生物信息的傳遞上轉錄第1頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第2頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第3頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第5頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA充當信使的證據(jù)第6頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月DNA與RNA的比較第7頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第8頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月生物體內有三種RNAmRNA（messageRNA）：編碼特定蛋白序列；tRNA（transferRNA）：特異性地解讀mRNA中的遺傳信息，將其轉化為相應的氨基酸；rRNA(ribosomalRNA）：直接參與核糖體中蛋白質的合成。第9頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月●基本概念●轉錄起始：RNA聚合酶、啟動子●轉錄的基本過程●轉錄后加工●原核生物與真核生物mRNA的特征比較●RNA合成與DNA合成異同點Contents思考題？第10頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基本概念與基本特征

基因轉錄是在細胞核內進行的。它是指以DNA的一條鏈為模板，按照堿基互補配對原則，合成RNA的過程。轉錄RNADNA

轉錄(transcription)

：第11頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月參與轉錄的物質原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶轉錄的場所：細胞核（真核生物）轉錄的條件：需要酶和ATP(解旋酶和RNA聚合酶），以及其他蛋白質因子轉錄的結果：mRNARNA合成方向：5'3'第12頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月轉錄的不對稱性：

在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉錄的模板，稱為轉錄的不對稱性。編碼鏈與模板鏈與mRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈，即有義鏈(sensestrand)；將另一條根據(jù)堿基互補原則指導mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈，即反義鏈(antisensestrand)。第13頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月模板鏈并非永遠在同一條單鏈上轉錄方向5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈轉錄方向DNA分子上轉錄出RNA的區(qū)段，稱為結構基因。結構基因：第16頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月轉錄單元（transcriptionunit）一段從啟動子開始至終止子結束的DNA序列。第18頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）RNA聚合酶（二）啟動子(promoter)二、參與轉錄起始的關鍵酶與元件第19頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）RNA聚合酶●原核生物RNA聚合酶（大腸桿菌為例）全酶(holoenzyme)=核心酶(coreenzyme)+σ因子第20頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月σ亞基：識別啟動子，起始轉錄。σ亞基和其他肽鏈的結合不很牢固，易脫離全酶。核心酶：全酶脫離σ亞基剩下的β‘βα2ω稱為核心酶。核心酶本身就能催化核苷酸間磷酸二酯鍵的形成。β亞基：是酶和底物結合的部位和催化位點。利福平(rifampicin)和利福霉素(rifamycin)通過結合β亞基，對全酶有強烈的抑制作用，抑制RNA合成的起始，但不抑制其延長。β亞基基因rpoB突變可使細菌對利福平有抗性。鏈霉溶菌素(streptolydigin)能抑制RNA鏈的延長，rpoB突變卻可使細胞對鏈霉溶菌素亦發(fā)生抗性。第22頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月β’亞基：其作用是與模板DNA相結合。β’亞基的堿性較強，適于與模板DNA相結合。肝素是一種多價陰子，能和β’亞基結合，從而抑制DNA與RNA聚合酶相結合，進一步抑制轉錄作用。α亞基：功能現(xiàn)尚未知。然而，當噬菌體T4感染E.coli時，其α亞基即在精氨酸上被ADP-核糖化。這種修飾作用使該RNA聚合酶全酶對其原先識別的啟動子的親和力減弱。所以有人認為，α亞基的功能可能是識別其相應的啟動子。第23頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對分子量亞基數(shù)組分功能αrpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動子識別βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多種σ因子，用于識別不同的啟動子第24頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月原核生物RNA聚合酶的作用識別啟動子。主要依賴于亞基，亞基只參與轉錄的起始，并決定轉錄的方向。與DNA結合并使之解鏈，另外還具有解旋、重新使DNA螺旋化作用。催化RNA聚合反應。負責三種RNA合成。RNA聚合酶核心酶通過與不同的亞基結合，識別不同的啟動子。第25頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月2.真核生物RNA聚合酶細菌只有一種RNA聚合酶，它完成細胞中所有RNA的合成。真核細胞的轉錄機構更加復雜。真核細胞核內產生三種RNA聚合酶，位于不同的部位，且均有復雜的亞基結構。每種酶負責不同種類基因的轉錄。它們的一般性質見下表。第26頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月酶位置轉錄產物相對活性對α-鵝膏蕈堿的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶Ⅱ核質hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶Ⅲ核質tRNA約10%存在物種特異性真核細胞的三種RNA聚合酶特征比較第27頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

RNA聚合酶Ⅰ的活性最顯著。位于核仁中，負責轉錄rRNA基因(rDNA)，細胞內絕大部分是rRNA。其活性不被α-鵝膏蕈堿所抑制。

RNA聚合酶Ⅱ位于核漿中，負責hnRNA的合成。hnRNA是mRNA的前體。其活性可被低濃度的α-鵝膏蕈堿所迅速抑制，

RNA聚合酶Ⅲ負責合成tRNA和許多小的核內RNAs。聚合酶Ⅲ對α-鵝膏蕈堿的反應則不盡相同：在動物細胞中聚合酶Ⅲ可被高濃度α-鵝膏蕈堿所抑制，而在酵母和昆蟲細胞中則不會被抑制。第29頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶DNA聚合酶引物無有產物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時進行外切酶活性無5’3’，3’5’校對合成能力無有修復能力無有第30頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月某些常用的轉錄抑制劑

抑制劑靶酶抑制作用利福霉素細菌的全酶與β亞基結合，阻止起始鏈霉溶菌素細菌的核心酶與β亞基結合，阻止延長放線菌素D真核RNA聚合酶Ⅰ與DNA結合，阻止延長α-鵝膏蕈堿真核RNA聚合酶Ⅱ與RNA聚合酶Ⅱ結合第31頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）啟動子(promoter)啟動子：指能被RNA聚合酶識別、結合并啟動基因轉錄的一段DNA序列。第32頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月原核生物啟動子特性在基因表達調控中，轉錄起始是關鍵，基因是否能表達決定于在特定的啟動子起始過程。只有RNA聚合酶能夠特異性地與啟動子相結合。σ亞基起識別作用，沒有σ時，核心酶偶而亦能起始RNA的合成，但有許多起始錯誤，而且核心酶所合成的RNA鏈的起始在某個基因的兩條鏈上是隨機的。但當σ存在時，則起始在正確的位點上。第33頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

RNA聚合酶能否與啟動子相互作用是起始轉錄的關鍵問題。不同啟動子對RNA聚合酶的親和力各不同。可能對調控轉錄起始的頻率，即對基因表達的程度有重要不同。第34頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

一類是RNA聚合酶可以直接識別的啟動子。這類啟動子應當總是能被轉錄。但實際上也不都如此，外來蛋白質可對其有影響，即該蛋白質可直接阻斷啟動子，也可間接作用于鄰近的DNA結構，使聚合酶不能和啟動子結合。另一類啟動子在和聚合酶結合時需要有蛋白質輔助因子的存在。這種蛋白質因子能夠識別與該啟動子順序相鄰或甚至重疊的DNA順序。1）兩類不同的啟動子

第35頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動子處結合呢?RNA聚合酶分子上可能有一個活性中心能夠識別出DNA雙螺旋上某特異序列的化學結構；啟動子處的核苷酸順序具有特異的形狀以便與RNA聚合酶結合，就好像酶與其底物的結構相恰恰適合一樣。2）啟動子的共同順序第36頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

利用“足跡法”和測序技術，對100多種啟動子的順序進行了比較，發(fā)現(xiàn)在RNA合成開始位點的上游大約10bp和35bp處有兩個共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個序列的特征如下：

-35區(qū)：T85T83G81A61C69A52（-35序列,TTGACA區(qū)）

-10區(qū)：T89A89T50A65A65T100（-10序列,TATA區(qū)）大多數(shù)啟動子均有共同順序(consensussequence)，只有少數(shù)幾個核苷酸的差別。共同順序是啟動子的關鍵部位。啟動子的共同順序第37頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月啟動子的共同順序第38頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

TATA區(qū)：(又稱為-10序列或Pribnow盒)酶的緊密結合位點（富含AT堿基，利于雙鏈打開）-10序列的突變不影響RNA聚合酶與啟動子結合的速度，但會降低雙鏈解開的速度。

TATA盒決定著轉錄的方向。第39頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月-35序列是RNA聚合酶全酶的識別位點，對全酶有很高的親和性。如果-35序列發(fā)生突變或缺失，將大大降低對全酶的親和性，即降低RNA聚合酶與啟動子的結合速度，但不影響轉錄起始位點附近DNA雙鏈的解開。TTGACA區(qū)（又稱-35序列）

提供了RNA聚合酶全酶識別的信號

第40頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月編碼鏈AACTGTATATTA模板鏈TTGACATATAAT3’5’DNA轉錄起始點Pribnow盒子啟動子35

10

+1轉錄區(qū)5’3’RNA轉錄起點與新生RNA鏈第一個核甘酸相對應DNA鏈上的堿基。第41頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū)T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A50T96第42頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月典型啟動子的結構

-35-10轉錄起點TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp第43頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

原核生物亦有少數(shù)啟動子缺乏這兩個序列（-35和-10)之一。在這種情況下，RNA聚合酶往往不能單獨識別這種啟動子，而需要有輔助蛋白質的幫助。第44頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月E.coliRNA聚合酶與啟動子結合的過程可分為兩步：①酶識別啟動子，并與其結合形成“關閉”復合體(即雙螺旋形式)。這一步所識別的是-35序列。②“關閉”復合體轉變?yōu)椤伴_放”復合體(即雙螺旋解旋，兩條鏈分開)，此時酶的結合比較緊密。在這個轉變中，富含AT堿基對的-10區(qū)約有17bp被解旋，暴露出模板鏈。-10區(qū)的突變可阻礙"開放"復合體的形成。許多突變改變了-10序列中的堿基，但并未減低其AT對的水平，卻仍然能阻礙其"融化"為開放復合體，可見-10區(qū)除了要易于融化之外，還必須有特異的形狀，以便RNA聚合酶能夠識別它。

RNA聚合酶與啟動子的結合第45頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA聚合酶與啟動子的結合模式圖第46頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月●真核生物啟動子真核有三種不同的啟動子和有關的元件啟動子Ⅱ最為復雜，它和原核的啟動子有很多不同第47頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

又稱rRNA基因啟動子或Ⅰ型啟動子。不同真核生物Ⅰ型啟動子序列有較大的差異，缺乏保守性。目前發(fā)現(xiàn)有兩個區(qū)域是轉錄必需的：

-40~+5近啟動子部分：為核心序列，其功能是決定轉錄起始的精確位置。這一段序列的全部或部分缺失，被同樣長度的寡聚核苷酸替代，在選擇性位點作單個堿基突變等變化，都會消除或強烈降低rDNA轉錄能力。

-165~-40遠啟動子部分：又稱上游控制元件(UCE)，其功能是影響轉錄的頻率。這段序列受到缺失、置換、插入等破壞，可造成轉錄下降100倍。1）RNA聚合酶Ⅰ啟動子第48頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

又稱蛋白質基因啟動子或Ⅱ型啟動子。該啟動子有四個區(qū)域對轉錄起始和活性起著調控作用，是真核基因轉錄不可缺少的。①轉錄起始位點：其堿基大多為A，兩側各有若干個嘧啶核苷酸：YAYTCYYY。該序列對啟動子的強度和確定起始位點方面都是必要的。②TATA盒：位于-25~-30bp左右，是核心序列，又稱Hognessbox。其共有序列：

T85A97T93A85(A63/T37)A83(A50/T37)

基本上由AT組成，極少數(shù)啟動子中有GCbp。2）RNA聚合酶Ⅱ啟動子第49頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月TATA盒的作用在于決定轉錄的起點，序列的改變會是轉錄位點偏移；缺失TATA盒，轉錄將在許多位點上開始。TATA盒決定轉錄的效率：如雞蛋清蛋白基因啟動子的TATA變?yōu)門AGA后，轉錄效率大大下降；兔珠蛋白中TATA盒是ATAAAA，人工突變?yōu)锳TGTAA后，轉錄效率下降80%；人的-珠蛋白基因的ATAAAA序列變?yōu)锳TGAAA、ATACAA或ATAGAA，-珠蛋白的產量大大降低，引起地中海貧血癥。少數(shù)蛋白質基因缺乏TATA盒，如腺病毒DNA結合蛋白（27KD）基因的上游沒有TATA盒。第50頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月③上游調控區(qū)（UPE）：真核Ⅱ型啟動子上游具有多種調控元件：

CAAT盒：轉錄起始位點上游70-80bp處的CAAT順序。這一順序具有較保守的共同順序：GGC/TCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以識別一順序。用人工方法誘導兔β珠蛋白基因CAAT順序發(fā)生突變，兔β珠蛋白基因的轉錄水平降低。

GC盒：位于CAAT盒鄰近，共同順序：GGGCGG。此外，在不同的啟動子上還有其它類型的UPE，他們是轉錄調控因子結合的位點，影響著轉錄活化和頻率。第51頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月④遠端調控區(qū)：在真核生物中，有些基因的啟動子遠上游區(qū)域（-100bp以上）可大大增強啟動子的活性，這種序列稱為增強子。增強子有兩個特征：與啟動子的相對位置不固定，而能有很大的變動；b.能在兩個方向產生作用。一個增強子并不限于促進某一特殊啟動子的轉錄，它能刺激在它附近的任一啟動子。首先被發(fā)現(xiàn)的增強子是SV40增強子。第52頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

SV40增強子由兩個72bp重復串連而成，約在轉錄起始點上游200bp處，即－107~－178和－179~－250序列。缺失實驗顯示兩個重復缺失一個并不產生什么影響，如兩個均缺失即將大大降低活體內的轉錄。有人發(fā)現(xiàn)，如果將β珠蛋白基因放在含有72bp重復的DNA分子中，它的轉錄作用在活體內將增高約200倍以上，甚至當此72bp順序位于離轉錄起點上游1400bp或下游3000bp時仍有作用。各個基因中的增強子順序差別較大，但有一個基本的核心順序(coresequence)：AAAGGTGTGGGTTTGG第53頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第54頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

RNA聚合酶Ⅲ能識別各種各樣不同的啟動子順序，當然，還是要依靠一些輔助因子。例如，RNA聚合酶Ⅲ在轉錄爪蟾的5SRNA基因時，需要一個轉錄因子，37KD的蛋白質TFⅢA的協(xié)助。TFⅢA結合在+45到+96的部位。它有雙重作用(另外一個作用是在卵母細胞中與5SRNA相結合)。另外還需要兩個因子(TFⅢB和TFⅢC)，但這兩個因子對所有第Ⅲ類基因的轉錄都需要的。而TFⅢA則是對5S基因專一的。3）RNA聚合酶Ⅲ啟動子第55頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

在枯草桿菌(Bacillussubtilis)中首次發(fā)現(xiàn)不同啟動子需要不同σ因子。細胞中存在主要的σ因子，識別主要啟動子。此外，還有另外一些σ因子，能夠識別另一些啟動子，并促使核心酶起始轉錄。這些變異的σ因子在細胞中有特別功能，通常能劇烈改變細胞RNA的合成方式，以便在需要時使一組全新的基因得以表達。噬菌體往往有其自己的σ因子，借以在噬菌體發(fā)育的某一特殊階段開動其所需要的某些噬菌體基因的轉錄。不同啟動子需要不同σ因子第56頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

E.coli細胞中正常的σ因子稱為σ70(表示其分子量為70KD)。

E.coli中有17個熱休克基因，其基因表達依賴于基因htpR，受熱休克反應所誘導。hrpR的產物是一個很不穩(wěn)定的32KD蛋白質，它就是一種變異的σ因子，稱為σ32。σ32能引導核心酶在熱休克基因的啟動子處起始轉錄。

σ70和σ32識別的啟動子的順序是不同的。特別是其-10順序幾乎完全不同。第57頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

E.coli另一種σ因子是在氮饑餓時起作用的，稱為σ60。正常時E.coli細胞中僅有少量σ60，但當介質中氨缺乏時，σ60大量增多，以開啟某些可利用其他氮源的基因。這就是說，σ60能引導核心酶識別啟動子的另一種共同順序。

σ60所識別的-35順序實際上位于-20處，因為-10和-35順序之間的間距特別短，只有6bp。第58頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月E.coli的不同σ因子識別不同的共同順序因子基因功用-35順序間隔距離-10順序σ70rpoD正常狀態(tài)TTGACA10-18bpTATAATσ32rpoH熱休克CNCTTGAA13-15bpCCCCATNTσ60rpoN氮的利用CTGGNA6bpTTCGA第59頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

枯草桿菌正常σ因子(相當于σ70)稱σ43，它能識別σ70所識別的共同順序。從一組基因表達變換為另一組基因表達往往需要更換σ因子。

B.subtilis在芽孢形成中產生新的σ因子：在芽孢形成期開始時σ43即被σ37所取代。芽孢形成開始時，在σ37的指導下，RNA聚合酶即能轉錄第一組芽孢形成基因。σ37分子較σ43略小。它在營養(yǎng)型細胞中即已存在，但為量很少，而且也不和核心酶結合形成全酶。在芽孢形成開始后4h，σ29開始出現(xiàn)。它指導另一組新基因的轉錄。σ29不存在于營養(yǎng)型細胞中，故可能是芽孢形成基因在σ37轉錄下的表達產物。第60頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

目前尚不了解這種替代如何調控的，現(xiàn)在認為機制可能很復雜，牽涉到其他好幾種蛋白質。這種替代并不完全，而且被替代下的σ43也未完全被滅活。大約還有10%的核心酶仍和σ43相結合，可能還有某些營養(yǎng)型酶在芽孢形成時仍存在于細胞中。在營養(yǎng)型細胞中存在一種σ32。它在芽孢形成早期出現(xiàn)活性，指導某些啟動子起始轉錄。其含量極少，不到1%。第61頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

在營養(yǎng)型細胞中還有一種σ28，它的量不多，僅代表RNA聚合酶總活性的一小部分，而在芽孢形成開始時即告失活。然而奇怪的是，在某些不能形成芽孢的突變株中，是找不到它的活性的。所以有人認為，σ28是表示營養(yǎng)已用竭，應當開始芽孢形成反應的信號系統(tǒng)的一個部分。第62頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月真核生物啟動子的結構核心啟動子（corepromoter）上游啟動子元件（upstreampromoterelement，UPE）第63頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月1、核心啟動子●定義：指保證RNA聚合酶Ⅱ轉錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉錄起始位點及轉錄起始位點上游TATA區(qū)●作用：選擇正確的轉錄起始位點，保證精確起始TATA

常在-25bp左右，相當于原核的-10序列T85A97T93A85A63A83A50第64頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第65頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月2、上游啟動子元件●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等●作用：控制轉錄起始頻率。CAAT：-70--80bpGGGCGG：-80--110bp第66頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月①啟動子的效率

各啟動子的效率是不一樣的，效率好的啟動子可以使RNA轉錄重復的更快一些。即啟動子開始與酶結合和開放型復合物的形成速度，在各啟動子之間不一樣。有的啟動子需要10min以上才啟動一次，有的僅1~2s內啟動一次。啟動子的啟動速率是基本的限速步驟，在這一步驟的基礎上，基因表達的速度就確定了。即使是同一基因，其轉錄效率也是不固定。在不同的生長情況下轉錄可根據(jù)需要而改變。啟動子的效率及影響因素第67頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

E.coli轉錄調節(jié)常常是通過調節(jié)蛋白的介導。調節(jié)蛋白與啟動子或啟動子附近的序列相結合，從而增高或降低RNA聚合酶起始的效率。調節(jié)蛋白有：阻遏蛋白(repressor)：能阻斷RNA聚合酶的結合，從而抵制轉錄；激活蛋白(activator)：能與RNA聚合酶結合并提高其活性。②調節(jié)蛋白對啟動子的影響第68頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

凡需要激活蛋白才能充分發(fā)揮作用的啟動子常常與-35順序很不相似，這提示激活蛋白可以取代這個結合位點。作為一種啟動子的阻遏蛋白可能是另一種啟動子的激活蛋白，反之亦然，這取決于其結合位點的準確位置。一種調節(jié)蛋白的名稱常常只是反映了它第一次被發(fā)現(xiàn)時的功能。②調節(jié)蛋白對啟動子的影響第69頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第70頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月影響啟動子功能的調節(jié)蛋白蛋白質對啟動子的影響在細胞中的功能乳糖阻遏蛋白阻遏作用阻止代謝乳糖的酶的合成(當乳糖不存在時)半乳糖阻遏蛋白阻遏作用阻止代謝半乳糖的酶的合成(當半乳糖不存在時)LexA阻遏蛋白阻遏作用阻止DNA修復酶的合成(當細胞DNA未受到損傷時)λ阻遏蛋白阻遏作用(啟動子PL和PR)阻止λ生命周期中裂解期需酶的合成λ阻遏蛋白激活作用(啟動子PRM)通過激活自身啟動子而增加其本身的合成第71頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月影響啟動子功能的調節(jié)蛋白蛋白質對啟動子的影響在細胞中的功能CAP蛋白激活作用當葡萄糖不存在時，增加代謝其他糖類的酶的合成CAP蛋白阻遏作用調節(jié)本身的基因，并阻止在葡萄不存在時所不需要的蛋白質的合成AraC蛋白激活作用當阿拉伯糖存在時，增加利用阿拉伯糖所需要的蛋白質的合成AraC蛋白阻遏作用阻止代謝阿拉伯糖的酶的合成(當阿拉伯糖不存在時)λcⅡ蛋白激活作用增加建立溶源狀態(tài)所需的噬菌體蛋白質的合成第72頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

RNA聚合酶首先要在啟動子處使DNA解旋才能起始轉錄。因此，DNA模板的超螺旋張力對啟動子效率有影響，凡有利或不利于解旋的情況就會增高或降低起始的頻率。

DNA旋轉酶(gyrase)能使細菌的DNA保持超螺旋狀態(tài)，故有利于解旋。DNA旋轉酶抑制劑萘啶酮酸可以抑制許多基因的表達。拓撲異構酶Ⅰ能阻止負超螺旋。編碼拓撲異構酶Ⅰ的基因發(fā)生突變時可增強某些基因的表達。③模板的超螺旋張力對啟動子效率的影響第73頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

但是，增加負超螺旋不一定就會增強啟動子的功能，對某些啟動子可能正好相反。這可能在于負超螺旋改變了啟動子的微細構象，抑制了RNA聚合酶的功能。詳細的機制還不明了，旋轉酶基因的啟動子本身據(jù)信就有這樣的特性。這是有利于調節(jié)負超螺旋程度的：當細胞DNA的負超螺旋達到足夠的程度時，DNA旋轉酶的合成就會自動放慢。第74頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

此外，某些啟動子對超螺旋張力很敏感，而另一些則不很敏感。可能性之一是每個啟動子對超螺旋的依賴程度不同，這取決于其不同的順序。某些啟動子的順序易于融化(故較不依賴于超螺旋)，而另一些的順序較難融化。另一種說法是細菌染色體的不同區(qū)域本來就有不同程度負超螺旋，因此，啟動子處于染色體的什么區(qū)域就是一種重要因素。第75頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

原核生物RNA聚合酶具有很大的全能性，幾乎不依賴任何其他蛋白質。但是，真核生物RNA聚合酶不具有全能性，需要依賴于一系列蛋白因子才能識別和結合到啟動子特定序列上，并啟動轉錄。真核生物基因轉錄必需的蛋白因子統(tǒng)稱為轉錄因子。目前已經分離純化或鑒定的轉錄因子有數(shù)百種，分為兩類：a.普遍性轉錄因子：結合與啟動子及鄰近的序列。b.轉錄調控因子：結合與上游調控區(qū)和增強子區(qū)。④轉錄因子對啟動子的影響第76頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

上游序列在某些時候可作為一些激活劑的結合部位，直接激活RNA聚合酶；上游序列和拓撲異構酶結合，誘導DNA形成有利的超螺旋狀態(tài)，有利RNA合成；上游序列促使RNA聚合酶能更好地接近啟動子區(qū)段，或使DNA與蛋白質結合固定在細胞結構上；上游序列可影響-10和-35區(qū)的DNA結構。⑤上游DNA序列可增強啟動子的活性第77頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

RNA合成的一般特點（1）所用原料為NTP；在DNA合成時為dNTP。（2）合成RNA時，只有一條DNA鏈被用作模板；DNA合成時，兩條鏈分別用作模板。（3）RNA鏈的合成不需要引物；DNA合成一定要引物的引導。（4）RNA鏈的合成的方向與DNA合成一樣，也是從5’向3’端，但由RNA聚合酶催化。（5）轉錄后形成一個RNA分子的一段DNA序列稱為一個轉錄單位；一個轉錄單位可能剛好是一個基因（單順反子），也可能含有多個基因（多順反子）第78頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月真核生物與原核生物RNA轉錄的不同點（1）真核生物RNA的轉錄是在細胞核內進行，而蛋白質的合成則是在細胞質內。（2）原核生物的一個mRNA分子通常含有多個基因；而少數(shù)較低等真核生物外，真核生物一個mRNA分子一般只編碼一個基因。（3）原核生物只有一種RNA聚合酶催化所有RNA的合成；真核生物中則有RNA聚合酶I、II、III，分別催化不同種類型RNA的合成。（4）原核生物RNA聚合酶直接起始轉錄合成RNA；真核生物三種RNA聚合酶都必須在蛋白質轉錄因子的協(xié)助下才能進行RNA的轉錄。第79頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月模板識別（templaterecognition）

RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結合的過程。轉錄起始（initiation）RNA聚合酶結合啟動子，DNA解旋解鏈，形成轉錄泡，RNA鏈上第一個核苷酸鍵的產生。轉錄延伸（elongation）

RNA聚合酶釋放σ因子，核心酶沿著模板DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程。轉錄終止（termination）RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，DNA-RNA雜合物分離，轉錄泡瓦解，DNA恢復成雙鏈狀態(tài)，RNA聚合酶從模板上釋放出來的過程轉錄的基本過程第80頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

模板鏈(templatestrand)信息鏈模板鏈信息鏈(sensestrand)轉錄模板

不對稱轉錄(asymmetrictranscription)：轉錄時，雙鏈DNA中只有一條鏈作為轉錄的模板,這種轉錄方式稱作不對稱轉錄。模板鏈并非永遠在同一單鏈上。

結構基因（structuralgene）能轉錄出RNA并合成蛋白質的DNA區(qū)段第81頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

轉錄起始復合物●原核生物轉錄起始復合物第82頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

轉錄因子轉錄復合體TBPTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApolⅡ的轉錄起始●真核生物轉錄起始復合物第83頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月原核生物的轉錄過程1、起始位點的識別：RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之相結合的過程。因子能識別啟動子，并識別有義鏈，它與核心酶結合，引導核心酶定位到啟動子部位。

第84頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月2、轉錄起始RNA鏈上第一個核甘酸鍵的產生標志著轉錄起始當聚合酶結合到啟動子上后，在啟動子附近將DNA局部解鏈，約解開17個堿基對。（酶與啟動子結合的部位是AT富集區(qū)，有利于解鏈）第一個核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)結合到全酶上，形成“啟動子-全酶-核苷三磷酸”三元起始復合物。第二個核苷酸參入，連結到第一個核苷酸的3'羥基上，形成了第一個磷酸二酯鍵。

因子從全酶上掉下，又去結合其它的核心酶。第85頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

轉錄起始包括：（1）RNA聚合酶結合在轉錄模板的起始區(qū)域；（2）DNA雙鏈解開，以一條鏈為模板，合成第一個磷酸二酯鍵。

第86頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第87頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月2、RNA鏈的延伸●

亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿著DNA模板前移，方向為DNA模板鏈的3′→5′，同時將核苷酸逐個加到生長的RNA鏈的3'-OH端，使RNA鏈以5′→3′方向延伸。●在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。第88頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月轉錄延伸轉錄泡（transcriptionbubble）：在轉錄延長過程中，由局部打開的DNA雙鏈、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者結合在一起的復合體，為空泡狀結構，又稱轉錄復合物。第89頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月核心酶

····DNA

····RNA第90頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月3、轉錄終止

終止子（terminator）：基因編碼區(qū)下游使RNA聚合酶終止mRNA合成的密碼子。

●強終止子－內部終止子

●弱終止子－需要ρ因子（rhofactor）又稱為ρ依賴性終止子（Rho-dependentterminator）不依賴Rho(ρ)因子的轉錄終止依賴Rho(ρ)因子的轉錄終止第91頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月轉錄的終止

DNA分子上有終止轉錄的特殊信號，也是特定的核苷酸序列，稱為終止子。

RNA聚合酶可以識別終止子，它在一種蛋白因子的幫助下，終止轉錄，放出RNA鏈；有時，RNA聚合酶不需要蛋白因子的幫助即可終止轉錄。核心酶釋放了RNA后，也離開DNA。

DNA上的解鏈區(qū)重新形成雙螺旋。第92頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月兩類終止子共同的序列特征在轉錄終止點前有一段回文序列。回文序列的兩個重復部分(每個7～20bp)由幾個不重復的bp節(jié)段隔開。回文序列的對稱軸一般距轉錄終止點16～24bp。

第93頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月不依賴因子的終止終止位點上游一般存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)（回文序列），RNA形成發(fā)夾結構；在回文序列的下游方向又常有6～8個AT堿基對(在模板鏈上為A、在mRNA上為U)；兩類終止子的不同點第94頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月不依賴ρ因子的轉錄終止

DNA模板上靠近終止處，有特殊的堿基序列，轉錄出的RNA產物形成發(fā)夾結構來終止轉錄。在DNA模板接近轉錄終止的區(qū)域，有較密集的A-T配對區(qū)域或者G-C配對區(qū)域據(jù)此線索分析轉錄產物的3‘末端，發(fā)現(xiàn)常有若干個連續(xù)的U，其5’端堿基可形成鼓槌狀的莖環(huán)或稱發(fā)卡結構，可能改變RNA聚合酶的構象，從而導致酶-模板結合方式的改變，使酶不再向下游移動，轉錄終止；或轉錄復合物上局部的RNA：DNA雜化雙鏈由于RNA本身形成的莖環(huán)結構變得更不穩(wěn)定，轉錄復合物趨于解體。第95頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月發(fā)夾式結構和寡聚U的共同作用使RNA從三元復合物中解離出來。第96頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關，長度效率第97頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月依賴因子的終止因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉錄復合物中解離出來，從而終止轉錄。依賴ρ因子終止子中回文序列的GC對含量較少。在回文序列下游方向的序列沒有固定特征，其AT對含量比前一種終止子低。第98頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月依賴ρ因子的轉錄終止ρ因子是由相同的6個亞基組成的六聚體蛋白質，具有ATP酶活性和解螺旋酶活性。ρ因子能結合RNA，又以對polyC的結合力最強。在依賴Rho因子的轉錄終止過程中，發(fā)現(xiàn)產物RNA3’端有較豐富的C，或者有規(guī)律地出現(xiàn)C堿基。因此推測ρ因子終止轉錄的作用在于結合RNA轉錄產物而非DNA模板，結合后ρ因子和RNA聚合酶可能發(fā)生構象變化，從而使RNA聚合酶停頓，ρ因子還可發(fā)揮解旋酶作用，使DNA：RNA雜化雙鏈解離，有利于轉錄產物從轉錄復合物中釋放。第99頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第100頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月轉錄的基本過程第101頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月轉錄的抗終止由于不同的生理要求，在轉錄過程中有時即使遇到終止信號，仍然需要繼續(xù)轉錄，于是出現(xiàn)了抗終止現(xiàn)象。抗終止是細菌操縱子和噬菌體在調控回路中對轉錄進行的調控。抗轉錄終止的兩種方式：1.破壞終止位點RNA的莖-環(huán)結構；2.依賴于蛋白因子的轉錄抗終止。第102頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月RNA的加工和成熟第103頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月絕大數(shù)原核生物的mRNA不需加工，仍為初級轉錄本的形式。相反，真核生物從斷裂基因產生的mRNA要經過復雜的加工歷程，包括去除內含子的剪接反應(splicing)。RNA的加工和成熟包括三個方面：①RNA的一般加工過程（5’端加帽和3’端加尾）②RNA的剪接作用③RNA的編輯作用mRNA的轉錄后加工第104頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第105頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

真核生物mRNA前體稱為hnRNA，又稱類似DNA的RNA(D-RNA)。由hnRNA加工為成熟的mRNA，經歷以下過程：①5′端形成特殊的帽子結構5’端的一個核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸（m7Gppp），mRNA5’端的這種結構稱為帽子（cap）。有三類：帽子0：m7G5′ppp5′X單細胞生物（如酵母）帽子1：m7G5′ppp5′Xm

多細胞生物，主要形式帽子2：m7G5′ppp5′XmpYm

占10~15%真核生物mRNAs的加工

第106頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月鳥苷酸轉移酶催化在5’端以5’-5’磷酸酯鍵加上GTP；通過鳥嘌呤甲基轉移酶在G7位甲基化，形成0型帽子（如酵母）。有的物種在下一堿基（+1）的核糖O2’加上甲基形成1型帽子，有的物種在+1、+2位的核糖O2’加上甲基，形成2型帽子。

第107頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月三種結構類型的帽子0型帽子：m7G5’ppp5’Np1型帽子：

m7G5’ppp5’NmpNp2型帽子：

m7G5’ppp5’NmpNmp第108頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

帽子結構功能：①能被核糖體小亞基識別，促使mRNA和核糖體的結合；②m7Gppp結構能有效地封閉mRNA5’末端，以保護mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增強mRNA的穩(wěn)定。真核生物mRNAs的加工第109頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

②

3’端加尾：

由一種360KD特異性酶切除3′末端一段后，經RNA末端腺甘酸轉移酶催化加上polyA尾巴（約200個A）。PolyA的功能：可能在于增加mRNA的穩(wěn)定性。mRNA轉運翻譯調控真核生物mRNAs的加工第110頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月多聚腺苷酸尾巴的添加AAUAAA：★準確切割★加poly（A）真核生物mRNAs的加工第111頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月m7Gppp鳥甘酸轉移酶第112頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第113頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月③通過剪接除去由內含子轉錄的序列。④鏈內部核苷酸甲基化。主要是m6A，可能對mRNA前體的加工起識別作用。真核生物mRNAs的加工

第114頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

真核生物rRNAs的加工

5SrRNA以單順反子轉錄子被轉錄成一成熟分子，不需加工。其它三種則以多順反子轉錄子被轉錄成一條45SRNA鏈，含有18S，5.8S和28SrRNAs第115頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

真核生物rRNA的成熟過程比較清楚。哺乳動物的初級轉錄本是一條45SRNA鏈，約含110個甲基，是在轉錄中或剛剛轉錄好時加工上去的。45SRNA被加工成18S，5.8S和28SrRNAs。幾乎所有甲基均連接在核糖基上，在成熟的rRNAs中，這些甲基全部被保存。甲基的存在是初級轉錄本轉變成熟的rRNA的標志。

18SrRNA上大約有39個甲基是原來的，有4個是后加上去的；

28SrRNA大約有74個甲基，全部是原來的。第116頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

成熟的途徑可能多樣，因為中間產物的長度在不同途徑中是不一樣的，然而最終產物都是一樣的。其中兩條途徑(HeLa途徑和L途徑)切割的位置是：①18S基因的5’則；②18S和5.8S基因之間的間隔區(qū)(soqacer)；③5.8和28S序列之間的間隔區(qū)

(5.8S序列成為一個和28SrRNA通過堿基配對相結合的小RNA)。第117頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第118頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第119頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌共有7個rRNA的轉錄單位，分散在基因組中。每個轉錄單位由16S、23S、5SrRNA以及一個或幾個tRNA基因組成。

E.coli7個編碼rRNA的操縱子稱為rrnA-G。它們在染色體上不連鎖。每個操縱子均轉錄為一個RNA前體。這些rrn操縱子的組成基本相同，均含有順序為16S-23S-5S的三個rRNA分子。所有rrn操縱子均有雙重啟動子：啟動子P1：位于16S序列起始位點的上游約300bp處。P1可能是主要的啟動子。啟動子P2：在P1的右方約110bp處。原核生物rRNAs的加工第120頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

加工rRNA的酶是RNaseⅢ

在rne-細胞中缺乏成熟的rRNAs，而是30S前體。該前體在體外被RNaseⅢ切割成成熟的rRNA分子。

16S和23SrRNAs的前體分別稱p16和p23，它們分別比16S和23S略長一些。在初級轉錄本中，由于p16、p23的兩端的堿基都是互補的，它們分別形成很大的發(fā)夾。其發(fā)夾頂?shù)沫h(huán)非常大，分別為1600個核苷酸和2900個核苷酸。第121頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月RnaseE識別5SrRNA前體兩端形成的莖環(huán)結構。甲基化修飾。第122頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

第123頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第124頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月tRNA的加工

原核或真核生物中tRNA基因往往成簇存在。在原核生物中，至少某些tRNAs能一起形成操縱子，并由一個啟動子轉錄成一條長的前體RNA鏈。例如，T4噬菌體中8個tRNA基因組成一簇。

E.coli中已找到兩個tRNA基因簇，二者均除tRNA基因外尚含有其他基因。這兩個基因簇均含有tRNATyr的基因，故命名：①tyrU簇，包括4個tRNA基因，tRNAThr，tRNAGly，和tRNATyr；②tyrT簇，則僅包含兩個相同的基因，編碼tRNATyr。第125頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

在每個tRNA基因簇中，唯一的啟動子常位于第一個tRNA基因之前。在最后一個tRNA基因的后面還有編碼蛋白質的基因。在tyrU簇中是基因tutB(編碼延長因子EF-Tu的兩個基因之一)。而在tyrT簇中是編碼蛋白質P的基因(蛋白質P是一種類似魚精蛋白的多肽)。第126頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

E.coli中參與tRNA加工的酶有：

1.RNaseP：它是一種內切核酸酶，負責切割所有tRNA分子的5’端。它是一種不尋常的酶。它由蛋白質和RNA二者組成，分子中RNA有375個堿基長(約130KD)；而蛋白質組分要小得多，大約只有20KD。在E.coli中，基因rnpA編碼其蛋白質組成，而rnpB編碼RNA部分。這兩個基因相隔甚遠。RNA和蛋白質這兩個組分對RNaseP的催化活性似乎都是必須的。第127頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月2.RNaseD：它能從RNA的3‘端一個一個地切去堿基，以產生tRNA的真正的3’端(5‘端由RNaseP產生)。3.RNaseⅡ：有外切核酸酶的活性，它能夠將tRNA完全分解完。以前認為它也與tRNA加工有關，但目前認為它可能僅和RNA的分解代謝有關。第128頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

在細菌中有兩種tRNA前體，其區(qū)別在于其3'端的序列。

Ⅰ型分子有CCA三聯(lián)體在其3‘端。但某些噬菌體編碼的Ⅱ型分子則沒有CCA序列。當其他堿基被一個一個從前體分子上除去后，另由稱為tRNA核苷酸轉移酶的將CCA加到3’端上去。真核生物中可能所有的tRNA前體都屬于Ⅱ型，在成熟時都需要通過酶的作用，在其3'端加上CCA序列。第129頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

E.coli中tRNA加工過程：由識別空間結構的核酸內切酶在tRNA兩端切斷（核糖核酸酶P在單個tRNA5’端切除，生成成熟的5’端；未成熟的3’端由核糖核酸酶D降解，直到出現(xiàn)CCA）。如果tRNA前體3’端中無CCA，通過tRNA核苷酸轉移酶在3’端添加CCA成熟的tRNA存在多種修飾成分，10%的堿基被修飾。第130頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第131頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月常見tRNA中的修飾核苷酸

Cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)mCm5U（5-甲氧基羰甲基尿苷）Xm5s2U（5-甲基-2硫代尿苷）K2C（2-賴氨酸胞苷）Com5U（5(2)-羥羧甲基尿苷）I（Inosine次黃嘌呤）m7G(7-甲基尿苷)m5C（5-甲基胞苷）m6A（6-甲基腺苷）s2C（2-硫代胞苷）ψ(假尿苷）Um(2’-O-甲基尿苷)Q（Queuosine）

Xo5U(5-羥基尿苷)

OHOHNHCH2

H2NR

第132頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

RNA的剪接就是要把斷裂基因的轉錄本中的內含子除去,并使基因中的外顯子拼接起來形成成熟的RNA。

RNA的剪接第133頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月酵母胞核400個tRNA基因中約有40個是斷裂基因。這些基因均只有一個內含子，位于與反密碼子的3’側相隔一個核苷酸之處，長度為14至46bp。不同的tRNA基因中的內含子不同，無任何可識別的共同順序。所有內含子中均有一段反密碼子互補的序列，反密碼子被配對而使反密碼臂伸長了很多。在前體中僅反密碼臂受到影響，其他部分仍保持其正常結構。1.酵母tRNA的剪接

第134頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

酵母tRNAphe中的內含子能與其反密碼子堿基配對，從而改變了反密碼臂的結構。此剪切過程可分為兩個階段：第一步是磷酸二酯鍵的斷裂，這不需要ATP。這一步由一種內切核酸酶所催化。第二步是連接反應，需要ATP的存在，由RNA連接酶所催化。在無ATP時，產生的兩個tRNA半分子不能連接起來。識別信號可能位于前體tRNA的外顯子中的序列和結構。第135頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

這兩個半分子具有獨特的末端：其5’端有OH基，而3’有一個2’,3’-環(huán)磷酸基。當加入ATP時，兩個tRNA半分子先發(fā)生堿基配對，形成成熟tRNA分子的構象，然后由RNA連接酶形成磷酸二酯鍵而將兩個半分子共價連接起來。

2’,3’-環(huán)磷酸基的存在并不限于酵母，在植物和哺乳動物的tRNA剪接反應中也有環(huán)狀基團的產生。在人的HeLa細胞中，RNA連接酶能將帶有2',3'-環(huán)磷酸基的RNA和另一帶有5'-OH基的RNA直接連接起來。酵母tRNA前體也可以在爪蟾的卵母細胞核提取液中正確地被剪接。這表示剪接反應沒有種屬特異性。爪蟾具有能識別酵母tRNA的內含子的酶類。第136頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月內含子外顯子2外顯子1內切酶5’3’外顯子1外顯子23’5’PHO激酶外顯子2外顯子2外顯子2A-P-P3’3’3’連接酶-AMP連接酶ATP內含子P外顯子2P外顯子1POH外顯子1PP外顯子1POH3’5’5’5’AMP磷酸酯酶P環(huán)式磷酸二酯酶pre-tRNA成熟tRNA第137頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

四膜蟲的兩個主要rRNAs基因的初級轉錄本稱為35S前體RNA，較小的rRNA的序列在5‘側，較大的26SrRNA序列則在3’側。在編碼26SrRNA序列存在一個單一的，短的(約400bp)內含子。如將這個35S前體RNA在體外溫育，可以發(fā)生自動剪接作用:內含子從前體中被切出，先呈線性RNA片段，后來又環(huán)化為環(huán)狀RNA。2.rRNA的剪接——自身剪接反應

第138頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第139頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

某些真菌線粒體中的內含子有很不尋常的結構，這些內含子有編碼順序，這些順序的翻譯對于該順序所在的內含子的剪接是必須的。編碼細胞色素b(cytb)的box基因在僅剪去內含子1時，會產生RNA成熟酶的mRNA。當內含子2亦被剪去時，才是cytb的編碼順序的開端。

box基因中的外顯子1有417bp，編碼cytb的N端139個密碼子。內含子1有765bp，不編碼。外顯子2非常短，僅有5個密碼子。其后是一個很長的內含子2，含有840bp組成的開放讀框(ORF)，有280個密碼子，其最后一個密碼子為終止密碼子。3.能夠編碼蛋白質的內含子的剪接

第140頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

當將內含子1剪去后，翻譯即從外顯子1起始，通讀過外顯子2而進入內含子2的ORF，產生一個有423個氨基酸殘基的蛋白質(其中144個是cytb的N端氨基酸，279個則由內含子2編碼）稱為RNA成熟酶(maturase)。

RNA成熟酶是特異地用來剪去內含子2的。這樣，這個酶促反應便成為一個非常敏感的負反饋徑路。去除內含子2后，外顯子1和2即與外顯子3相連接，因而破壞了編碼成熟酶的順序。第141頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第142頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月生物體內內含子的主要類型：

GU-AG、AU-AC、Ⅰ類內含子、Ⅱ類內含子第143頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月參與RNA剪接的物質：snRNA（核內小分子RNA）snRNP（與snRNA結合的核蛋白）第144頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月①第145頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月②③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA-AGUGU6E1E2U1、U4、U5第146頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

mRNA內含子的去除必須非常精確，否則即使只差一個核苷酸，也會產生錯義或移碼的蛋白質。所以可以肯定在內含子與外顯子連接處的核苷酸序列具有高度的相似性。剪接連接點(splicingjunctions)是指在切斷和重接位點處的兩旁的順序。在內含子左側的連接點稱為供體(donor)，在內含子右側的稱為受體(acceptor)。4.mRNA內含子的剪接

⑴細胞核中的剪接連接點

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正確的剪接依賴于天然前體RNA分子的完整性。一個外源基因如果存在于病毒順序中，仍能很好地被剪接。另外，前體RNA亦能在不同的組織，或甚至不同物種的細胞中被正確地剪接。這都表示剪接作用是很保守的。

一個基因的外顯子可以和另一個基因的外顯子連接。例如SV40(猴病毒40)早期轉錄單位的第1外顯子和小鼠β珠蛋白的第3外顯子相連。

剪接作用與轉錄作用、RNA的修飾無關。例如HeLa細胞的核提取液能夠剪接純化的RNA前體，珠蛋白RNAs即使缺少poly(A)尾鏈，也沒有加帽，仍能正常地被剪接。第148頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

剪接過程可分為兩個階段，核內剪接需要ATP。在第一階段中，內含子左端(供體位點)處被切斷，形成兩個分離的RNA分子，即左外顯子和右內含子-外顯子。左外顯子此時為線性分子，但右內含子-外顯子則不然：內含子左端(5'端)以5'-2'鍵與在內含子右端上游約30堿基處的CTGAC序列(共同序列)中的A相連接，于是形成一個"套索"(lariat)"。⑵剪接過程——套索的產生

第149頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第150頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

在第二階段，在受體位點處被切斷而將此套索狀的內含子剪去；同時分離的右外顯子即與左外顯子相連接。套索然后被“脫支(debranch)”而形成一線性內含子。在這種剪接機構中，有三個很短的共同順序，即供體點、受體點和套索分支處的序列。供體點分支點受體點外顯子1…GGU……APy……AG…外顯子2

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分支點外顯子1…GGU……APy……AG…外顯子2

UG

G…外顯子1

APy……AG…外顯子2

UGG…外顯子1APy……AG…外顯子2

外顯子1…G…外顯子2＋UG

APy……AG第152頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

剪接反應需要蛋白質和RNA參與。①參與剪接反應的蛋白質：有5類A.SR蛋白家族：含有S-Ser和R-Arg二肽重復序列，起調控作用。結合于多聚嘧啶束的蛋白質：

2種U2snRNP的輔助因子(U2AF)，

1種多聚嘧啶束的結合蛋白(PTB)，

1種與PTB相連的剪接因子(PSF).與snRNP相連的剪接蛋白第153頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月D.其它剪接蛋白：帽子結合蛋白CBP；剪接體形成蛋白；催化必需的蛋白質因子；依賴于ATP的RNA解旋酶；特異于SR蛋白的激酶。E.組成snRNPs的大量蛋白質②參與剪接反應的RNA：

U1、U2、U4、U5和U6snRNA五種。

snRNA和大量蛋白質結合組成snRNP(小核糖核蛋白顆粒)第154頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

每個真核細胞中含有105-106個小RNA，約有100~300個堿基，它們是由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ所合成的，其中某些像mRNA一樣可被加帽。

snRNA：在細胞核中，如U1~6

snRNAscRNA：在細胞漿中

snRNP：snRNA-蛋白質復合物，U1~6

snRNPscRNP：scRNA-蛋白質復合物(3)snRNAs的作用snRNPs的作用：和剪接作用有密切關系，有些snRNPs分別和供體及受體剪接位點以及分支順序相互補。第155頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月第156頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

編碼蛋白質的結構基因是在核漿中被轉錄的。核漿中的RNA大，很不穩(wěn)定，并且其順序的復雜性也要大得多。由于它的大小很不一致，故稱核內不均一RNA(hnRNA)。

mRNA是從hnRNA生成的。胞漿內mRNA平均只有1800-2000個堿基。而哺乳動物的hnRNA平均有8000-10000個堿基，其范圍很廣泛，從2000-14000堿基均有，所以一般要比mRNA大4-5倍。正常哺乳細胞中mRNA僅占hnRNA量的5%，則相當于有25%的hnRNA可轉變?yōu)閙RNA。有3/4的hnRNA即在核內降解。(4)核內不均一RNA第157頁，課件共192頁，創(chuàng)作于2023年2月

hnRNA被切除內含子后即成為mRNA，并進入細胞漿內。但在切除內含子之前，hnRNA可先加帽和加poly(A)尾鏈。有一種稱為poly(A)聚合酶的酶可以用ATP為底物，以加上poly(A)尾鏈，這是hnRNA轉變?yōu)槌墒斓膍