高二生物微生物培養技術第1頁，課件共49頁，創作于2023年2月 (一)微生物實驗室培養1．培養基

(1)概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質。

(2)分類和應用第2頁，課件共49頁，創作于2023年2月劃分標準培養基種類特點用途物理性質液體培養基不加凝固劑工業生產半固體培養基加凝固劑，如瓊脂觀察微生物的運動、分類、鑒定固體培養基微生物分離、鑒定、活菌計數、保藏菌種化學成分天然培養基含化學成分不明確的天然物質工業生產合成培養基培養基成分明確(用化學成分已知的化學物質配成)分類、鑒定第3頁，課件共49頁，創作于2023年2月用途選擇培養基培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長培養、分離出特定微生物(如培養酵母菌和霉菌，可在培養基中加入青霉素；培養金黃色葡萄球菌，可在培養基中加入高濃度食鹽)鑒別培養基根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品鑒別不同種類的微生物，如可用伊紅—美藍培養基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤)第4頁，課件共49頁，創作于2023年2月(3)培養基配方及營養要素基本營養要素：各種培養基一般都含有水、碳源、氮源、無機鹽。此外還要滿足不同微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的需求。第5頁，課件共49頁，創作于2023年2月營養要素定義作用主要來源碳源凡能提供所需碳元素的物質構成生物體細胞的物質和一些代謝產物，有些是異養生物的能源物質無機化合物：CO2、NaHCO3；有機化合物：糖類、脂肪酸、花生餅粉、石油等氮源凡能提供所需氮元素的物質合成蛋白質、核酸以及含氮的代謝產物無機化合物：N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽；有機化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等特殊營養物質生長必不可少的微量有機物酶和核酸的組成成分維生素、氨基酸、堿基等第6頁，課件共49頁，創作于2023年2月水在生物體內含量很高，在低等生物體內含量更高不僅是優良的溶劑而且可維持生物大分子結構的穩定無機鹽為微生物提供除碳、氮以外的各種重要元素，包括大量元素細胞內的組成成分，生理調節物質；某些化能自養菌的能源，酶的激活劑第7頁，課件共49頁，創作于2023年2月特別提醒：①微生物最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是銨鹽、硝酸鹽。②對異養微生物來說，含C、H、O、N的有機化合物既是碳源，又是氮源、能源。③有些培養基不需要添加特殊營養物質，生物自己能合成，如大腸桿菌能合成某些維生素，作為特殊營養物質。④制備：計算→稱量→溶化→滅菌→倒平板。第8頁，課件共49頁，創作于2023年2月2. 無菌技術

(1)消毒和滅菌的區別條件結果常用的方法消毒較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線或化學藥物消毒法滅菌強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌第9頁，課件共49頁，創作于2023年2月特別提醒：用酒精消毒時，70%的酒精殺菌效果最好，原因是：濃度過高，使菌體表面蛋白質凝固成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。(2)無菌技術主要操作要求①實驗前應對操作空間、操作人員消毒，對所用器具和培養基滅菌。②實驗進行時需在酒精燈火焰周圍無菌區操作，另外要避免已滅菌處理材料再次污染。第10頁，課件共49頁，創作于2023年2月3．微生物的分離方法 方法一：平板劃線法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法。

(1)原理：在培養基上將細菌稀釋或分散成單個細胞，使其生長成單個的菌落，則這個菌落就是一個純化的細菌菌落。

(2)目的：分離由一個細菌繁殖而來的菌落。

(3)菌落判斷的依據：形狀、大小、表面、邊緣、隆起度、透明度、顏色等。

(4)實例；從酒曲中分離酵母菌。第11頁，課件共49頁，創作于2023年2月方法二：選擇培養基分離法。(1)原理：使分離對象大量繁殖，抑制其他微生物的生長。(2)適用范圍：分離的微生物在混合樣品中數量較少時。(3)實例：分離分解纖維素的細菌。第12頁，課件共49頁，創作于2023年2月(二)大腸桿菌分離與純培養(以及菌種的保藏)(1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養基：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。(2)純化大腸桿菌①原理：在培養基上將細菌稀釋或分散成單個細胞，使其長成單個的菌落，這個菌落就是一個純化的細菌菌落。②方法：平板劃線法、稀釋涂布平板法。平板劃線法是通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面；稀釋涂布平板法則是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。第13頁，課件共49頁，創作于2023年2月(3)菌種的保藏①短期保存：固體斜面培養基上4℃保存，菌種易被污染或產生變異。②長期保存：－20℃甘油管在冷凍箱中保藏。特別提醒：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的溫度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。第14頁，課件共49頁，創作于2023年2月1．分析下面培養基的配方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、 葡萄糖、尿素、瓊脂。請回答：

(1)在該培養基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是________和________。

(2)想一想這種培養基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進行選擇的？________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。第15頁，課件共49頁，創作于2023年2月(3)培養基、培養皿、接種環、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌、消毒方法依次是(

)①化學消毒②灼燒滅菌③干熱滅菌④紫外線滅菌⑤高壓蒸汽滅菌⑥巴氏消毒法A．⑤③②①④⑥

B．①②③④⑤⑥C．⑥②③④①⑤

D．③④②①⑥⑤第16頁，課件共49頁，創作于2023年2月解析：碳源是提供碳元素的物質，氮源是提供氮元素的物質。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。絕大多數生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以這種培養基對微生物有選擇作用。選擇的原則是只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。培養基用高壓蒸汽滅菌；培養皿能耐高溫，可用干熱滅菌；接種環可用灼燒滅菌達到迅速徹底的滅菌效果；實驗操作者的雙手可用化學藥劑進行消毒，如用酒精擦拭雙手；空氣可用紫外線消毒；牛奶為不破壞其營養成分可采用巴氏消毒法。第17頁，課件共49頁，創作于2023年2月答案：(1)葡萄糖尿素(2)有選擇作用。因為此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(3)A第18頁，課件共49頁，創作于2023年2月(一)原理：運用“選擇培養基”(能讓特定的被選擇的微生物生長，抑制其他微生物生長，從而從混雜的微生物群體中分離出特定的微生物)從混雜微生物選擇出特定微生物。(二)案例一——分解纖維素的微生物的分離第19頁，課件共49頁，創作于2023年2月1．纖維素酶

是一種復合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。2．纖維素分解菌的篩選原理

(1)剛果紅可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發生這種反應。

(2)纖維素分解菌能產生纖維素酶分解纖維素，從而使菌落周圍形成透明圈。第20頁，課件共49頁，創作于2023年2月3．土壤中纖維素分解菌的篩選流程

土壤取樣→選擇培養→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上→挑選產生透明圈的菌落。第21頁，課件共49頁，創作于2023年2月【深化拓展】1．纖維素分解菌的選擇培養基為液體培養基，因培養基中無凝固劑，利用液體選擇培養基以增加纖維素分解菌的濃度。2．為確定得到的菌種是否是纖維素分解菌，還需進行發酵產纖維素酶的實驗。纖維素酶的發酵方法有液體發酵和固體發酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產生的葡萄糖進行定量測定。3．流程中的“選擇培養”是否需要，應根據樣品中目的菌株數量的多少來確定。第22頁，課件共49頁，創作于2023年2月(三)案例二——土壤中分解尿素的細菌的分離與計算(注：這是人教版生物的精典案例)1．分離的原理

(1)土壤中的細菌之所以能夠分解尿素，是因為它們體內能合成脲酶。這種物質在把尿素分解成無機物的過程中起催化作用。

(2)實驗室中微生物篩選的原理：人為提供有利于目的菌菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。第23頁，課件共49頁，創作于2023年2月2．分離分解尿素的細菌所使用的特定培養基

分離分解尿素的細菌的培養基應為選擇培養基，培養基中的氮源只有尿素，理論上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生長。其配方如下：

KH2PO4

1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素(唯一氮源) 1.0g 瓊脂 15.0g 將上述物質溶解后，用自來水定容到1000mL。第24頁，課件共49頁，創作于2023年2月3．統計菌落數目的方法

(1)顯微鏡直接計數法 ①原理：利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數量。 ②方法：用計數板計數。 ③缺點：不能區分死菌與活菌。第25頁，課件共49頁，創作于2023年2月(2)間接計數法(活菌計數法)①原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。②操作a．設置重復組，增強實驗的說服力與準確性。b．為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。第26頁，課件共49頁，創作于2023年2月 ③計算公式：每克樣品中的菌株數＝×M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數。4．細菌分離與計數的實驗流程

土壤取樣→樣品稀釋→取樣涂布→微生物培養→觀察并記錄結果→細菌計數第27頁，課件共49頁，創作于2023年2月2．(2009·煙臺模擬)可以鑒定出分解尿素的細菌的方法是(

) A．以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑

B．以尿素為唯一氮源的培養基中加入二苯胺試劑

C．以尿素為唯一氮源的培養基中加入蘇丹Ⅲ試劑

D．以尿素為唯一氮源的培養基中加入雙縮脲試劑第28頁，課件共49頁，創作于2023年2月解析：在以尿素為唯一氮源的培養基中，不能分解尿素獲得氮源的細菌不能生長，而分解尿素的細菌能利用尿素作氮源，將尿素分解為氨，使pH升高。若培養基中加入酚紅指示劑，指示劑將變紅。此培養基既屬于選擇培養基，又屬于鑒別培養基。答案：A第29頁，課件共49頁，創作于2023年2月3．下圖為分離并統計分解纖維素的微生物的實驗流程，據此回答有關問題：(

)第30頁，課件共49頁，創作于2023年2月(1)要從富含纖維素的環境中分離纖維素分解菌，從高溫熱泉中尋找耐熱菌，這說明________。(2)某同學根據需要，配制了纖維素分解菌的培養基如下，整個實驗過程嚴格執行無菌操作。纖維素粉NaNO3

Na2HPO4·7H2O

KH2PO45g 1g 1.2g 0.9gMgSO4·7H2O

KCl酵母膏、水解酪素

0.5g 0.5g 適量如果將其中的纖維素粉換成________，菌落數__________，即可說明選擇培養基的作用。第31頁，課件共49頁，創作于2023年2月(3)接種微生物最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法，本實驗宜采用________法，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。第32頁，課件共49頁，創作于2023年2月解析：(1)因為纖維素分解菌與耐熱菌有不同的生活習性，生活在不同的環境中，故要根據目的菌株對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找。(2)因為葡萄糖是纖維素水解的、能被微生物直接利用的有機小分子，所以如果將其中的纖維素粉換成葡萄糖，纖維素分解菌及其他細菌會生長繁殖得更快，故菌落數明顯多于選擇培養基。(3)因為稀釋涂布平板法要將菌液進行一系列的梯度稀釋，故該法可根據稀釋體積計算每克樣品中的細菌數，而平板劃線法則不能這樣，所以本實驗宜采用稀釋涂布平板法。第33頁，課件共49頁，創作于2023年2月答案：(1)根據目的菌株對生存環境的要求，到相應的環境中去尋找(2)葡萄糖明顯多于選擇培養基上的菌落數(3)稀釋涂布平板平板劃線法難以根據稀釋體積計算每克樣品中的細菌數第34頁，課件共49頁，創作于2023年2月方法名稱步驟操作優點缺點顯微鏡直接計數法制成懸液在顯微鏡下觀察計數并計算出單位體積內的微生物總數所需設備簡單，同時能觀察到微生物的形態特征，適用于純培養懸浮液難以計數微小的細菌間接計數—稀釋平板計數法將待測樣品配制成均勻的系列稀釋液，使其均勻分布于培養基內，就由單個微生物生長繁殖形成菌落根據微生物的培養特征而設計的，能觀察菌落的特征，且在含菌數較少的情況下也可完成第35頁，課件共49頁，創作于2023年2月特別提醒：①在稀釋平板計數法中，應注意設置重復組，增強實驗的說服力與準確性。②為了保證結果準確，統計菌落數時，細菌、放線菌、酵母菌以每個培養皿內有30～300個菌落數為宜；霉菌以每個培養皿內有10～100個菌落數為宜。參見下面例3第36頁，課件共49頁，創作于2023年2月【例1】(2009·全國卷Ⅱ)利用微生物分解玉米淀粉生產糖漿，具有廣闊的應用前景。但現有野生菌株對淀粉的轉化效率低，某同學嘗試對其進行改造，以獲得高效菌株。

(1)實驗步驟： ①配制________(固體、半固體、液體)培養基，該培養基的碳源應為________。 ②將________接入已滅菌的培養基平板上。 ③立即用適當劑量的紫外線照射，其目的是________。第37頁，課件共49頁，創作于2023年2月④菌落形成后，加入碘液，觀察菌落周圍培養基的顏色變化和變化范圍的大小。周圍出現________現象的菌落即為初選菌落。經分離、純化后即可達到實驗目的。(2)若已得到兩株變異菌株Ⅰ和Ⅱ，其淀粉轉化率較高。經測定菌株Ⅰ淀粉酶的催化活性高，菌珠Ⅱ的淀粉酶蛋白含量高。經進一步研究發現，突變發生在淀粉酶基因的編碼區或非編碼區，可推測出菌株Ⅰ的突變發生在________區，菌株Ⅱ的突變發生在________區。嘗試自解：________第38頁，課件共49頁，創作于2023年2月思路點撥：依據獲得高效轉化淀粉的菌種的實驗目的，確定在對細菌進行培育、篩選時，培養基中應以淀粉為唯一碳源，培養基類型應該是固體培養基。高產菌株培育的常用方法是人工誘變，即利用紫外線、X射線、亞硝酸等物理或化學方法處理微生物，誘導其發生基因突變。轉化淀粉效率高的菌落周圍加碘液后，應該顏色淺且范圍大。基因結構的非編碼區主要控制基因的表達，人工誘變非編碼區突變，可能提高(或降低)編碼蛋白(淀粉酶)的產量；編碼區則與蛋白質(淀粉酶)的分子結構有關，誘變可能提高酶的催化活性。第39頁，課件共49頁，創作于2023年2月答案：(1)①固體玉米淀粉②野生菌株③對野生菌株進行誘變處理④淺色范圍大(2)編碼非編碼解題技巧：本題是一道實驗設計題，因以填空的形式進行考查，使實驗設計的考查難度下降。答題時，應先整體閱讀，以獲得實驗設計的主要思路和考查的主要內容。如實驗步驟①中培養基類型的選擇，可以從本實驗通過觀察菌落篩選新菌種得到啟發，因為菌落必須在固體培養基中才能形成；從“現有野生菌株對淀粉的轉化效率低”“獲得高效菌株”確定培養基碳源應該使用淀粉等。第40頁，課件共49頁，創作于2023年2月【例2】某生物興趣小組進行研究性學習，探究“影響細菌生長繁殖的因素”。在培養細菌的過程中，發現某種細菌(記作R菌)周圍的其他細菌的生長繁殖受到抑制，他們把R菌接種到專門的培養基上進行培養。一段時間后，他們除去R菌，用該培養基再培養其他細菌，結果，其他細菌不能在這個培養基上生長繁殖。

(1)從生態學的角度分析，R細菌與周圍細菌之間的關系是________。第41頁，課件共49頁，創作于2023年2月(2)某同學假設了造成R菌周圍的其他細菌不能生長繁殖的原因，你認為最可能的原因是______。A．R菌占據了其他細菌的生存空間B．R菌吞噬了其他細菌C．R菌產生了不利于其他細菌生存的物質D．R菌更容易吸收培養基中的物質(3)參照上述題目中給出的有關材料，請設計一個實驗，對第(2)問所做的選擇進行驗證，簡述你的實驗步驟及結論。第42頁，課件共49頁，創作于2023年2月①方法步驟：第一步：取兩個培養皿，按相同營養成分分別配制甲、乙兩個培養基。第二步：___________________________________________。第三步：___________________________________________。第四步：在相同條件下，讓甲、乙兩個培養基上的細菌生長繁殖。②結果：___________________________________________。③結論：__________________________________________。嘗試自解：________第43頁，課件共49頁，創作于2023年2月思路點撥：兩種生物生活在一起，因食物和生活空間而進行斗爭的現象稱為競爭。在驗證造成R菌周圍其他細菌不能生長繁殖的原因的實驗中，培養基中是否含有R菌產生的不利于其他細菌生存的物質是唯一變量(自變量)。如何證明R菌產生不利于其他細菌生存的物質是本實驗設計的關鍵點。在實驗中，其中一個培養基上接種R菌，另一個培養基中不接種。培養一段時間后除去R菌(除去R菌的方法不做要求)，獲得實驗組，沒有培養R菌的培養基作為對照組，再分別接種相同的其他細菌，培養后觀察細菌的生長狀況即可得出結論。第44頁，課件共49頁，創作于2023年2月答案：(1)競爭(2)C

(3)第二步：甲培養基上接種R菌，培養一段時間后除去R菌，乙培養基上不接種R菌，作為對照第三步：兩個培養基分別接種相同的其他細菌②甲培養基上的細菌的生長繁殖受到抑制，乙培養基上的細菌能正常生長繁殖③R菌產生了不利于其他細菌生長繁殖的物質第45頁，課件共49頁，創作于2023年2月技巧提示：微生物的相關實