生物學系統實驗介紹及實驗安排第1頁，課件共39頁，創作于2023年2月實驗過程的首要問題

——實驗安全首先注意自身的安全問題，學會保護自已。注意避免水、電、化學藥品等造成的傷害。注意儀器使用過程出現的危險和損害。實驗室內部的安全——防火、防水、防盜等。出現問題不要驚慌，冷靜處理，不隱瞞。第2頁，課件共39頁，創作于2023年2月本門實驗課開設的目的進一步利用已具備有的實驗技能，系統綜合解決實驗過程中的問題立足于多動手多訓練，加強自主性加強實踐性教學和創新意識的培養實驗完成后能夠達到一定自主解決實驗過程遇到的問題的能力（包括其它研究中所涉及的問題），可以完成一些研究性實驗工作初步積累一定自主實驗的經驗。第3頁，課件共39頁，創作于2023年2月實驗課所涉及的命題及安排擬以α-淀粉酶細菌菌株的選育為目的；建立研究平臺，在教師指導下讓學生完成相關系統實驗；實驗內容將涉及微生物學的最基本研究方向，包括微生物的培養、發酵、生理學、生物后提取、生物化學分析等；用到的技術主要有微生物純化分離技術、發酵培養技術、電泳技術、酶提取及純化技術及相關生化分析技術；整個實驗時間相對固定，過程中有靈活安排（具體再商定——充分利用晚上）；第4頁，課件共39頁，創作于2023年2月實驗分組情況及組織安排本門實驗課分為若干組，每組2~4人；自行組合，相互密切配合，完成試驗內容，多動手，認真總結并完成實驗報告；實驗過程中的一些物品、試劑、樣品等，因為下次實驗還需要請自行保管好（連續過程）；相關試劑不夠用，請和教師聯系配制；完成實驗后由本班次負責人安排值日生進行相應的衛生打掃和公共物品整理；注意：實驗時間可能遠遠超過72學時。第5頁，課件共39頁，創作于2023年2月實驗考核成績評定平時成績（占20分）實驗習慣（占10分）實驗報告（占30分）考核及考試（占20分）按組答辯（占20分）第6頁，課件共39頁，創作于2023年2月科學研究工作需要解決和注意的一些問題研究目的的確立——區分基礎研究和應用研究；研究內容和方法的建立——很多時候是一種開創性的工作；檢測手段的解決——高效、專一、準確；數據結果的分析——從表觀現象揭示內在的聯系和結果；不要怕出錯或忽視和自已的預見不符的結果——認真分析，創新發現。第7頁，課件共39頁，創作于2023年2月本門實驗課的具體內容1.從土壤中分離產淀粉酶的菌株——分離純化、檢測、篩選培養（初篩和復篩）（3周完成）。2.產酶發酵條件的優化研究（3~4周完成）。3.酶的提取純化及電泳檢測分析（粗提、純化）（分批次4~5周完成）。4.酶生物學特性研究（3~4周完成）5.水解及產物分析實驗（1~2周完成）注意：實驗內容涉及較多，實驗過程中遇到的未定因素較多，經費時間有限，這些可能造成相關實驗內容完成有困難，各組之間最終結果要求不定——注重過程和訓練目的。第8頁，課件共39頁，創作于2023年2月從土壤中分離產淀粉酶的菌株⑴分離步驟和方法——分離用培養基、檢測方法，從土壤中分離得到一株產淀粉酶的菌株（以細菌為主）⑵對已有菌株進行相應產淀粉酶初發酵研究，得到最初產酶發酵水平（包括初篩和復篩兩部分）。第9頁，課件共39頁，創作于2023年2月產酶發酵條件的優化利用產酶的培養基成分及培養條件，利用正交設計優化產酶發酵條件結果將結合相關的分析統計軟件進行統計分析研究，獲得優化條件第10頁，課件共39頁，創作于2023年2月酶的提取及電泳檢測分析⑴在產酶高峰期，收集發酵液，制備粗酶液⑵利用相應的蛋白質提取技術，沉淀酶蛋白，得到粗酶粉⑶利用柱層析系統，分離提純酶蛋白⑷各步驟利用蛋白電泳技術檢測酶蛋白的純度，及酶蛋白的分子量。第11頁，課件共39頁，創作于2023年2月酶生物學特性研究利用已純化的酶蛋白，并進行相應的酶學特性研究最適pH值的測定最適溫度的測定熱穩定性的測定相關金屬離子等物質的影響測定Km及Vmax的測定第12頁，課件共39頁，創作于2023年2月水解及產物分析實驗⑴利用自己分離純化的酶制品，水解淀粉得到葡萄糖（水解材料可以自選），并測定其轉化率⑵通過薄板層析等手段進行一定酶產物分析研究，并介紹有關儀器分析方面的知識⑶介紹相關的生物分析知識第13頁，課件共39頁，創作于2023年2月相關參考書目1.沈萍范秀容李廣武主編微生物學實驗高等教育出版社2.林稚蘭黃秀梨主編現代微生物學與實驗技術科學出版社3.宋大新范長勝徐德強等主編微生物學實驗技術教程復旦大學出版社4.東秀珠，蔡妙英主編常見細菌系統分類和鑒定方法科學出版社5.焦瑞身周德慶主編微生物生理代謝實驗技術科學出版社6.賈盤興蔡金科等編著微生物遺傳學實驗技術科學出版社7.諸葛健王正祥編著工業微生物實驗技術手冊中國輕工業出版社8.汪家政范明主編蛋白質技術手冊科學出版社9.蘇拔賢主編生物化學制備技術科學出版社10.顏子穎王海林譯F·奧斯伯R·布倫特R·E·金斯頓等著精編分子生物學實驗指南11.徐繼初主編生物統計及試驗設計農業出版社12.李春喜王志和王文林編著生物統計學（第二版）科學出版社513.黃海羅友豐陳志英等編著SPSS10.0forWindows統計分析人民郵電出版社14.微生物學報微生物學通報食品與發酵等相關期刊雜志第14頁，課件共39頁，創作于2023年2月實驗α-淀粉酶活力測定方法介紹第15頁，課件共39頁，創作于2023年2月酶活力單位測定的介紹測定的目的——純化不容易；純化過程中容易失活——質量（重量）不能用于定量；酶活力和酶活性的差別酶活力反應的實質——催化反應速度高低酶活力單位的定義及表示——增加可比性國際標準（25℃、1min、1umol）實際應用的標準酶活力的測定方法單位時間內底物的減少量或產物的增加量反應完一定量底物的時間長短測定物的要求：可測性、反應的專一性、穩定性、簡便性比酶活力的定義——1mg酶蛋白的酶活力（有時用1g表示）測定過程中的條件控制——溫度、pH等第16頁，課件共39頁，創作于2023年2月酶活力測定的方法碘比色法（有相應的國家標準）在一定反應條件下，1小時轉化1g淀粉變為糊精的酶量定義為1個酶活力單位3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）在一定反應條件下，1分鐘反應生成1mg麥芽糖的酶量定義為1個酶活力單位注意：去除β-淀粉酶的干擾醫學上的一些測定方法（專用試劑盒，通過生化儀器反應測定，需要微量快速）第17頁，課件共39頁，創作于2023年2月對微生物酶發酵研究中的一些問題進行討論標準曲線制作的問題（配制所需測定物質的梯度濃度）酶的誘導問題（微生物長期適應進化的結果）酶發酵中氮源問題（蛋白質合成的一些問題）酶的合成中能量問題（需要消耗大量的能量）搖瓶發酵中的容量問題（三角瓶，250、500ml）發酵中的溶解氧問題緩沖液的配制問題在α-淀粉酶發酵培養基中CaCl2的使用問題在搖瓶發酵中非可溶性物質的加入問題化學分析中基準物的處理（純度、結晶水的處理——不穩定）第18頁，課件共39頁，創作于2023年2月相關概念的介紹復壯——狹義的復壯僅是一種消極的措施，指的是在菌種已發生衰退的情況下，通過純種分離和測定典型性狀、生長性能等指標，從已衰退的群體中篩選出少數尚在未退化的個體，以達到恢復原菌株固有性狀的相應措施；而廣義的復壯則應是一項積極的措施，即在菌種的典型特征或生產性狀尚未衰退前，就經常有意識地采取純種分離和生產性狀的測定工作，以期從中選擇到自發的正變個體。第19頁，課件共39頁，創作于2023年2月相關概念的介紹菌種活化——使保藏的菌種（休眠狀態）恢復到最佳生長狀態（包括一些菌種性能的恢復），生長狀態的均一化（相對）。一般包括：斜面活化（平板劃線形成單菌落）；液體搖瓶培養；種子培養（針對大規模工業生產）第20頁，課件共39頁，創作于2023年2月相關概念的介紹種子培養基：營養成分相對豐富，一般無限制性因子，有利于菌體的增殖，生長好；發酵培養基：營養成分有利于積累所需代謝產物，一般在培養基有一些限制性因子（包括培養條件）。注意：種子培養基接種于發酵培養基時，注意微生物生長延滯期（有一定營養成分重疊）。第21頁，課件共39頁，創作于2023年2月實驗室搖瓶機（搖床）的作用使培養基一直保持均勻狀態——菌體始終接觸到新的營養成分（相對來說）；快速稀釋代謝廢物（一般對細胞有毒害作用，對人類來說可能有用）增加培養基中溶解氧的濃度，提高菌種的有氧代謝強度，加快物質的轉化，有利于代謝產物的合成和積累。第22頁，課件共39頁，創作于2023年2月搖瓶機的種類旋轉式——轉速相應較高（200轉以上），培養液貼壁旋轉；往復式——轉速不易太高，一般120轉/分左右，培養液來回振蕩，振蕩液面較高；往復式的溶氧效果較好（相對旋轉式）；注意搖瓶機的振幅（偏心距）。第23頁，課件共39頁，創作于2023年2月搖瓶發酵試驗時三角瓶裝量的要求一般要求裝液量為三角瓶標注容量的1/10~1/5如500ml三角瓶經常加入50~100ml（常裝50ml或100ml）；如250ml三角瓶經常加入25~50ml（常裝50ml）；注意：根據需要可以特制（如加擋板，增加溶解氧）。第24頁，課件共39頁，創作于2023年2月培養過程溫度的保持空氣浴——通過加熱空氣來保持培養空間的溫度，相對簡單，實驗室設計空間可大可小，精度低（±0.5~1℃），傳熱慢；水浴恒溫——通過加熱水恒溫器皿內的溶液，一般設計空間較小（實驗室科研用的較多），精度高（±0.1℃），傳熱快。第25頁，課件共39頁，創作于2023年2月緩沖溶液（Buffersolution）能夠緩沖由于加酸或加堿而使溶液H+濃度（pH值）改變的溶液（也是其主要作用）；另一個作用是可以在溶液濃縮或稀釋時而不改變溶液的pH值（或影響很小，10倍以內）第26頁，課件共39頁，創作于2023年2月用于生物學實驗的緩沖劑的要求不能透過生物膜；生物學穩定性以及不干擾新陳代謝和生物學過程；對紫外線和可見光無明顯吸收；離子成分或鹽濃度對實驗的影響極小；溫度對其pH值的影響極小。第27頁，課件共39頁，創作于2023年2月配制系列濃度稀釋液的方法線性稀釋——稀釋液的濃度梯度是相同的（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0……）；對數稀釋（倍數稀釋）——系列溶液的濃度比是一常數，取決于稀釋梯度——2倍稀釋（1、1/2、1/4、1/8……）；10倍稀釋（1、1/10、1/100、1/1000……）；調和濃度稀釋——系列溶液的濃度為連續排列整數的倒數（1，1/2，1/3，1/4，1/5……）。第28頁，課件共39頁，創作于2023年2月緩沖液的配制方法單獨配制相關藥品的溶液，根據所需配制緩沖溶液的pH值、體積，量取一定體積混合而成；根據所需配制緩沖溶液的pH值、體積，計算藥品的用量，稱取后溶解定容；以一種所需藥品為主體（一定濃度），用pH計檢測滴加相應酸或堿調節至所需pH值后，再定容。第29頁，課件共39頁，創作于2023年2月菌種斜面菌種活化（18~24hr）液體搖瓶活化（18~24hr）接種搖瓶發酵培養（2%，48~72hr）第30頁，課件共39頁，創作于2023年2月液體菌種活化培養基（種子培養基）可以利用微生物實驗書的淀粉培養基，注意調節pH值；也可以利用發酵培養基（豆粕粉需要煮水后使用）；第31頁，課件共39頁，創作于2023年2月發酵培養基可溶性淀粉8g；豆粕粉4g；Na2HPO4.12H2O0.8g；（NH4）2SO4

0.4g；CaCl20.2gNH4Cl0.15g；水100ml121.3℃滅菌20分鐘如果還想使用自已組的設計培養基，可以以上述培養基作為對照（不一定所有菌株都做，選擇好的）第32頁，課件共39頁，創作于2023年2月培養接種需發酵測定的菌種活化培養液，1mL/瓶（接種量2-5%，實驗前后統一）。37℃，搖瓶振蕩培養2-3天。第33頁，課件共39頁，創作于2023年2月α-淀粉酶酶活力測定的原理底物（反應物）為淀粉產物為麥芽糖、糊精等第34頁，課件共39頁，創作于2023年2月酶活力測定（碘比色法——目視）酶活力定義：在60℃下1小時內將1克淀粉轉化為糊精的酶量稱一個酶活力單位（5~10分鐘反應完成）。淀粉及糊精檢測原理：碘檢測淀粉（紫藍色，30分子以上）→紅色糊精（紅棕色，7-30分子）→無色糊精，7分子以下）→麥芽糖（不顯色）→葡萄糖（不顯色）計算公式：

第35頁，課件共39頁，創作于2023年2月酶活力測定步驟發酵液（酶液）2%淀粉液20mL+5mLpH6.0緩沖液預熱5min（60℃）預熱5min（60℃）吸取0.5mL混勻、計時（保溫60℃），反應開始在白瓷板上定時取樣（1滴）比色比色終點，計下反應時間（與標準比色管顏色相同）代入公式計算酶活力單位1mL標準糊精液＋3mL標準稀碘液混勻標準比色管（紅棕色）對照比色確定反應終點第36頁，課件共39頁，創作于2023年2月酶活力測定（DNS比色法）酶活力定義：在一定反應