既可以純化蛋白質，又可達到濃縮蛋白質溶液的目的。

磁力攪拌器待超濾的蛋白質溶液加壓的氮氣超濾膜47生物化學蛋白質鹽析：

高濃度中性鹽使蛋白質從溶液中析出有機溶劑沉淀：

降低溶液的介電常數，使蛋白質分子間相互吸引而沉淀；有機溶劑與水作用，不斷壓縮大分子表面水層，使相互凝結析出B：改變蛋白質溶解度分離蛋白質48生物化學蛋白質有機溶劑沉淀：

降低溶液的介電常數，使蛋白質分子間相互吸引而沉淀；有機溶劑與水作用，不斷壓縮大分子表面水層，使相互凝結析出49生物化學蛋白質50生物化學蛋白質根據各種蛋白質在一定的pH環境下所帶電荷種類與數量不同的特點，將不同蛋白質予以分離。常用的方法有：

電泳離子交換層析等電聚焦

C：根據蛋白質電荷性質的分離方法51生物化學蛋白質電泳：帶電物質在外加電場作用下向相反電極移動的現象52生物化學蛋白質原點帶負電荷蛋白質的泳動方向濾紙、醋酸纖維素薄膜或其他支持物陽極陰極電極緩沖液電極緩沖液電泳示意圖電泳（electrophoresis）：53生物化學蛋白質54生物化學蛋白質55生物化學蛋白質56生物化學蛋白質57生物化學蛋白質58生物化學蛋白質等電聚焦（isoelectricfocusing,IEF）:在具有pH梯度的電場中進行的電泳。每種蛋白質均有其特定的等電點，在pH呈梯度的電場中，按其等電點不同，帶有不同的電荷，于是向與其帶電相反的電極方向泳動。這樣，在電泳時某一蛋白質遷移到電場中某一處的pH等于其等電點時，該蛋白質便因不帶電荷而停止泳動。這樣，各種蛋白質按其等電點不同得以分離。

+(H2SO4)

(NaOH)pH3pH10

+(H2SO4)

(NaOH)pI4.55.16.07.98.1pH3pH1059生物化學蛋白質將第一相膠條加到第二相電泳中，走向與第一相垂直等電聚焦(IEF)pH3.0pH10.0

第一相IEF按pI進行分離SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）電泳走向

第二相SDS

按分子大小分離pH3.0pH10.0++雙向電泳（twodimensionalelectrophoresis）：60生物化學蛋白質61生物化學蛋白質62生物化學蛋白質離子交換層析(ionexchangechromatography)：63生物化學蛋白質低鹽濃度洗脫液高鹽濃度洗脫液各試管進行連續收集混合蛋白質離子交換層析柱++++++++++++++++

離子交換層析分離蛋白質示意圖試管走行方向離子交換層析(ionexchangechromatography)：64生物化學蛋白質凝膠過濾（gelfiltration）：

凝膠過濾又稱分子篩層析，在層析柱內填充惰性的微孔膠粒（如交聯葡聚糖），將蛋白質溶液加入柱上部后，小分子物質通過膠粒的微孔進入膠粒，向下流動的路徑加長，移動緩慢；大分子物質不能或很難進入膠粒內部，通過膠粒間的空隙向下流動，其流動的路徑短，移動速度較快，從而達到按不同分子量將溶液中各組分分開的目的

65生物化學蛋白質66生物化學蛋白質67生物化學蛋白質

幾種蛋白質的分子量與沉降系數的關系在單位力場下，溶質分子的沉降速度與離心角速度、離心半徑呈正比，其比例常數為沉降系數，用S表示，單位為秒。=s·2一般蛋白質的沉降系數為10131012秒，故人們以Svedberg(S)單位來表示沉降系數，即1S=1013秒。沉降系數的大小與蛋白質的密度和形狀相關。69生物化學蛋白質70生物化學蛋白質71生物化學蛋白質（二）多肽鏈的氨基酸序列分析測序前的準備

N端分析以確定蛋白質的多肽鏈數目斷裂二硫鍵分離單一多肽鏈測定多肽鏈的氨基酸組成多肽鏈氨基末端與羧基末端分析二硝基氟苯（1-fluoro-2,4-dinitrobenzene）法丹酰氯(dansylchloride)法多肽鏈的氨基酸序列測定和重疊組合對多肽鏈進行限制性水解成小片段

Edman降解法進行小片段肽段的序列分析對各片段序列進行比較疊加，拼出完整的多肽序列72生物化學蛋白質相對熒光值04812谷天冬羧甲半胱天胺絲谷胺組甘蘇精丙氨基丁酸酪蛋纈苯丙異亮亮賴

氨基酸的高效液相色譜分析分析多肽鏈的氨基酸組成73生物化學蛋白質丹酰氯法檢測多肽鏈N-端示意圖74生物化學蛋白質常用的多肽鏈水解方法及其作用點75生物化學蛋白質

多肽片段的層析與電泳雙向分離

原點層析方向電泳方向不同長度和不同帶電狀態的肽片段多肽片段的分離76生物化學蛋白質NH2NCHR1CNOHCHR2CNOHCHR3CNOHCHR1CNOHCHR2CNOHCHR3CNOHHNCSNHCNHCNCSOR1HH2NCHR2CNOHCHR3CNOH多肽(氨基酸=n)異硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰多肽苯乙內酰硫脲衍生物6mol/L

HCl多肽(氨基酸=n-1)重復下一輪反應CSEdman降解法熒光時間77生物化學蛋白質氨基酸的組成分析：2苯、6丙、3蛋、4甘、2精、1賴、3亮、1酪、2絲、1蘇、1天、1纈、1異、1組多肽鏈的N端和C端的確定：H-甘，天-OH多肽的水解和肽段的測序：胰蛋白酶水解：甘-丙-丙-蘇-蛋-組-酪-苯-精甘-丙-絲-蛋-丙-亮-異-賴苯-甘-亮-蛋-丙-纈-絲-精亮-甘-丙-天溴化氰水解：甘-丙-丙-蘇-蛋組-酪-苯-精-甘-丙-絲-蛋丙-亮-異-賴-苯-甘-亮-蛋丙-纈-絲-精-亮-甘-丙-天多肽段的組合疊加：甘-丙-丙-蘇-蛋-組-酪-苯-精甘-丙-丙-蘇-蛋組-酪-苯-精-甘-丙-絲-蛋甘-丙-絲-蛋-丙-亮-異-賴丙-亮-異-賴-苯-甘-亮-蛋苯-甘-亮-蛋-丙-纈-絲-精丙-纈-絲-精-亮-甘-丙-天亮-甘-丙-天H-甘-丙-丙-蘇-蛋-組-酪-苯-精-甘-丙-絲-蛋-丙-亮-異-賴-苯-甘-亮-蛋-丙-纈-絲-精-亮-甘-丙-天-OH

兩種水解作用所得肽鏈的測序