組織培養與植物轉基因1第1頁，課件共45頁，創作于2023年2月植物基因工程是80年代開始興起和發展起來的一門新技術，它是在分子遺傳學的理論基礎上，綜合采用了分子生物學、微生物學和植物組織培養的現代方法和技術建立起來的。轉移的目的基因可從動物、人、植物或微生物中獲取。植物基因工程首先是隨原核生物的基因工程的發展而得以發展。大腸桿菌，酵母，動植物細胞。2第2頁，課件共45頁，創作于2023年2月植物基因工程發展迅速。自從1983年首例轉基因植物（煙草）誕生以來，現在已有100多種植物通過基因工程技術獲得了轉基因植株，包括番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、胡蘿卜、芹菜、萵苣、甜瓜、黃瓜、白菜、甘藍、花椰菜、芥菜、石刁柏、洋蔥、柑橘、柿、楊樹、桉樹等。3第3頁，課件共45頁，創作于2023年2月2植物基因工程的載體Ti—載體其它載體RNAi

4第4頁，課件共45頁，創作于2023年2月根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）的Ti質粒（Tumor-inducingplasmid）的改建與利用，從而開創了植物基因工程的新紀元。根癌農桿菌5第5頁，課件共45頁，創作于2023年2月6第6頁，課件共45頁，創作于2023年2月7第7頁，課件共45頁，創作于2023年2月8第8頁，課件共45頁，創作于2023年2月T－DNA9第9頁，課件共45頁，創作于2023年2月植物基因工程中，我們把接受外源(目的)基因的生命體系稱為“受體”。受體包括：葉圓片(盤)、胚性愈傷、胚狀體、愈傷組織、懸浮細胞、原生質體等不同的形態。其基本形態還是細胞。葉圓片與農桿菌共培養是最簡單的轉化方法；愈傷組織的轉化效率高、生長速度快，是快速檢測外源基因表達的最好受體；原生質體則是單克隆轉化的最佳材料。3植物基因轉化的受體10第10頁，課件共45頁，創作于2023年2月轉化植株（未）受精卵細胞花粉胚胚軸子葉葉片莖段萌發種子子房原生質體懸浮培養細胞花器官根創傷植株塊莖莖尖植物基因轉化的外植體11第11頁，課件共45頁，創作于2023年2月被轉化的受體細胞是單個獨立的細胞，為選擇遺傳均一性的轉基因植株提供了可能性。以懸浮細胞作受體的轉化方法包括：農桿菌介導法、基因槍法、PEG介導法、電激法和顯微注射法等。3.1懸浮細胞12第12頁，課件共45頁，創作于2023年2月原生質體是無細胞壁的細胞。與懸浮細胞一樣，被轉化的受體細胞是單個獨立的細胞，為選擇遺傳均一性的轉基因植株提供了可能性。3.2原生質體13第13頁，課件共45頁，創作于2023年2月愈傷組織容易大量制備愈傷組織的轉化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上獲得成功。用農桿菌介導法最適合。3.3胚性愈傷組織14第14頁，課件共45頁，創作于2023年2月胚狀體是由愈傷組織經過改造后分化而來的，其轉化方法與愈傷組織相同。3.4胚狀體15第15頁，課件共45頁，創作于2023年2月葉圓片是農桿菌轉化的主要受體。也稱為葉盤法。用打孔器或解剖刀切取直徑3—5mm的葉圓片；在液體培養瓶中與農桿菌共培養20-30min；將葉圓片在濾紙上吸干；轉移到非選擇性培養基上培養3d；再移入含抗生素的選擇培養基上培養；誘導植株再生；獲得轉基因植株。葉盤法常見于雙子葉植物的遺傳轉化。3.5葉圓片16第16頁，課件共45頁，創作于2023年2月如子葉、胚軸、莖段、根、體細胞胚、花粉等3.6其他受體17第17頁，課件共45頁，創作于2023年2月農桿菌介導法(Agrobacterium-mediatedtransformation)基因槍轉化法(Microprojectilebombardment)聚乙二醇-介導法(PEG-mediatedtransfomation)電激法(Electroporation)花粉管通道法(Pollen-tubepathway)顯微注射法(Microinjection)脂質體轉化(Liposomestransformation)激光微束轉化法(Lasermicrobeampuncture)

4植物基因轉化的方法18第18頁，課件共45頁，創作于2023年2月根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefacience)介導法是植物基因轉化中使用最普遍的一種方法。其Ti質粒(Tumor-inducingplasmid)具有將DNA整合到植物染色體上，并使之與植物內源基因同步表達的能力。每個Ti質粒都有3個功能區域。一是T-DNA區，即轉化DNA區，與病癥發生有關的基因位于這個區，決定著腫瘤形態和冠癭堿的合成；二是Vir區，是T-DNA區以外的與感染腫瘤有關的區域；三是分解和利用冠癭堿的區域，分布著冠癭堿分解酶基因。4.1農桿菌介導法19第19頁，課件共45頁，創作于2023年2月4.2微彈轟擊法原理：金屬微粒在外力作用下達到一定速度后，可以進入植物細胞，但又不引起細胞致命傷害，仍能維持正常的生命活動。也稱為基因槍法。利用這一特性，先將含目的基因的外源DNA同鎢、金等金屬微粒混勻，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨后用基因槍轟擊，使DNA隨高速金屬微粒進入植物細胞。此方法可直接處理植物某器官或某組織，是當今普遍使用的植物轉基因方法。20第20頁，課件共45頁，創作于2023年2月21第21頁，課件共45頁，創作于2023年2月聚乙二醇介導法與PEG誘導原生質體融合的機理相似，不同的是后者發生在原生質體之間，而前者發生在原生質體與DNA之間。在高濃度的二價鈣離子(Ca2+)和高pH值的條件下，略帶負電的高分子PEG可能促進DNA向原生質體膜沉淀，或參與原生質體的內吞作用下，使外源DNA分子進入原生質體和細胞核，并整合到染色體上。4.3聚乙二醇-介導法22第22頁，課件共45頁，創作于2023年2月4.4電激法原理：細胞膜的基本組成是磷脂，在適當的外加脈沖電場作用下，細胞膜被擊穿，但還達不到細胞致命傷害。所以當移去外加電場后，被擊穿的膜孔可自行復原。也稱為電穿孔法。根據這一性質，植物原生質體同外源DNA分子混合，置于電擊儀的樣品室中，按預定的參數進行直流電脈沖處理，再通過常規的再分化培養和篩選，可獲得轉基因植株。為避免制備原生質體和原生質體再生植株的困難，近來用此技術直接處理具有完整細胞壁的植物細胞、愈傷組織和花粉粒，均取得一定的效果。23第23頁，課件共45頁，創作于2023年2月24第24頁，課件共45頁，創作于2023年2月25第25頁，課件共45頁，創作于2023年2月4.5花粉管通道法原理：將重組DNA涂于授粉的柱頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進入胚囊，轉化尚不具有正常細胞壁的卵、合子和早期的胚胎細胞，在活體內產生轉基因種子。26第26頁，課件共45頁，創作于2023年2月花粉管通道法27第27頁，課件共45頁，創作于2023年2月4.6顯微注射法原理：利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受體的細胞質或細胞核中。重要問題：必須把受體細胞進行固定。動物細胞具有獨特的貼壁生長待性，因此不存在固定細胞的問題。植物細胞的顯微注射必須建立固定細胞技術。目前有三種方法：①瓊脂糖（低熔點）包埋法；②多聚-L-賴氨酸粘連法；②吸管（毛細管）支持法。28第28頁，課件共45頁，創作于2023年2月4.7脂質體介導法原理：脂質體是由人工構建的磷脂雙分子層組成的膜狀結構，把用來轉染的DNA分子包在其中，通過脂質體與細胞接觸，將外源DNA導人受體細胞。包裝成脂質體的DNA的轉染串比裸露的DNA的轉染率高出100倍。如先用PEG處理培養的受體細胞，使其易吸收培養基中的脂質體，可提高轉染率10—20倍。在正常情況下，每個細胞平均可吸收1000個左右的脂質體。這是哺乳動物轉基因研究中常用的方法之一。29第29頁，課件共45頁，創作于2023年2月4.8激光微束穿孔法原理：利用直徑很小（納米級）、能量很高的激光微束可引起細胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下用激光處理細胞，處于細胞周圍的重組DNA隨之進入細胞。此方法最適用于活細胞中線粒體和葉綠體等細胞器的基因轉移。30第30頁，課件共45頁，創作于2023年2月31第31頁，課件共45頁，創作于2023年2月植株再生是基因轉移的關鍵步驟，直接決定能否獲得轉基因植株。兩種形式：一種是愈傷組織再生另一種是直接再生，從外植體直接誘導出芽而不經過愈傷組織的分化。轉墓因植株再生的方式與一般植株再生的方式相同，主要區別是轉基因植株的再生受外源基因、載體系統、抗生素、轉化過程的影響。5轉基因植株的再生及其檢測方法5.1轉基因植株再生32第32頁，課件共45頁，創作于2023年2月常采用報告基因作為標記，以便快速檢測。主要采用分子生物學方法檢測，包括：聚合酶鏈式反應(PCR)、Southern

Blot、NorthernBlot和WesternBlot等方法。進行分子生物學檢測以后還要進行生物學鑒定，以確定基因是否可以正常地表達性狀，并穩定地遺傳給后代。如果一些有價值的目的基因被轉入，還必須鑒定基因的功能及其表型。5.2轉基因植株的檢測33第33頁，課件共45頁，創作于2023年2月如轉化抗病毒基因：要對轉基因植物進行病毒接種，以鑒定抗病毒能力。若轉化的基因為抗除草劑基因：還要對植物噴灑除草劑進行檢測。若轉基因植物是食用糧食作物或油料：還要通過轉基因植物的安全性檢測，以免對人類和環境造成危害。如果轉化的是花色素合成酶基因：則憑肉眼就可直觀鑒定花色變化。34第34頁，課件共45頁，創作于2023年2月35第35頁，課件共45頁，創作于2023年2月6植物轉基因產品的安全性

國際大討論36第36頁，課件共45頁，創作于2023年2月斑蝶事件：1999年5月，康奈爾大學的一個研究組在《Nature》雜志上發表文章，聲稱轉基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導致44％的幼蟲死亡。現在這個事件也有了科學的結論：第一，玉米的花粉非常重，擴散不遠，在玉米地以外５米，每一平方厘米馬利筋葉片上只找到一個玉米花粉。第二，2000年開始在美國三個州和加拿大進行的田間試驗都證明，抗蟲玉米花粉對斑蝶并不構成威脅，實驗室試驗中用10倍于田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發現對其生長發育有影響。斑蝶減少的真正原因，一是農藥的過度使用，二是墨西哥生態環境的破壞。37第37頁，課件共45頁，創作于2023年2月加拿大“超級雜草”事件：由于基因漂流，在加拿大的油菜地里發現了個別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級雜草”。事實上，這種油菜在噴施另一種除草劑2，4-Ｄ后即被全部殺死。應當指出的是，“超級雜草”并不是一個科學術語，而只是一個形象化的比喻，目前并沒有證據證明已經有“超級雜草”的存在。同時，基因漂流并不是從轉基因作物開始，而是歷來都有。如果沒有基因漂流，就不會有進化，世界上也就不會有這么多種的植物和現在的作物栽培品種。38第38頁，課件共45頁，創作于2023年2月墨西哥玉米事件：2001年11月，美國加州大學伯克萊分校的兩位研究人員在《Nature》上發表文章，聲稱在墨西哥南部Oacaca地區采集的６個玉米地方品種樣本中，發現有CaMV35S啟動子及NovartisBtll抗蟲玉米中的adh1基因相似序列。綠色和平組織借此大肆渲染，說墨西哥玉米已經受到了“基因污染”，甚至指責墨西哥小麥玉米改良中心的基因庫也可能受到了“基因污染”。文章發表后受到很多科學家的批評，。所謂測出的35S啟動子，經復查證明是假陽性。所稱Ｂｔ玉米中的adh1基因已經轉到了墨西哥玉米的地方品種，也是假的。轉入Ｂｔ玉米中的基因序列是adh1

-S基因，而作者測出的是玉米中本來就存在的adh1

-IF基因，兩者的基因序列完全不同，是兩碼事。顯然作者沒有比較這兩個序列，審稿人和《Nature

》編輯部也沒有核實。墨西哥小麥玉米改良中心（CIMMYT）也發表聲明指出，經對種質資源庫和新近從田間收集的152份材料的檢測，在墨西哥任何地區都沒有發現35S啟動子。39第39頁，課件共45頁，創作于2023年2月中國Ｂｔ抗蟲棉破壞環境事件：2003年６月３日，南京環科所與綠色和平組織在北京召開會議，６月４日《ChinaDaily》上發表了題為“GMCottonDamageEnvironment”的文章，亦即“轉基因抗蟲棉破壞了環境”。綠色和平組織也于當天在其網站上刊登了南京環科所、綠色和平組織顧問薛達元先生長達26頁的英文報告，從而再次引發國際爭論，在歐、美產生巨大反響，成為國際上爭論轉基因作物安全性的重大事件之一。40第40頁，課件共45頁，創作于2023年2月6月5日德國《農業報》發表了題為“ChineseResearch:largeEnvironmentDamagebyBtCotton”的文章，即：“中國研究：Bt棉破壞環境巨大”。綠色和平組織的“中國項目主管”盧思聘聲稱：棉農“將面對不受控制的超級害蟲”（這里他又全無科學根據地提出了“超級害蟲”的新名詞！），“聲稱可以減少農藥使用的轉基因抗蟲棉，不但沒有解決問題，反而制造了更多的問題”，“（棉農）將被迫使用更多、更毒的化學農藥”。抗蟲棉在中國實踐多年，深受廣大棉農的歡迎，相信不會同意他的這些結論。中國、美國、德國、加拿大、比利時、印度等國的科學家已在網上紛紛發表評論，反駁綠色和平組織的觀點。41第41頁，課件共45頁，創作于2023年2月（1）國際轉基因作物爭論的實質并不純粹是科學問題，而是經濟和貿易問題。現在轉基因作物的安全性已經成了國際貿易的技術壁壘。（2）爭論應該以科學為基礎，目前批準商業化的轉基因作物及其產品還沒有發現環境和食品安全性問題。長期效應需要跟蹤，包括非預期效應，但非預期效應的分析必須與安全性評價相結合。（3）歸結到一點，今天與反生物技術組織的爭論，是要不要轉基因作物及其產品、要不要科學和社會