生物化學檢測技術第1頁，課件共170頁，創作于2023年2月內容主要由六個模塊構成：生物化學檢測技術免疫學檢測技術細胞學檢測技術分子生物學檢測技術微生物學檢測技術生物檢測儀器第2頁，課件共170頁，創作于2023年2月第一章生物化學檢測技術第3頁，課件共170頁，創作于2023年2月內容第一節電泳技術第二節光譜分析技術第三節生物大分子含量測定第四節色譜分析技術第五節干化學分析技術第4頁，課件共170頁，創作于2023年2月目標掌握瓊脂糖電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和操作要點。掌握可見光和紫外光的分光光度技術的原理和方法。理解各種蛋白質含量測定技術的原理和優缺點。理解各種核酸含量測定技術的原理和優缺點。第5頁，課件共170頁，創作于2023年2月第一節電泳檢測技術電泳：帶電質點在電場中移動的現象。1809年由俄國人發現。1937年瑞典科學家Tiselius建立了“移界電泳法”，成功地分離血清蛋白質各成分。50年代，改進電泳儀，尋找合適的電泳支持介質，先后找到濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉及瓊脂作為支持物。60年代，找到聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物，在此基礎上發展了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和印跡轉移電泳等技術。這些技術具有設備簡單，操作方便，分辨率高等優點。目前，電泳技術已成為生物化學與分子生物學以及與其密切相關學科分析中必不可少的手段。第6頁，課件共170頁，創作于2023年2月電泳槽和大分子分離結果第7頁，課件共170頁，創作于2023年2月電泳技術分類第8頁，課件共170頁，創作于2023年2月從實際和實用出發的分類根據分離樣品樣品的數量和目的分制備和分析電泳根據結合配套的技術分免疫、層析、等電聚焦、轉移、雙向、脈沖梯度電場、垂直交替凝膠電泳等根據使用電壓分常壓（＜500）和高壓電泳。根據電泳系統pH連續與否分連續和不連續pH電泳根據介質使用與否分自由和區帶電泳（濾紙、薄層、凝膠電泳）根據電泳槽的形式分有垂直的、水平的、柱狀的、板狀的、毛細管的、濕小室及幕狀的。毛細管電泳是20世紀80年代研制出的一種新型的區帶電泳方法，具有分辨率好、靈敏度高、檢測快捷等特點。第9頁，課件共170頁，創作于2023年2月自由電泳可分為：①顯微電泳（也稱細胞電泳），是在顯微鏡下觀察細胞或細菌的電泳行為；②移界電泳；③柱電泳；④自由流動幕電泳；⑤等速電泳等。支持物電泳根據支持物的特點又可分為：紙電泳薄層電泳醋酸纖維素薄膜電泳非凝膠性支持物區帶電泳(支持物有：淀粉、纖維素粉、玻璃粉、硅膠等)凝膠區帶電泳：淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳。第10頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15南京農業大學生命科學學院11第11頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15南京農業大學生命科學學院12第12頁，課件共170頁，創作于2023年2月電泳基本原理電泳是不同的物質顆粒在一定的電場強度下，由于所帶電荷及顆粒大小形狀等不同，因此向相反電極泳動速度不同進而達到分離目的一種方法。在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數量）、大小和形狀，在一定時間內它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術進行分離、分析和鑒定的基本原理。第13頁，課件共170頁，創作于2023年2月帶電顆粒在電場中泳動的速度稱遷移率或泳動度。電泳時，帶電顆粒（球形）在介質中受力平衡勻速運動，則有：v=F阻/f=FE/f=E·q/f=E·q/(6π·r·η)v—泳動度F阻—顆粒所受阻力FE—顆粒所受電場力f—摩擦系數由上式可見：泳動度與球形分子半徑、介質粘度、顆粒所帶電荷以及電場強度有關。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大的阻力，即粒子的泳動度與粒子形狀有關。E—電場強度q—顆粒所帶電荷r—顆粒半徑η—介質黏度第14頁，課件共170頁，創作于2023年2月相對遷移率（Rf）：分離區帶的泳動速度可用相對遷移率來表示。測定遷移率時，在電泳結束后要先在指示劑移動的位置（前沿）作一標記（通常是插一根短銅絲），染色后，量出指示劑移動的距離和酶帶移動的距離。Rf＝譜帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離

測量遷移率時，應以譜帶的中部位置為準，值得注意的是，交聯劑的濃度，交聯劑和丙烯酰胺的比例，催化劑濃度及聚膠時的溫度和時間均對凝膠柱結構有影響，因而會影響遷移率。另外，電泳時電場強度等也會影響帶電顆粒遷移速度。為了使試驗重復性好，這些因子都應盡可能保持恒定。第15頁，課件共170頁，創作于2023年2月一、瓊脂糖凝膠電泳1、原理：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數值成反比關系。因而就可依據DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區帶。第16頁，課件共170頁，創作于2023年2月以對于分子量大的樣品，如大分子核酸，病毒等，一般采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。瓊脂糖凝膠的特點：天然瓊脂是一種多聚糖，主要由瓊脂糖(約占80%)及瓊脂膠組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列織成。第17頁，課件共170頁，創作于2023年2月2、操作方法試劑與設備上樣bufferⅠ0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液Ⅱ0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液以上溶液4℃保存備用。第18頁，課件共170頁，創作于2023年2月制膠：稱干粉，融化，倒膠，插梳子，凝固，裝電泳槽。第19頁，課件共170頁，創作于2023年2月3、步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取總DNA或質粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。⑸打開電源開關，調節電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min。第20頁，課件共170頁，創作于2023年2月⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到發出熒光的DNA條帶。第21頁，課件共170頁，創作于2023年2月目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，瓊脂糖是經過挑選，以質地較純的瓊脂作為原料而制成的。優點如下：瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大(約占98-99%)，近似自由電泳，樣品擴散度較自由電泳小，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈監測及定量測定。電泳后區帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。第22頁，課件共170頁，創作于2023年2月目前，常用瓊脂糖作為電泳支持物，分離蛋白質和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學相結合，發展成免疫電泳技術，能鑒別其他方法不能鑒別的復雜體系，由于建立了超微量技術，0.1μg蛋白質就可檢出。瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定，DNA限制性內切酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便，設備簡單，需樣品量少，分辨能力高，已成為基因工程研究中常用實驗方法之一。第23頁，課件共170頁，創作于2023年2月瓊脂糖濃度(%)線型DNA分子的大小(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～32.00.1～2第24頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15韶關大學生命科學學院25PCR產物的瓊脂糖電泳第25頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15261002003001,6501,0005008506504005,000bp2,000DNAladderDNAladderPCR產物12345678膠孔+--+-++-引物二聚體第26頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15南京農業大學生命科學學院27第27頁，課件共170頁，創作于2023年2月4、影響因素1）瓊脂糖來源，純度。酸根取代導致Agarose帶電。對支持物的一般要求是均勻，吸附力和電滲小，機械性能好，便于染色或紫外光下檢測，故最好透明，無紫外吸收。常用的支持物有濾紙，醋酸纖維素薄膜，淀粉凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠等。支持物性質不同也會影響泳動速率，如瓊脂于聚丙烯酰胺凝膠都有大小不同的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質顆粒的泳動速率快，反之則慢。2）膠濃度第28頁，課件共170頁，創作于2023年2月3）電場強度：電場強度是指每厘米的電位降，也稱電位梯度(電勢梯度)。電場強度越高，則帶電顆粒泳動越快。根據電場強度的不同，電泳可分為：常壓(100-500V)電泳。其電場強度為2-10V/cm。分離時間較長，從數小時到數十小時，適合于分離蛋白質等大分子物質。高壓(2000-10000V)電泳。其電場強度為50-200V/cm，電泳時間很短，有時只需幾分鐘。多用于分離氨基酸、多肽、核苷酸、糖類等小分子物質。第29頁，課件共170頁，創作于2023年2月4）溶液pH為使電泳時pH值恒定，必須采用緩沖液作為電極液，溶液的pH值決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定其所帶電荷的多少。對蛋白質而言，溶液pH值離等電點越遠，則顆粒所帶的凈電荷越多，泳動速度也越快；反之，則越慢。因此分離某種蛋白質混合液時，應選擇合適的pH使欲分離的各種蛋白質所帶的電荷數量有較大的差異。第30頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15南京農業大學生命科學學院31第31頁，課件共170頁，創作于2023年2月5）溶液的離子強度緩沖液離子強度越高，則顆粒的電動電勢越小，泳動度也越小。一般最適合的離子強度在0.02-0.2之間。溶液離子強度(ionicstrength)的計算公式如下：I=1/2Σcz2

式中，I為離子強度，c為離子的摩爾濃度(mol/L)，z為離子價數，價數越高，則離子強度越大。6）電滲電泳緩沖液相對于固體支持物的移動稱電滲。如紙電泳時，濾紙吸附OH-離子帶負電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負極移動，會對顆粒的移動造成不良影響，故電泳時，電滲小些為好。第32頁，課件共170頁，創作于2023年2月7）溫度電泳時會產生焦耳熱，使介質粘度下降，分子運動加快，遷移率增加，同時溫度過高會使樣品中的生物大分子變性失活，因此電泳時，要控制電壓或電流，也可安裝冷卻散熱裝置。8）支持物現代電泳多在固體支持物上進行，使樣品中的不同組分形成不同的區帶，稱區帶電泳。電泳結束后，支持物可以方便地進行染色等后續處理。第33頁，課件共170頁，創作于2023年2月印跡轉移電泳：生物化學與分子生物學的研究工作經常需要對電泳分離后的DNA進行分子雜交，但瓊脂糖不適合于進行雜交操作1975年，Southern創造了將經瓊脂糖凝膠電泳后的DNA區帶原位轉移到硝酸基纖維素膜(NC膜)上，再進行雜交的方法，被稱為Southern印跡法。隨后出現RNA印跡（被戲稱為Northern印跡），蛋白質印記（Western印跡）等。第34頁，課件共170頁，創作于2023年2月交變脈沖電場凝膠電泳一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因為在瓊脂糖凝膠中，DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，在電場作用下，迫使DNA變形擠過篩孔，而沿著泳動方向伸直，因而分子大小對遷移率影響不大。如此時改變電場方向，則DNA分子必須改變其構象，沿新的泳動方向伸直，而轉向時間與DNA分子大小關系極為密切。1983年，Schwartz等人根據DNA分子彈性弛豫時間（外推為零的滯留時間）與DNA分子大小有關的特性，設計了脈沖電場梯度凝膠。Carle等改進了電泳技術，并發現周期性的反轉換電場亦能使大分子DNA通過電泳分開。第35頁，課件共170頁，創作于2023年2月該電泳系統是由一個水平式電泳槽和兩組獨立，彼此垂直的電極組成，一組電極負極為N，正極為S；另一組負極為W，正極為E。一塊正方形瓊脂糖凝膠板呈45°置于中央，電場在N-S和W-E之間交替建立。電場交替改變的時間長短與欲分離的DNA分子大小有關。電泳時，DNA分子處在連續間隔交替的電場中。首先向S極移動，然后改向E極。在每次電場方向改變時，DNA分子就要有一定的時間松弛，改變形狀和遷移方向。只有當DNA分子達到一定構型后，才能繼續前進。DNA分子凈移動方向與加樣線垂直，使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區帶。交變脈沖電泳可有效分離數百萬bp的大分子DNA。第36頁，課件共170頁，創作于2023年2月4.4.交變脈沖電場凝膠電泳第37頁，課件共170頁，創作于2023年2月免疫電泳：免疫電泳是以瓊脂（糖）為支持物，在免疫的基礎上，將瓊脂（糖）區帶電泳與免疫擴散相結合產生特異性的沉淀線、弧或峰。此技術的特點：樣品用量極少，免疫識別具有專一性，分辨率高。在瓊脂糖免疫雙擴散的基礎上發展了多種免疫電泳，如微量免疫電泳、對流免疫電泳、單向定量免疫電泳（火箭電泳）、放射免疫電泳及雙向定量免疫電泳等。上述各種電泳有其共性，但又有不同的操作方法及原理，詳見后續章節。第38頁，課件共170頁，創作于2023年2月二、RNA電泳檢測1、原理與過程RNA電泳基本同DNA電泳一樣。但應明確一點的是，因為RNA分子對RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴格處理以盡量減少RNA酶對樣品的降解。另外，因為RNA分子有二、三級結構可以影響其電泳結果，因此電泳時應在變性劑存在下進行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。第39頁，課件共170頁，創作于2023年2月2、試劑設備試劑:5XMOPS電泳緩沖液：20.9gMOPS(0.1mol/L),pH7.0;8.3ml3mol/LNaAC(40mmol/L);10.0ml0.5mol/LEDTA(5mmol/L)pH8.0,用水定容至1L.以上藥品和水均需用DEPC處理。10x甲醛上樣緩沖液：1mmol/LEDTA,pH8.0;0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯藍，50%甘油).37%甲醛（pH大于4.0，12.3mol/L）;甲酰胺;10mg/ml溴化乙錠.以上藥品和水均需用DEPC處理。第40頁，課件共170頁，創作于2023年2月3、步驟膠的制備：1.5g瓊脂糖加115ml水，加熱融化。冷卻至60℃時加30ml的5XMOPS電泳緩沖液(終濃度為1X);加5ml甲醛（瓊脂糖終濃度為1%）。制膠。樣品制備：

RNA(最多30ug)5.5ul5XMOPS電泳緩沖液2.0ul

甲醛3.5ul

甲酰胺10ul

在65℃下處理15min,然后置冰上。加樣品前，先用5v/cm電壓電泳5分鐘。制備好的樣品短暫離心后加10X上樣緩沖液2ul，混勻。上樣。在1XMOPS電泳緩沖液中電泳2-3小時。在電泳1-2小時后，可混合正負極緩沖液，再繼續電泳。染色：將電泳好的膠板轉移至含0.5ug/L溴化乙錠的0.1mmol/LNH4AC溶液中染色30-40min.（溴化乙錠也可以在電泳前加于樣品中）第41頁，課件共170頁，創作于2023年2月4、影響因素1）Agarose來源，純度。2）膠濃度3）以乙二醛—DSMO做變性系統時，制膠時不加EB，電泳后浸膠入EB溶液。并需要buffer循環系統，避免形成過高的pH梯度。4）避免RNA因RNase污染而降解。第42頁，課件共170頁，創作于2023年2月三、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡稱Acr）和交聯劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱PAGE）。第43頁，課件共170頁，創作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠有下列優點：在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好。化學性能穩定，與被分離物不發生化學反應。對pH和溫度變化較穩定。幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復性好。樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g。凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯劑的濃度調節。分辨率高，尤其在不連續凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。第44頁，課件共170頁，創作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠于瓊脂糖凝膠的不同之處：分離范圍不同瓊脂糖凝膠電泳分離分子量比較大的物質，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝膠分離分子量較小的物質，如蛋白質，氨基酸等。凝膠配置程序不同瓊脂糖凝膠在緩沖液中加熱融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝膠在配置時還要加多種成分，并且對聚合溫度也有一定的要求，否則會影響凝膠孔徑的大小。凝膠的厚度不同瓊脂糖凝膠最薄只能達到３ｍｍ；聚丙烯酰胺凝膠可以制成０.２ｍｍ，分辨率高。成本不同。瓊脂糖價格便宜；聚丙烯酰胺凝膠價格較高安全性不同。瓊脂糖沒有毒性；聚丙烯酰胺凝膠有毒性第45頁，課件共170頁，創作于2023年2月PAGE應用范圍廣，可用于蛋白質、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定相對分子質量、等電點等。聚丙烯酰胺凝膠電泳又有以下幾種：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳變性聚丙烯酰胺凝膠電泳連續密度梯度電泳聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳第46頁，課件共170頁，創作于2023年2月1、凝膠聚合的原理及有關特性1.1.聚合反應第47頁，課件共170頁，創作于2023年2月聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下合成的。催化系統常用有兩種：過硫酸氨—TEMED化學催化聚合系統此系統中，四甲基乙二胺（TEMED）稱為加速劑，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使過硫酸氨（APS，引發劑）形成自由基。這些自由基的產生可以引發丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯反應，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。核黃素—TEMED光聚合催化系統此系統中，核黃素經紫外線光解形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發聚合反應。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統主要用用于大孔濃縮膠的配置。第48頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15南京農業大學生命科學學院49第49頁，課件共170頁，創作于2023年2月1.2.凝膠孔徑的可調性及其有關性質凝膠性能與總濃度及交聯度的關系：凝膠的孔徑、機械性能、彈性、透明度、粘度和聚合程度取決于凝膠總濃度和Acr與Bis之比。T—Acr和Bis總濃度C—交聯劑百分比V—緩沖液體積(mL)a/b(W/W)與凝膠的機械性能密切相關。當a/b＜10時，凝膠脆而易碎，堅硬呈乳白色；a/b＞100時，即使5%的凝膠也呈糊狀，易于斷裂。欲制備完全透明而又有彈性的凝膠，應控制a/b=30左右。a—Acr克數b—Bis克數第50頁，課件共170頁，創作于2023年2月不同濃度的單體對凝膠性能影響很大。Davis的實驗發現Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝膠就不能聚合。當增加Acr濃度時要適當降低Bis的濃度。通常，T為2%-5%時，a/b=20左右；T為5%-10%時，a/b=40左右；T為15%-20%時，a/b=125-200左右，為此Richard等(1965)提出一個選擇c和T的經驗公式；C=6.5?0.3T此公式適用于T為5-20%范圍內的c值，其值可有1%的變化。在研究大分子核酸時，常用T=2.4%的大孔凝膠，此時凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%瓊脂糖。在T=3%時，也可加入20%蔗糖以增加機械性能，此時，并不影響凝膠孔徑的大小。第51頁，課件共170頁，創作于2023年2月凝膠濃度與孔徑的關系：T與C不僅與凝膠的機械性能有關，還與凝膠的孔徑關系極為密切。一般講，T濃度大，孔徑小，移動顆粒穿過網孔阻力大。此外，孔徑還同Acr與Bis的比例有關，Bis占Acr總濃度5%時，孔徑最小。凝膠濃度與被分離物相對分子量質的關系：由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過可移動顆粒的相對分子質量也不同。在操作時，可根據被分離物相對分子質量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標準膠)，因為生物體內大多數蛋白質在此范圍內電泳均可取得較滿意的結果。如分析未知樣品時也可用4%-10%的梯度膠測試，根據分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。第52頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15韶關大學生命科學學院53第53頁，課件共170頁，創作于2023年2月1.3.影響凝膠聚合的因素Acr及Bis的純度：應選用分析純的Acr及Bis，兩者均為白色結晶物質，λ280無吸收。如試劑不純，含有雜質或丙烯酸時，則凝膠聚合不均一，或聚合時間延長甚至不聚合，因而需進一步純化。Acr及Bis固體應避光，貯存在棕色瓶中，因自然光、超聲波及γ射線均可引起Acr自身聚合或形成亞胺橋而交聯，造成試劑失效。Acr和Bis貯液的pH值為4.9-5.2，當pH值的改變大于0.4pH單位則不能使用，因在偏酸或偏堿的環境中，它們可不斷水解放出丙烯酸和NH4+而引起pH值改變，從而影響凝膠聚合。因此，配制的Acr和Bis貯液應置棕色瓶中，4℃貯存，存放期一般不超過1-2個月為宜。第54頁，課件共170頁，創作于2023年2月AP、核黃素、TEMED：是凝膠聚合不可缺少的試劑，AP應在干燥、避光的條件下保存，其水溶液應置棕色瓶中，4℃冰箱貯存，一般僅能存放一周。TEMED（液狀）應密閉貯于4℃冰箱中。增加AP和TEMED可加快聚合速率，但過量的AP和TEMED會引起電泳時燒膠和譜帶變形。應選擇合適的配方使聚合在40-60min內完成。pH：堿性條件下聚合快，但堿性過強時膠硬而脆，需高pH時應減少AP和TEMED用量，制酸性膠可加AgNO3等促進聚合。溫度：溫度高聚合快，但高濃度凝膠聚合時易產生小氣泡，低溫(5℃)聚合凝膠會變得脆而混濁，一般25-35℃聚合較好。氧分子：氧分子阻礙凝膠聚合，故不含SDS的凝膠最好先抽真空脫氣，再加引發劑。第55頁，課件共170頁，創作于2023年2月2、PAGE原理（非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）PAGE電泳據電泳裝置不同分為垂直的圓盤及板狀兩種。前者凝膠是在玻璃管中聚合，樣品分離區帶染色后呈圓盤狀，因而稱為圓盤電泳；后者凝膠是在兩塊間隔幾毫米的平行玻璃板中聚合，故稱為垂直板狀電泳。兩者電泳原理完全相同。第56頁，課件共170頁，創作于2023年2月蛋白質進行PAGE時，常用垂直板電泳。垂直板電泳的優越性有：表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應，條帶更清晰。在同一塊膠板上可同時進行10個以上樣品的電泳，便于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉移電泳及放射自顯影。膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用于分析，還可用于制備。膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長期保存與掃描。可進行雙向電泳。第57頁，課件共170頁，創作于2023年2月PAGE據其有無濃縮效應，分為連續系統與不連續系統兩大類。連續系統電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應；不連續系統電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，還具有濃縮效應，故分離效果更好。不連續的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質，利用凝膠層的不連續性、緩沖液離子的不連續性、PH的不連續性及電位梯度的不連續性，使樣品在不連續的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區帶，然后進行分離。第58頁，課件共170頁，創作于2023年2月根據緩沖液的PH值的高低，可分為堿性系統、酸性系統和中性系統。不連續體系由電極緩沖液、樣品膠、濃縮膠及分離膠組成，排列順序依次為上層樣品膠、中間濃縮膠、下層分離膠。樣品膠的作用是防止對流，促使樣品濃縮以免被電極緩沖溶稀釋。目前一般不用樣品膠，直接在樣品液中加入等體積40%蔗糖，同樣具有防止對流及樣品被稀釋的作用。濃縮膠是樣品膠的延續，凝膠濃度及pH值與樣品膠完全相同，其作用是使樣品進入分離膠前，被濃縮成窄的區帶，從而提高分離效果。分離膠的T=7.0%-7.5%，C=2.5%，緩沖液為pH8.9的Tris-HCl，大部分蛋白質在此pH條件下帶負電荷。此膠主要起分子篩作用。第59頁，課件共170頁，創作于2023年2月2.1.樣品濃縮效應凝膠孔徑的不連續性：上述3層凝膠中，樣品膠及濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當進入小孔膠時，受到的阻力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶。電位梯度的不連續性：電泳開始后，快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低的低電導區，使局部電位梯度增高，將蛋白質濃縮成狹窄的區帶。第60頁，課件共170頁，創作于2023年2月緩沖體系離子成分及pH值的不連續性：在三層凝膠中均有Tris及HCl。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH值，是緩沖配對離子。HCl在任何pH溶液中均易解離出Cl－，在電場中遷移率快，走在最前面稱為快離子。電極緩沖液中，除有Tris外還有甘氨酸，其pI=6.0，在pH8.3的電極緩沖液中，易解離出甘氨酸根，而在pH6.7的凝膠緩沖體系中，甘氨酸解離度僅有0.1%-1%，因而在電場中遷移很慢，稱為慢離子。血清中大多數蛋白質pI在5.0左右，在pH6.7或8.3時均帶負電荷向正極移動，遷移率介于快離子與慢離子之間，于是蛋白質就在快、慢離子形成的界面處，被濃縮成為極窄的區帶。當進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質；因此Cl－及甘氨酸根沿著離子界面繼續前進。蛋白質分子由于相對分子質量大，被留在后面，逐漸分成多個區帶。第61頁，課件共170頁，創作于2023年2月第62頁，課件共170頁，創作于2023年2月2.2.分子篩效應大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現出不同的遷移率，這就是分子篩效應。當被濃縮的蛋白質樣品從濃縮膠進入分離膠時，pH值和凝膠孔徑突然改變，分離膠的pH值8.9接近甘氨酸的Pka值（9.7～9.8），這樣慢離子的解離度增大，因而它的有效泳動率也增加。此時慢離子的有效泳動率超過了所有蛋白質的有效泳動率。這樣，高電勢梯度不存在了，各種蛋白質僅會由于其分子量或構型的不同，在一個均一的電勢梯度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠時所受阻滯的程度不同，表現的泳動率的不同而被分開。這種分子篩效應不同于柱層析中的分子篩效應，后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子后流出。第63頁，課件共170頁，創作于2023年2月2.3.電荷效應蛋白質樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質區，但由于每種蛋白質分子所帶有效電荷不同，因而泳動率也不同，因此各種蛋白質就按泳動率快慢順序排列成一個一個區帶。在進入分離膠時，電荷效應仍起作用。目前，PAGE連續體系應用也很廣，雖然電泳過程中無濃縮效應，但利用分子篩及電荷效應也可使樣品得到較好的分離，加之在溫和的pH條件下，不致使蛋白質、酶、核酸等活性物質變性失活，也顯示了它的優越性。第64頁，課件共170頁，創作于2023年2月變性PAGE原理聚丙烯酰胺凝膠分為非變性凝膠和變性凝膠兩種。所謂非變性凝膠，即在凝膠中不加變性劑，這種凝膠中，蛋白質的遷移率受它的靜電荷與分子大小兩個因素的影響。因此在非變性凝膠中進行電泳是不能測得分子量的。所謂變性凝膠，即在凝膠中加入變性劑，如尿素、SDS(十二烷基磺酸鈉)、巰基乙醇、DTT等。這些變性劑可以破壞或改變蛋白質的結構，把絕大部分蛋白質分離成組成它們的亞基。同時在蛋白質分子周圍包圍了大量負電荷。這種電荷基本上掩蓋了無變性劑存在時正常就有的任何電荷。蛋白質在這種變性凝膠中的遷移率與它們分子量的對數成直線關系。因此利用變性凝膠進行電泳可以測得蛋白質的分子量。目前應用較多的變性劑為SDS。第65頁，課件共170頁，創作于2023年2月變性PAGE原理SDS時，在蛋白質溶解液中加入SDS和疏基乙醇。巰基乙醇可使蛋白質分子中二硫鍵還原，使多肽分成單個亞單位。SDS可使蛋白質的氫鍵、疏水鍵打開，還引起蛋白質構象的改變，并形成復合物。此復合物的流體力學和光學性質均表明，它們在水溶液中的形狀近似雪茄形的長橢圓棒。不同蛋白質-SDS復合物的短軸相同，約1.8nm，而長軸則與蛋白質的Mr成正比。第66頁，課件共170頁，創作于2023年2月第67頁，課件共170頁，創作于2023年2月目前，用SDS研究過的蛋白質已有數百種，均證實此法測定蛋白質Mr的可靠性。測定未知蛋白質Mr時，可選用相應的一組標準蛋白及適宜的凝膠濃度，同時進行SDS，則可根據已知Mr蛋白質的電泳遷移率和Mr的對數作出標準曲線，再根據未知蛋白質的電泳遷移率求得Mr。本方法有儀器設備簡單，操作方便，樣品用量少，耗時少(僅需一天)，分辨率高，重復效果好等優點，因而得到非常廣泛的應用與發展。它不僅用于蛋白質Mr測定，還可用于蛋白混合組分的分離和亞組分的分析，當蛋白質經SDS分離后，設法將各種蛋白質從凝膠上洗脫下來，除去SDS，還可進行氨基酸順序、酶解圖譜及抗原性質等方面的研究。第68頁，課件共170頁，創作于2023年2月3、試劑與方法（略）4、影響因素1）蛋白質與SDS的結合2）離子強度3）樣品制備無沉淀，顆粒4）樣品中存在阻礙gel聚合的成分，或易變性成分5）固定、染色可能丟失小肽段。第69頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15南京農業大學生命科學學院70第70頁，課件共170頁，創作于2023年2月然而SDS也有不足之處，尤其是電荷異常或構象異常的蛋白、帶有較大輔基的蛋白(如糖蛋白)及一些結構蛋白等測出的Mr不太可靠。如組蛋白F1，本身帶有大量正電荷，雖然結合了正常量的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷，故用SDS測得的Mr為35000，而用其他方法測定的Mr僅為21000。因此要確定某種蛋白質的Mr時，最好用2種測定方法互相驗證。尤其是對一些由亞基或兩種以上肽鏈組成的蛋白質，由于SDS及巰基乙醇的作用，肽鏈間的二硫鍵被打開，解離成亞基或單個肽鏈，因此測定結果只是亞基或單條肽鏈的Mr，還需用其他方法測定分子中肽鏈的數目。第71頁，課件共170頁，創作于2023年2月連續密度梯度電泳（PG）原理：連續密度梯度電泳使用的是從上至下的一個正的線性梯度凝膠，點在凝膠頂部的樣品在電場中向著凝膠濃度逐漸增高的方向即孔徑逐漸縮小的方向遷移。隨著電泳的繼續進行，蛋白質受到孔徑的阻力越大。電泳開始時，樣品在凝膠中的遷移速度主要受到本身的電荷密度和樣品分子的大小的影響。當遷移所受到的阻力大到阻以使樣品分子完全停止前進時，那些跑得很慢的低電荷的樣品分子將趕上與它大小相同但具有較高電荷密度的分子并停留下來形成區帶。第72頁，課件共170頁，創作于2023年2月因此在梯度凝膠電泳中，樣品的最終遷移位置僅取決于分子本身的大小，而與樣品分子的電荷密度無關。樣品混合物中分子質量大小不同的組分，電泳之后將依分子質量大小停留在不同的凝膠孔徑層次中形成相應的區帶。第73頁，課件共170頁，創作于2023年2月線性梯度凝膠制備線性梯度凝膠制備不同于均一濃度凝膠制備，應預先配制低濃度膠（2%或4%）貯液置貯液瓶中；高濃度膠（16%或30%）貯液置混合瓶中（兩者體積比為1/1），在梯度混合器及蠕動泵的協助下，從下至上灌膠。凝膠聚合后，則形成從下到上、從濃至稀依次排列的線性梯度凝膠。第74頁，課件共170頁，創作于2023年2月PG的優點：由于梯度凝膠孔徑的不連續性，具有使樣品中各個組分濃縮的作用，稀釋的樣品可以分次上樣，不會影響分離效果可提供更清晰的蛋白質區帶，用于蛋白質純度的鑒定。可在一個凝膠板上同時測定數個相對分子質量相差很大的蛋白質。可直接測定天然狀態蛋白質相對分子質量，而不被解離為亞基。因此，本法可作為SDS測定蛋白質相對分子質量的補充。盡管本法有上述優點，但主要適用于測定球狀蛋白質相對分子質量，對纖維狀蛋白相對分子質量的測定誤差較大。另外，由于相對分子質量測定僅僅是在未知蛋白質和標準蛋白質達到了被限定的凝膠孔徑時（即完全被阻止遷移時）才成立，電泳時要求足夠高的電壓（一般不低于2000V），否則將得不到預期的效果。因此，采用PG測定蛋白質相對分子質量有一定的局限性，需用其他方法進一步驗證。第75頁，課件共170頁，創作于2023年2月聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳（IEF）原理：蛋白質是兩性電解質，當pH＞pI時帶負電荷，在電場中向正極移動；當pH＜pI時帶正電荷，在電場中向負極移動；當pH=pI時凈電荷為零，在電場中既不向正極也不向負極移動，此時的pH就是該蛋白質的等電點（pI）。聚丙烯酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質載體，在電場的作用下會自發形成一個連續pH梯度。蛋白質樣品在電泳中被分離。運動到等電點膠層時就失去所帶電荷而穩定停留在該處并聚焦成帶，樣品中不同蛋白質組分等電點不同，因而在等電聚焦中得到有效的分離。在等電聚焦中，利用各蛋白質組分等電點的差異，并不利用凝膠的分子篩作用。第76頁，課件共170頁，創作于2023年2月第77頁，課件共170頁，創作于2023年2月兩性電解質載體是IEF中最關鍵的試劑，它直接影響pH梯度的形成及蛋白質的聚焦。載體兩性電解質必須具備的條件：它的化學組成應不同于被分離物，不干擾被分離物的鑒定。它的分子量要小，這樣便于與被分離的物質分開。具有化學惰性，不與被分離物質反應，也不能使被分離物質變性。在等電點處必須具有足夠的緩沖能力。在等電點處必須具有足夠高的電導，以使一定的電流通過。第78頁，課件共170頁，創作于2023年2月pH梯度的形成：兩性電解質載體是含有一系列pK和pI各自相異卻又相近的脂肪族多氨基多羧基的混合物。將其混入到電泳支持物中，開始電泳后，各組分在中性溶液介質中都發生解離，并形成一個平滑穩定的由正極向負極逐漸上升的pH梯度。在防止對流的情況下，只要有電流存在就可以保持穩定的pH梯度，因為此時由于擴散和電移動所引起的物質移動處于動態平衡。在此pH梯度中，各種蛋白質遷移到各自的pI處而得到分離。由此可見，該蛋白質在“自然”pH梯度中，無論處于何種位置均會向其等電點移動，并最終停留在該處。第79頁，課件共170頁，創作于2023年2月等電聚焦的優點是：有很高的分辨率，可將等電點相差0.01～0.02PH單位的蛋白質分開；一般電泳由于受擴散作用的影響，隨著時間和所走距離加長，區帶越走越寬，而電聚焦能抵消擴散作用，使區帶變窄；由于這種電聚焦作用，不管樣品加在什么部位，都可聚焦到其等電點處，很稀的樣品也可進行分離；可直接測出蛋白質的等電點，其精確度可達0.01PH單位。缺點：電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質可能發生沉淀，樣品中的成分必需停留于其等電點，不適用于在等電點時發生沉淀或變性的蛋白質第80頁，課件共170頁，創作于2023年2月四、蛋白質聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳1、原理：雙向電泳是一種由任意兩個單向電泳組合而成的，在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進行第二向電泳的分離方法。經過電荷和質量兩次分離后，可以得到蛋白質分子的等電點和分子量信息。第81頁，課件共170頁，創作于2023年2月2、電泳方法：1）制樣抽提要確保將全部蛋白質都提出來。2）一般第一向IEF-AGE用超薄水平板，電泳結束后切取所需泳道用于第二向電泳，或在1mm內徑的毛細管中進行第一向IEF，取出膠條用于第二向電泳。第一向電泳的方法同IEF，只是制膠時要加入2%兩性電解質和6mol/L尿素。3）第二向電泳時，先將SDS-PAG灌在垂直玻璃板之間，上部留2cm左右空間，待聚合后，將第一向膠條轉移到第二向膠之上，用載玻片將膠條輕輕壓直，加3μL1%溴酚蘭指示劑，用1%的瓊脂糖(用電極緩沖液配制)密封膠條，瓊脂糖凝固后即可電泳。待溴酚蘭將至凝膠板下方邊緣時，停止電泳。第二向電泳時，用梯度混合器將凝膠制成7.5%-15%的濃度梯度，可以提高電泳的分辨率。4）染色脫色第82頁，課件共170頁，創作于2023年2月3、影響因素1）樣品處理需除盡鹽、色素、核酸、酚，蛋白質需全部提取出來。2）樣品越新鮮越好3）染料靈敏度4）蛋白質的含量、酸堿性、最大最小蛋白質的分離程度，對難溶蛋白的檢測。第83頁，課件共170頁，創作于2023年2月pH3pH10IEFSDS雙向電泳示意圖第84頁，課件共170頁，創作于2023年2月電泳目前，已有5000余種蛋白質分采用IEF/SDS得到很好的分離，其高分辨率是各種類型單向PAGE及其他雙向PAGE所無法比擬的。因此，IEF/SDS雙向電泳已成為當前分子生物學領域內常用的實驗技術，可廣泛用于生物大分子如蛋白質，核酸酶解片段及核糖體蛋白質的分離和精細分析，是蛋白質組學的基本方法。隨著該技術的不斷改進與發展，其應用范圍將更加廣泛。然而，此技術對某些堿性蛋白質的分離卻有其局限性，因在第一向IEF的電泳體系中，含有高濃度的尿素，它的存在會使堿性區的pH梯度變得很窄而且不穩定，可使堿性蛋白質難以進入凝膠中或者易泳出凝膠外。因此，對堿性蛋白質的分離分析應采用其他方法。第85頁，課件共170頁，創作于2023年2月蛋白質電泳檢測（染色）技術經醋酸纖維薄膜、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的各種生物分子需用染色法使其在支持物相應位置上顯示出譜帶，從而檢測其純度、含量及生物活性。蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、核酸及酶等均有不同的染色方法。蛋白質染色染色液種類繁多，各種染色液染色原理不同，靈敏度各異。使用時可根據需要加以選擇。常用的染色液有：氨基黑10B氨基黑10B是酸性染料。其磺酸基與蛋白質反應構成復合鹽，是最常用蛋白質染料之一，但對SDS-蛋白質染色效果不好。氨基黑10B染不同蛋白質時，著色度不等、色調不一，定量時誤差較大，需要對各種蛋白質作出本身的蛋白質-染料量(吸收值)的標準曲線，更有利于定量測定。第86頁，課件共170頁，創作于2023年2月蛋白質染色考馬斯亮藍R250（簡稱CBBR250）考馬斯亮藍R250的λmax=560-590nm。染色靈敏度比氨基黑高5倍。該染料是通過范氏作用與蛋白質結合，適用于SDS電泳微量蛋白質染色，但蛋白質濃度超過一定范圍時，染色不合科Beer定律，作定量分析時要注意這點。考馬斯亮藍G250（簡稱CBBG250）藍馬斯亮藍G250的λmax=590-610nm。染色靈敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。其優點是在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地使蛋白質染色而幾乎無本底色，所以常用于需要重復性和穩定性的染色，適于用定量分析。（兩種CBB染色法的缺點見本頁備注）固綠固綠的λmax=625nm，酸性染料。染色靈敏度不如CBB，近似于氨基黑，但卻可克服CBB在脫色時易溶解出來的缺點。第87頁，課件共170頁，創作于2023年2月蛋白質染色熒光染料丹磺酰氯：在堿性條件下與氨基酸、肽、蛋白質的末端氨基反應，使它們獲得熒光性質，在波長320nm或280nm的紫外燈下，觀察染色后的區帶或斑點。熒光胺：其作用與丹磺酰氯相似。由于自身及分解產物均不顯示熒光，因此染色后沒有熒光背景。只是由于引進了負電荷，會引起電泳遷移率的改變，但在SDS存在下這種電荷效應可忽略。近來，熒光胺常用于雙向電泳的蛋白染色。2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮(MDPF)：其作用與熒光胺類似，也是與末端氨基產生反應而產生熒光。1-苯胺基-8-萘磺酸：常用其鎂鹽，本身無色，但與蛋白質結合后，在紫外光下可見黃綠色熒光。銀染色法此法較CBBR250靈敏100倍，染色機制可能與攝影過程中Ag+的還原相似。第88頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15南京農業大學生命科學學院89第89頁，課件共170頁，創作于2023年2月2023/7/15南京農業大學生命科學學院90第90頁，課件共170頁，創作于2023年2月糖蛋白染色過碘酸-Schiff試劑阿爾山藍染色脂蛋白染色油紅O染色蘇丹黑B核酸的染色將凝膠先用三氯乙酸、甲酸-乙酸混合液、氯化高汞、乙酸、乙酸鑭等固定，或者將有關染料與上述溶液配在一起，同時固定與染色。有的染色液可同時染DNA及RNA，如stains-all、溴乙錠熒光染料等，也有RNA，DNA各自特殊的染色法。第91頁，課件共170頁，創作于2023年2月核酸的染色RNA染色法焦寧：其對RNA染色效果好，靈敏度高。脫色后凝膠本底顏色淺而RNA色帶穩定，抗光且不易褪色。此染料最適濃度為0.5%。低于0.5%則RNA色帶較淺；高于0.5%也并不能增加對RNA染色效果。甲苯胺藍O：其最適濃度為0.7%，染色效果較焦寧Y稍差些。次甲基藍：染色效果不如焦寧Y和甲苯胺藍O，檢出靈敏度較差，一般在5μg以上；染色后RNA條帶寬，且不穩定，時間長，易褪色。但次甲基藍易得到，溶解性能好，所以較常用。吖啶橙：染色效果不太理想，本底顏色深，不易脫掉，但能區別單鏈或雙鏈核酸(DNA，RNA)，對雙鏈核酸顯綠色熒光(530nm)，對單鏈核酸顯紅色熒光(640nm)。第92頁，課件共170頁，創作于2023年2月核酸的染色RNA染色法熒光染料溴乙錠（簡稱EB）：可用于觀察瓊脂糖電泳中的RNA、DNA帶。EB能插入核酸分子中堿基對之間，使DNA和RNA在紫外燈下顯示較強的熒光。如將已染色的凝膠浸泡在1mmol/LMgSO４溶液中1h，可以降低未結合的EB引起的背景熒光，對檢測極少量的DNA有利。EB染料具有下列優點：操作簡單，凝膠可用1-0.5μg/mL的EB染色，染色時間取決于凝膠濃度，低于1%瓊脂糖的凝膠、染15min即可。多余的EB不干擾在紫外燈下檢測熒光；染色后不會使核酸斷裂，因此可將染料直接加到核酸樣品中，以便隨時用紫外燈追蹤檢查；靈敏度高，對1ngRNA，DNA均可顯色。EB染料是一種強烈的誘變劑，操作時應注意防護，應戴上聚乙烯手套。第93頁，課件共170頁，創作于2023年2月核酸的染色DNA染色法除了EB染色最常用外，還有以下幾種方法。甲基綠：一般將0.25%甲基綠溶于0.2mol/LpH4.1的乙酯緩沖液中，用氯仿抽提至無紫色，將含DNA的凝膠浸入，室溫下染色1h即可顯色，此法適用于檢測天然DNA。Feulgen染色：用此法染色前，應將凝膠用1mol/LHCl固定，然后用Schiff試劑在室溫下染色，這是組織化學中鑒定DNA的方法。第94頁，課件共170頁，創作于2023年2月第二節光學檢測技術

基于物質光化學性質而建立起來的分析方法稱之為光化學分析法。分為:光譜分析法和非光譜分析法。光譜光度分析技術是利用化學物質具有的發射光、吸收光或散射光的光譜特征來分析其性質、結構和含量的方法，也叫分光光度技術。光的互補：藍黃第95頁，課件共170頁，創作于2023年2月一、紫外—可見光分光光度技術利用化學物質在紫外、可見光區的分子吸收光譜，對物質作定性、定量和結構分析的方法。物質的顏色來自物質對光的選擇性吸收。各種不同的物資都具有其各自的吸收光譜。第96頁，課件共170頁，創作于2023年2月當某單色光通過均勻溶液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質的濃度、入射光強度及溶液的厚度成正比，描述其關系的方程就是比色原理——郎伯-比耳定律。

T=I/I0，A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I。入射光強度為I0，透射光強度為I，T為透光度。透光度的負對數稱為吸光度。A=KLCA為吸光度；K為比例常數，稱為吸光系數；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度。第97頁，課件共170頁，創作于2023年2月二、分光光度計的結構原理最常用的是可見分光光度計和紫外-可見光分光光度計

光源單色器樣品吸收池檢測器信號指示系統五大部份結構：第98頁，課件共170頁，創作于2023年2月（一）光源光源定義：指一種可以發射出供溶液或吸收物質選擇性吸收的光。光源應在一定光譜區域內發射出連續光譜，并有足夠的強度和良好的穩定性，在整個光譜區域內光的強度不應隨波長有明顯的變化。光源種類：可見光分光光度計常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。

紫外光光度計常用氫燈作為光源。第99頁，課件共170頁，創作于2023年2月（二）單色器定義：將來自光源的復合光分散為單色光的裝置稱為分光系統或單色器。種類：濾光片棱鏡光柵第100頁，課件共170頁，創作于2023年2月（三）比色杯又稱為吸收池或比色皿材料：常用無色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成

（五）信號指示系統（四）檢測器檢測器是將透過溶液的光信號轉換為電信號，并將電信號放大的裝置。常用的檢測器為光電管和光電倍增管。是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的裝置。第101頁，課件共170頁，創作于2023年2月三、分光光度計的操作方法（一）分光光度計的基本操作以721-A型分光光度計為例，其基本的操作步驟為：1.開721-A分光光度計的開關，將比色池的蓋子打開，通電20分鐘使儀器預熱。2.將波長旋至測定的波長。3.將空白液、校準液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。4.將開關置于T位，打開比色池蓋子，用光量粗調和光量細調調節T為0.0,關上比色池蓋子，調節T為100.0。5.將開關置于A，用消光調零調節A為0.06.重復步驟4和57.將校準液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（A）第102頁，課件共170頁，創作于2023年2月721-A分光光度計第103頁，課件共170頁，創作于2023年2月（二）分光光度技術的定量方法1.標準曲線法根據Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內與吸光度成正比關系。配制一系列濃度的標準品溶液（濃度應包含高、中、低濃度范圍），按標本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標準液濃度為橫座標，以吸光度為縱座標，按最小二乘法的原理，將對應各點連成一條通過原點的直線，這條直線稱為標準曲線。待測溶液測定吸光度后，從標準曲線上可查出其相應的濃度。方法：第104頁，課件共170頁，創作于2023年2月制作和應用標準曲線時應注意下面幾點：（1）測定條件發生變化時（如更換標準品和試劑等），應重新繪制。（2）標準品應有高的純度，標準液的配制應準確。（3）當待測液吸光度超過線性范圍時，應將標本稀釋后再測定。（4）標本測定的條件應和標準曲線制作時的條件完全一致。第105頁，課件共170頁，創作于2023年2月2．標準對照法Cu=(Au×Cs)/As己知濃度的標準品和標本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標準管和標本的吸光度，根據測定的吸光度及標準品濃度，可直接計算出標本的濃度，計算公式為：其中Cu和Au為標本管濃度和吸光度，Cs和As分別為標準管濃度和吸光度。用標準品法定量時，標準品的濃度應盡量和標本管濃度相近。第106頁，課件共170頁，創作于2023年2月3．其它分析方法包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數分析等方法。第107頁，課件共170頁，創作于2023年2月4、影響因素1）儀器測量條件選擇適當波長和吸光度范圍。2）反應條件顯色產物在紫外-可見光區有最大吸光值，控制溫度、pH、離子、時間等條件。3）參比液的選擇消除試劑的吸光值。4）干擾物質現色劑、儀器及操作者等造成的誤差。第108頁，課件共170頁，創作于2023年2月二、熒光分光光度技術某些物質吸收了外界能量后，能發出不同波長和不同強度的光，一旦外界能源消失，則這種光也隨之消失，這種光稱為熒光。通過光照激發產生的熒光稱為光致熒光。照射停止后，熒光在10-9秒鐘內消失，超過此限度未消失的稱為磷光。據激發光波長不同，熒光可分為Ｘ射線熒光、紫外可見熒光和紅外熒光等。根據發射熒光的粒子不同，熒光又可分為分子熒光和原子熒光。第109頁，課件共170頁，創作于2023年2月熒光分析法（fluorescenceanalysis）就是利用物質的熒光特征和強度，對物質進行定性和定量分析的方法。熒光分析法的特點：靈敏度高、選擇性好、樣品用量少和操作簡便。它的靈敏度通常比分光光度法高2～3個數量級。（一）、原理由在通常狀況下處于基態的物質分子吸收激發光后變為激發態,這些處于激發態的分子是不穩定的，在返回基態的過程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產生熒光。第110頁，課件共170頁，創作于2023年2月熒光光度法NanoDrop?ND-3300Fluorospectrometer

第111頁，課件共170頁，創作于2023年2月第112頁，課件共170頁，創作于2023年2月（二）、儀器的構造不同的熒光計結構有所差異，但基本包括1、激發光源2、樣品池3、檢測器4、濾光器和單色器等結構。第113頁，課件共170頁，創作于2023年2月（三）、熒光分析的操作1.標準曲線法先配制一第列濃度由大到小的標準管C1，C2、C3、、、、、、C1為濃度最大的標準管作為起始濃度，置熒光計透光率為100，調節光柵使檢流計指零第114頁，課件共170頁，創作于2023年2月2.比較法先配一標準溶液，其濃度應略大于樣品溶液;濃度越接近，誤差越小以此標準溶液為準，調節透光率在20~60之間的某一數值上然后測定樣品溶液及空白溶液的透光率。第115頁，課件共170頁，創作于2023年2月由下式求得:C標準透光率為60C樣品的透光率為X空白溶液的透光率為Y第116頁，課件共170頁，創作于2023年2月（四）、熒光分析的影響因素與注意事項1.溫度熒光對溫度敏感。2.內濾光作用和自吸收現象有些試劑具有吸收激發光或熒光的作用，減弱熒光，即內濾光作用。第117頁，課件共170頁，創作于2023年2月3.pH的影響大多數熒光反應都受溶液酸堿度的影響，故熒光分析需在適合的酸堿度溶液中進行。最適當的酸堿度必須由實驗來確定。所用酸的種類也影響熒光的強度，例如，奎寧在硫酸溶液中的熒光較在鹽酸中的要強些。第118頁，課件共170頁，創作于2023年2月4.溶劑許多有機物及金屬的有機絡合物，在乙醇溶液中的熒光比在水溶液中強。乙醇、甘油、丙酮、氯仿及苯都是常用的溶劑。熒光分析所用的有機試劑，在有機溶劑中大多有熒光，應設法避免；一般避免的辦法是稀釋，或加入一部分水。第119頁，課件共170頁，創作于2023年2月5.散射光和拉曼光樣品溶劑在熒光物質產生熒光時，也吸能量產生散射光和拉曼光。6.熒光強度達到最高點所需要的時間不同有的反應加入試劑后熒光強度立即達到最高峰。有的反應需要經過15~30分鐘才能達到最高峰第120頁，課件共170頁，創作于2023年2月7.對易于光解的物質選擇合適的對照校正儀器的靈敏度。8.溶液中懸浮物對光散射需預先除去。9.溶液中的溶氧能淬滅熒光。10.來自器皿、試劑和制備保存過程的熒光污染。第121頁，課件共170頁，創作于2023年2月（一）火焰光度法（二）原子吸收分光光度法

1．基本原理2．組成1．基本原理2．組成3．原子吸收分光光度法的特點

三、其它光譜分析技術第122頁，課件共170頁，創作于2023年2月火焰光度法——等離子體發射光譜法第123頁，課件共170頁，創作于2023年2月原子吸收分光光度法第124頁，課件共170頁，創作于2023年2月第三節生物大分子定量測定蛋白質含量測定法，是生物化學研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。第125頁，課件共170頁，創作于2023年2月五種蛋白質測定方法比較如下：

方法靈敏度時間原理干擾物質說明凱氏定氮法（Kjedahl法）靈敏度低，適用于0.2~1.0mg氮，誤差為

2％費時

8～10小時將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質而分離）用于標準蛋白質含量的準確測定；干擾少；費時太長雙縮脲法（Biuret法）靈敏度低1～20mg中速

20~30分鐘多肽鍵＋堿性Cu2＋紫色絡合物硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯色相似紫外吸收法較為靈敏50～100g快速

5～10分鐘蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正Folin－酚試劑法（Lowry法）靈敏度高～5g慢速

40～60分鐘

雙縮脲反應；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化考馬斯亮藍法(Bradford法)靈敏度最高1～5g快速5～15分鐘考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時，其max由465nm變為595nm強堿性緩沖液；TritonX-100;SDS最好的方法；干擾物質少；顏色穩定；

顏色深淺隨不同蛋白質變化第126頁，課件共170頁，創作于2023年2月一、雙縮脲法測定蛋白質的濃度實驗原理

具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應。蛋白質在堿性溶液中可與CU2+形成紫色化合物，在一定濃度的范圍內，蛋白質濃度與生成的紫色化合物顏色的深淺成正比，可用比色法測定。第127頁，課件共170頁，創作于2023年2月尿素被加熱，則兩分子的尿素放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環境中，能與硫酸銅結合成紫色的化合物，此反應稱為雙縮脲反應。雙縮脲反應第128頁，課件共170頁，創作于2023年2月蛋白質分子中含有肽鍵與縮脲結構相似，故也能進行此反應。雙縮脲反應可作為蛋白質定量測定的依據。第129頁，課件共170頁，創作于2023年2月實驗試劑1、2mg/ml牛血清白蛋白液：將1g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀釋至1000ml.2、雙縮脲試劑：將1.75gCuSO4.5H2O溶于約150ml蒸餾水，然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml濃氨水、300ml冰冷的蒸餾水和200ml飽和氫氧化鈉溶液，搖勻，室溫放置2小時，再加蒸餾水至刻度，搖勻備用。第130頁，課件共170頁，創作于2023年2月實驗步驟1、標準曲線的繪制：取7支干燥的試管，按下表加入試劑：

將上述溶液混合后，試管中即有紫紅色出現，在540nm下測的各管的吸光度，以蛋白質濃度為橫坐標，OD值為縱坐標作出標準曲線。

2、

樣液的測定 取未知濃度的蛋白質溶液3.0ml置試管中，加入雙縮脲試劑2.0ml，混勻，測其540nm的吸光度，對照標準曲線求得未知液蛋白質濃度。第131頁，課件共170頁，創作于2023年2月生化自動分析儀第132頁，課件共170頁，創作于2023年2月二、核酸的測定在核酸研究（提取、純化核酸），提蛋白質等其它有機分子時，常要測定核酸含量，判斷方法的優劣和產品的質量。常用的方法有：1、電泳法

Agarose，PAGE等。判斷純度，分子大小。有標準品存在時，也可以定量測定。第133頁，課件共170頁，創作于2023年2月核酸定量測定常見的方法2.定磷法：將核酸消化，測定其無機磷量，由此計算出核酸含量，反應靈敏。3.紫外吸收法：利用核酸在260nm處有吸收高峰，操作簡便，受蛋白質和核苷酸的干擾影響。4.地衣酚法：用于測定RNA的含量，RNA與濃鹽酸共熱，降解形成的核糖轉變為糠醛，利用地衣酚反應來測定，特異性差，戊糖均有此反應。5.二苯胺法：DNA中的脫氧核糖在酸性溶液中轉化為ω-羥-γ-酮基戊醛，利用二苯胺試劑反應，除脫氧木糖和阿拉伯糖外其他糖類無此反應。第134頁，課件共170頁，創作于2023年2月定磷法的原理首先將核酸樣品用硫酸消化成無機磷，利用定磷試劑測定無機磷量。反應式為：

(NH4)MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O

H3P(Mo3O10)4Mo2O3?

MoO3（鉬藍）Vit?C第135頁，課件共170頁，創作于2023年2月

還原產物鉬藍在波長660nm測定吸光值，當無機磷含量在1-25μg范圍內，光吸收和含磷量成正比。RNA的含磷量為9.5%，即1μgRNA磷相當于10.5μgRNA。DNA的含磷量平均為9.9%。第136頁，課件共170頁，創作于2023年2月試劑酵母RNA樣品溶液：2000μg/mL標準磷原液：含磷量為1000μg/mL標準磷溶液：含磷量為10μg/mL，每組用干試管取15mL定磷試劑：含硫酸、鉬酸銨、Vit.C，淺黃色，如果變綠則不能使用,每組用100mL燒杯取70mL第137頁，課件共170頁，創作于2023年2月實驗步驟1.核酸樣品用硫酸消化，將有機磷轉化成無機磷；2.制定定磷標準曲線；3.測定回收率和樣品總磷量。第138頁，課件共170頁，創作于2023年2月1.樣品消化（每兩組或三組做一份）消化管123RNA/mL010標準磷原液/mL001dH2O/mL1005mol/LH2SO4/mL222消煮爐中消化2-6h至溶液無色透明，冷卻dH2O/mL111沸水浴中加熱10min（分解焦磷酸），冷卻用dH2O定容/mL505050混勻第139頁，課件共170頁，創作于2023年2月2.定磷標準曲線的制定（每人做一份）

每人取18支試管，按照下表平行操作：

1

234

5

6標準磷溶液/mL00.10.20.30.40.5dH2O/mL1.51.41.31.21.11.0定磷試劑/mL1.51.51.51.51.51.5用漩渦混合器混勻，45℃恒溫水浴保溫25分鐘用去離子水作為空白，660nm測定吸光值A660(1)A660(2)A660平均值A660平均值—空白0第140頁，課件共170頁，創作于2023年2月

3.測定總磷量和回收率（與2同時進行）7（空白）

8（樣品）9（標準）定容溶液/mL1.51.50.15dH2O/mL001.35定磷試劑/mL1.51.51.5用漩渦混合器混勻，45℃恒溫水浴保溫25分鐘