實驗七-1細胞熒光染色觀察(guānchá)與熒光顯微鏡的使用（示范：細胞形態觀察與暗視野顯微鏡的使用）第一頁，共三十一頁。精選ppt實驗(shíyàn)目的與教學要求掌握熒光(yíngguāng)顯微鏡的成像基本原理及其使用；掌握暗視野顯微鏡的成像基本原理及其使用。第二頁，共三十一頁。精選ppt熒光顯微鏡是一種較為常用的的光學顯微鏡，其基本原理是利用一定波長的激發光對樣品進行激發，使之產生一定波長的熒光，從而用于對樣品結構或其組分進行定性(dìngxìng)、定位、定量觀察檢測。一、熒光(yíngguāng)顯微鏡的成像原理第三頁，共三十一頁。精選ppt什么(shénme)是熒光?物質中的電子吸收光的能量(néngliàng)由低能狀態轉變為高能狀態，再回到低能狀態時釋放出的光。即：物質吸收短波光，發射出的長波光。第四頁，共三十一頁。精選ppt保持固有的熒光(yíngguāng)特性熒光波長＞激發波長熒光強度極小于激發光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發光強度、被檢物濃度、熒光效率熒光(yíngguāng)的性質第五頁，共三十一頁。精選ppt優點：檢出能力高對細胞的刺激小能進行多重染色用途：物體構造的觀察熒光的有無、色調比較進行物質判別發熒光量的測定(cèdìng)對物質定性、定量分析熒光(yíngguāng)顯微鏡的優點和用途第六頁，共三十一頁。精選ppt第七頁，共三十一頁。精選ppt熒光(yíngguāng)素的特性第八頁，共三十一頁。精選ppt對細胞結構或組分的定性、定位、半定量研究。作為生物大分子篩選(shāixuǎn)與鑒定的標記物。熒光(yíngguāng)顯微鏡技術在生命科學研究中的應用第九頁，共三十一頁。精選ppt第十頁，共三十一頁。精選ppt二、暗視野顯微鏡的成像原理(yuánlǐ)通過特殊的暗視野聚光器，使照明光線改變途徑，不直接進入物鏡，而是傾斜地照射到樣品(yàngpǐn)上，由樣品(yàngpǐn)表面的繞射光線入射到物鏡內，產生樣品(yàngpǐn)的衍射圖象。第十一頁，共三十一頁。精選ppt三、試劑(shìjì)與器材青蛙、洋蔥、人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片（HE染色）甲醇、1‰丫啶橙、濾紙(lǜzhǐ)、吸管、載玻片熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡、普通光學顯微鏡第十二頁，共三十一頁。精選ppt四、實驗(shíyàn)內容和實驗(shíyàn)步驟蛙血細胞染色觀察：取少許蛙血→常規血涂片→涼干→甲醇固定10min→1‰丫啶橙染色5min→水洗→室溫干燥（濾紙擦干玻片底面）→熒光顯微鏡觀察（先低倍后高倍觀察）（可在同一玻片上觀察未熒光染色的血細胞）取洋蔥→撕取一小片內表皮→平面(píngmiàn)單層鋪展于玻片上→室溫涼干→1‰丫啶橙染色5min→水洗（用吸管，小心掉片）→室溫干燥（或用濾紙擦干）→熒光顯微鏡觀察暗視野顯微鏡觀察蛙血細胞（示范）觀察人正常肝組織切片和脂肪肝組織切片（HE染色）第十三頁，共三十一頁。精選ppt熒光顯微鏡要在光線盡量暗的環境下觀察(guānchá)。使用熒光顯微鏡時要注意不要直接觀察激發光源，保護眼睛。暗視野顯微鏡要在光線盡量暗的環境下觀察。五、注意事項第十四頁，共三十一頁。精選ppt六、作業與思考題：描述在熒光顯微鏡下所觀察到的實驗現象(xiànxiàng)。繪圖比較人正常肝組織細胞和脂肪肝組織細胞。第十五頁，共三十一頁。精選ppt實驗七-2激光掃描共聚焦(jùjiāo)顯微鏡在生命科學中的應用

第十六頁，共三十一頁。精選ppt實驗目的(mùdì)與要求1.掌握激光掃描共聚焦(jùjiāo)顯微鏡的成像基本原理及其在生命科學中的應用。第十七頁，共三十一頁。精選pptLaserScanningConfocalMicroscope第十八頁，共三十一頁。精選ppt普通熒光顯微鏡的不足使用熒光物質標記細胞中的特定成分或結構，不僅圖像與對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61λ/NA）。但當所觀察的熒光標本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自(láizì)焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自(láizì)焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結構模糊、發虛，原因是大多數生物學標本是層次區別的重疊結構）。一、激光掃描(sǎomiáo)共聚焦顯微鏡的成像基本原理第十九頁，共三十一頁。精選ppt2.共聚焦掃描顯微鏡的成像原理采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為(chēnɡwéi)照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。第二十頁，共三十一頁。精選pptConfocalPrinciple第二十一頁，共三十一頁。精選ppt第二十二頁，共三十一頁。精選ppt每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫短面總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結合，通過累加連續層次的二維圖像，經過(jīngguò)專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。第二十三頁，共三十一頁。精選ppt觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光、近紅外）照明方式：點照明、逐點掃描成像方式：共聚焦、逐點成像輸出：實時觀測(guāncè),數字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析多重染色樣品的觀察LSCM的基本(jīběn)特點第二十四頁，共三十一頁。精選ppt3.共聚焦掃描顯微鏡在生命科學研究中的應用細胞結構、蛋白質（如受體、抗原、抗體、酶、細胞骨架蛋白等基因表達產物）、DNA、RNA等細胞膜流動性（熒光光漂白恢復技術）細胞內氧自由基活性細胞內鈣離子濃度(nóngdù)變化膜電位第二十五頁，共三十一頁。精選ppt第二十六頁，共三十一頁。精選ppt三、試劑(shìjì)與器材青蛙冷丙酮、DAPI、甘油/PBS封片劑(piànjì)、濾紙、吸管、載玻片、蓋玻片激光掃描共聚焦顯微鏡第二十七頁，共三十一頁。精選ppt四、實驗步驟取涂有細胞(xìbāo)的載玻片（細胞(xìbāo)涂在中間），冷丙酮40C固定10min;PBS漂洗2次，每次3min;滴加DAPI溶液100ul室溫孵育30min;PBS漂洗3次，每次5min;滴一小滴甘油/PBS封片劑(pH8.5，PBS:甘油=1:9，v/v)封片;激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。第二十八頁，共三十一頁。精選ppt五、注意事項注意染色時間(shíjiān)注意避光第二十九頁，共三十一頁。精選ppt六、作業與思考題：試述激光掃描共聚焦顯微鏡成像基本原理，并描述實驗中所觀察的現象思考題：激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到的圖象(túxiànɡ)為什么比普通的熒光顯微鏡的清晰度、層次感要強許多？第三十頁，共三十一頁。精選ppt內容(nèiróng)總結實驗七-1。物質中的電子吸收光的能量由低