實驗五

一些試劑對四膜蟲影響的觀察一、實驗目的1、了解生存環境對生命的重要意義。2、比較各種因素對四膜蟲細胞的影響。二、實驗原理細胞生存需要一定的條件。四膜蟲也不例外。其形態比較固定，細胞較大，它的纖毛和伸縮泡及其本身都在不停的運動。一旦條件發生變化，四膜蟲所發生的反應馬上就可以被觀察到。本實驗通過一些常見的化學試劑，以不同的濃度對四膜蟲進行處理，觀察較短時間內細胞所產生的效應。

1、酸和堿每種生物對環境的酸堿度都有一定的影響，水生生物（包括四膜蟲）和培養的組織細胞更是如此。酸堿度超過一定的限度，對細胞的生存不利，甚至會將其殺死！深海海水的酸堿度約為pH8左右。大面積的淡水水域酸堿度也較穩定，約在pH6～9之間。海洋和湖泊等水域有較強的調節pH的能力。這是由于水域中存在著H2CO3和碳酸鹽的緩沖系統。即使局部地區發生了pH的變化，在一定范圍內經過一定時間也能通過這一緩沖系統而恢復正常。但是如果環境污染(酸雨、廢酸排放)超過了水域的調節能力，水域的pH就要發生變化，生物的生存和發育就要受到影響。酸堿度的改變對生物的生長生殖和活動都能發生影響。例如，綠草履蟲(Parameciumbarsaria)，在酸性的培養液中(pH6.0～6.3)，體長可達120μm，在堿性培養液中(pH7.6～8.0)，體長只有86μm。海膽卵在pH6.2的水中不能受精，pH低于4.6時死亡。各種微生物都有其最適酸堿度。酵母和霉菌適宜在微酸性環境中。也有少數可以在強酸或強堿性環境中生存。氧化劑可使蛋白質變性，破壞生物膜結構，在濃度較高時能迅速殺死細胞。常用的消毒劑如次氯酸鈉、雙氧水都是強氧化劑。強氧化劑的殺菌作用：強氧化劑容易同細菌的細胞壁中的脂蛋白或細胞膜中的磷脂質、蛋白質發生化學反應，從而使細菌的細胞壁和細胞膜受到破壞（即所謂的溶菌作用），細胞膜的通透性增加，且氧化劑迅速擴散進入細胞內，氧化了細胞內酶或RNA、DNA，從而致死菌原體。巰基乙醇是常用的還原劑，微量巰基乙醇可防止某些生物活性物質的活性基團及酶的活性中心受到破壞。

巰基試劑在生化反應中有兩個用途，一是防止蛋白質或酶等分子中的SH-基氧化成S-S，二是某些酶反應中維持體系的還原環境。經常應用的巰基試劑有二硫丁醇類化合物（如二硫蘇糖醇DTT、二硫赤酰糖醇DTE）和2-巰基乙醇，谷胱甘肽也經常應用。巰基乙醇有毒！對環境有危害，對水體可造成污染。

2、氧化劑和還原劑去垢劑是一些具有親水的極性基團和疏水的非極性基團的長鏈分子。非離子型去垢劑如TritonX-100可與脂雙層形成混合微團，它們主要與蛋白質疏水部位相互作用，一般不會引起蛋白質變性。而離子型去垢劑與蛋白結合后可改變蛋白質結構，使之變性，尤其是加熱后可使蛋白質解離為單體，如十二烷基磺酸鈉（SDS）等。

3、去垢劑去垢劑能破壞細胞膜結構，造成細胞損傷、功能喪失，甚至引起死亡。非離子型去垢劑通過溶解膜上的脂蛋白和磷脂類化合物等，使細胞膜結構改變。

4、高滲溶液滲液壓對細胞的影響：水通過細胞膜的運動方向主要決定于細胞外環境的滲透壓。在正常情況下細胞外的滲透壓與細胞內滲透壓處于平衡狀態，細胞維持正常的形態與生理功能。高滲液可使細胞失水，引起細胞形態/功能的改變；低滲液可使細胞膨脹，甚至破裂。細胞膜具有對物質選擇透過的生理功能。脂溶性越高通透性越大，水溶性越高通透性越小；非極性分子比極性容易透過，小分子比大分子容易透過。水分子可通過水通道進出細胞膜；非極性的小分子如O2、CO2、N2可以很快透過脂雙層，不帶電荷的極性小分子，如尿素、甘油等也可以透過人工脂雙層，盡管速度較慢，分子量略大一點的葡萄糖、蔗糖則很難透過，而膜對帶電荷的物質如：H+、Na+、K+、Cl—、HCO3—是高度不通透的。不同分子透過人工脂雙層的能力水通道是處于持續開放狀態的膜通道蛋白，水分子的轉運不需消耗能量，也不受門控機制影響。水分子通過水通道的移動方向完全由膜兩側的滲透壓差決定，水分子從滲透壓低的一側向滲透壓高的一側移動，直到兩側滲透壓達到平衡。第一個被發現的水通道蛋白APO1（引自http:///）四膜蟲為淡水性原生生物，有伸縮泡來調節滲透平衡，耐低滲，但高滲對其有影響！可注意觀察在不同濃度蔗糖和NaCl溶液中細胞發生的變化！

5、有毒物質疊氮鈉：劇毒，可強烈地抑制并阻斷線粒體中細胞色素電子運送系統。甲醛：能使蛋白質變性，常作為防腐劑、固定劑使用。

6、其他物質DMSO二甲亞砜，是一種溶于水又溶于有機溶劑的極為重要的非質子極性溶劑；也是一種滲透性保護劑，能夠降低細胞冰點，減輕自由基對細胞損害，改變生物膜對電解質、藥物、毒物和代謝產物的通透性。研究表明，DMSO存在嚴重的毒性作用，與蛋白質疏水集團發生作用，導致蛋白質變性。DMSO用的時候要避免其揮發，要準備1%-5%的氨水備用，皮膚沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗滌。材料：

1、四膜蟲培養液

一種單細胞原生動物，主要產自淡水，一般呈倒卵形或梨形，具有兩個細胞核。可在10倍鏡下輕松地觀察其細胞形態及運動等方面的變化。

2、各種試劑

1mol/LNaOH；1mol/LHCl；1%甲醛；1%TritonX-100；1%SDS；1%次氯酸鈉；1%巰基乙醇；1%DMSO；0.25mol/L蔗糖；0.15mol/LNaCl；蒸餾水。器材：載玻片、蓋玻片、顯微鏡、牙簽二、試劑和器材試劑：

本實驗涉及試劑較多，且大多為無色透明液體。實驗時請注意小離心管表面的標簽，以免搞錯試劑！并請大家用記號筆分別在離心管閉上做好記號！三、實驗操作

（一）觀察正常狀態下的四膜蟲試劑：四膜蟲培養液1、在一干凈載玻片上滴加四膜蟲培養液10μl。不加蓋玻片，在10倍鏡下觀察四膜蟲的形態和運動狀態，然后加上蓋玻片用40倍鏡觀察，注意四膜蟲纖毛和內部的結構運動，特別是伸縮泡的運動節奏，記錄現象。

（二）各種試劑對四膜蟲的影響（以NaOH為例）1、取1mol/LNaOH的小離心管（標記為A1）和3只空白1.5ml離心管，在空白管外側用記號筆標記好A0.1、A0.01和A0.001，并用移液槍在空白管中各加入900μl蒸餾水。2、從A1管中準確吸取100μl液體，加入A0.1管中，吹打混勻。再從A0.1管中準確吸取100μl液體，加入A0.01管中。重復操作，直到最后一管。操作過程中不必更換槍頭！A1A0.1A0.01A0.001100μl100μl100μl

3、取兩片干凈載玻片，左側標記為A1，右側標記為A0.1；另外取兩片干凈載玻片，左側標記為A0.01，右側標記為A0.001。4、用同一槍頭，依次從濃度最低的A0.001開始，分別吸取50μl液體，滴加在載玻片上已標記出的相應位置上，不要涂開！

A1A0.1A0.01A0.0015、用裝有四膜蟲培養液的小塑料瓶從濃度最低的A0.001開始，一次在每一50μl的液滴上滴加一滴四膜蟲培養液（約20~30μl），馬上用牙簽將其混勻，直到濃度最高的樣，不必更換牙簽！6、混合了最后一個樣后，立即開始計時，馬上將樣品在10倍鏡下觀察，先從濃度高的開始，將各濃度依次觀察，記錄現象。每組兩個同學各觀察1張載玻片！A0.01A0.0017、如在觀察濃度最高的樣品時發現反應太快而無法觀察仔細，可做如下處理：另取干凈載玻片，先滴加50μl濃度最高的試劑，在其近旁滴加一滴四膜蟲培養液，注意勿使兩液混合。將載玻片放顯微鏡下，觀察到四膜蟲后用牙簽將兩者混合，立即觀察！50μlA1液體四膜蟲后面的試劑可如NaOH一樣操作，分別標記如下：A1mol/LNaOHB1mol/LHClC0.1%TritonX-100D0.1SDSE1%次氯酸鈉F1%巰基乙醇G1%甲醛H0.25mol/L蔗糖I0.15mol/LNaClJ1%DMSO按表記錄觀察結果四、實驗記錄試劑稀釋度觀察到的變化細胞形態運動情況其他時間NaOH(A)10.10.010.001四、注意事項

1、四膜蟲為淡水性原生生物，可承受一定的低滲壓。實驗時應選擇培養約3天的四膜蟲培養液，一則細胞數目較多，二則細胞比較新鮮。如培養時間過久，大部分細胞處于衰老期，細胞運動不明顯。2、加入去垢劑后四膜蟲細胞發生變化非常快，需立即觀察。非離子型去垢劑和離子型去垢劑對細胞膜作用的效果有所不同，可進行比較。3、四膜蟲的細胞比較大，可在低倍鏡下觀察其生理狀態，但如沒有經過固定染色，應將光線適當調暗，以方便觀察。4、如要準確計時，最好準備秒表。在實驗報告中按自己的觀察結果回答下列問題：1.四膜蟲更耐酸還是堿？酸和堿何者對四膜蟲的破壞大？2.氧化劑和還原劑何者對四膜蟲的影響大？3.SDS與TritonX-100兩種去垢劑何者作用更強？4.高滲溶液在稀釋后對四