實時熒光定量PCR原理和實驗

.我們都知道理論上PCR是一個指數增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線并不是標準的指數曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環的增多，擴增規模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進入了平臺期。由于各種環境因素的復雜相互作用，不同的PCR反應體系進入平臺期的時機和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重復實驗，各種條件基本一致,最后得到的DNA拷貝數也是完全不一樣的，波動很大。為什么終點定量不準確？

.為什么不選普通PCR?對于絕大多數實驗，比如甲肝的診斷、藥物療效的監測等,需要測定的都是PCR放大之前標本中的DNA原始拷貝數,經過PCR擴增以后的DNA拷貝數已經不能反映真實情況。在這種情況下，就不能采用終點定量，而要根據CT值確定DNA起始拷貝的數量。傳統的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素摻入標記后的光密度掃描等，測定的都是PCR的終產物，而不是起始DNA拷貝數。由于PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。.熒光定量PCR的優勢在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質,隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。該技術借助于熒光信號來檢測PCR產物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線，準確地確定CT值，從而根據CT值確定起始DNA拷貝數，做到了真正意義上的DNA定量。.CT值與模板DNA的關系

一般地，我們有Rn=RB+XO(1+EX)nRS,也就是說第n次PCR循環時的熒光信號強度(Rn)等于背景信號強度(RB)加上每個分子的熒光強度(即單位熒光強度，RS)與分子數目的乘積。當循環次數n=CT時，則有RT=RB+XO(1+EX)CTRS。兩邊取對數，得log(RT-RB)=logX0

+CTlog(1+Ex)+logRs。整理此式，CTlog(1+Ex)=-logX0

+log(RT-RB)–logRs。

Ct=-klgX0+b.CT值的確定

基線:在PCR的最初幾個循環中，熒光信號是幾乎不變的，這確定了擴增圖中的基線。基線范圍的定義是從第3個循環起到CT值前3個循環止，一般取第3到第15個循環之間。在這些初始的循環中，我們看到的其實是反應的熒光背景。

Rn（Normalizedreporter）:是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。

△Rn:是Rn扣除基線后得到的標準化結果（△Rn=Rn–基線）。

閾值:

用于確定實時定量分析中的CT值的某個△Rn水平。一般將PCR反應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環熒光信號標準差的10倍，這個水平設定得比基線高，又在擴增曲線的指數增長區域內足夠低。

閾值循環（CT）：熒光穿過閾值時的循環數,即閾值與擴增曲線的交叉點。

.顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質量，CT值是一個完全客觀的參數。CT值越小，模板DNA的起始拷貝數越多；CT值越大，模板DNA的起始拷貝數越少。正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數據的精度。.實驗方案的設計根據最終得到的數據不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量兩種。典型的相對定量如比較經過不同方式處理的兩個樣本中基因表達水平的高低變化，得到的結果是百分比；絕對定量則需要使用標準曲線確定樣本中基因的拷貝數或濃度。根據所使用的技術不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBRGreenI熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術在原理上更為嚴格，所得數據更為精確；熒光染料技術則成本更為低廉，實驗設計更為簡便。在選擇實驗方案時要根據實驗目的和對數據精度的要求來決定。.

TaqMan探針技術原理

TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。由于探針與模板是特異性結合，所以熒光信號的強弱就代表了模板的數量。在TaqMan探針法的定量PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3′→5′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。所以，每經過一個PCR循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程。信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。.

TaqMan探針根據其3′端標記的熒光淬滅基團的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqManMGB探針。MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團(Non-FluorescentQuencher)，本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB(MinorGrooveBinder)修飾基團可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設計。實驗證明，TaqManMGB探針對于富含A/T的模板可以區分得更為理想。TaqManMGB探針

.SYBRGreenI熒光染料技術原理

SYBRGreenI熒光染料技術原理SYBRGreenI是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料（圖6）。當它與DNA雙鏈結合時，發出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBRGreen熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應，當SYBRGreen染料與DNA雙鏈結合時發出熒光。2、DNA變性時，SYBRGreen染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料與雙鏈產物結合，定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。.數據的校正定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統計學要求并對數據進行嚴格的校正，以消除偶然誤差。因此重復實驗和設立內對照非常重要。由于各種各樣的客觀原因，這一點在實踐中往往被輕視或忽視，需要著重強調。當然，與定性實驗一樣，定量PCR也要設立陰性和陽性對照，以監控試劑和實驗操作方面可能出現的問題。.重復實驗和陰性對照

定量實驗，誤差是不可避免的。設立重復實驗，對數據進行統計處理，可以將誤差降低到最小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復3次以上，嚴格的定量更應當重復6～8次，以滿足小樣本統計的要求。

陰性對照中不加模板DNA，而以水或緩沖液代替，用于檢驗是否存在PCR污染。.實時熒光定量RT—PCR內參基因的選擇

由于內參基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數是恒定的，受環境因素影響較小，其定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組的數量。內參基因擴增中的變化可以反映RNA產量、質量和／或cDNA合成效率的變化。選擇適當的內參基因以減少檢測標本間的差異是必須的。內參基因一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。核酸提取時通常以重量或體積為單位取樣，再加上提取效率和操作誤差，造成等量提取物不一定來源于等量細胞（或基因組）。將定量結果校正為以細胞（或基因組）為單位，不同樣品之間才具有可比性。.2003年10月：喬布斯被檢查出胰腺癌。2004年，喬布斯接受了腫瘤切除手術。實時熒光定量PCR實驗—ΔΔCT法

蘋果前CEO史蒂夫·喬布斯逝世。讓我們一起悼念這位“改變世界的天才”！.用什么方法來檢測?藥物對腫瘤細胞的影響:檢測相關基因的表達是否發生了變化(EGR3、MAOB、OGDH、OSGEP、SERPING1）

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RNAcDNA擴增產物細胞裂解逆轉錄反應定量PCR反應untreatedtreated

RNAcDNA擴增產物細胞裂解逆轉錄反應定量PCR反應基因表達(geneexpression)是指細胞在生命過程中，把儲存在DNA順序中遺傳信息經過轉錄和翻譯，轉變成具有生物活性的蛋白質分子GeneRNA蛋白質

轉錄翻譯(cDNA)對擴增產物進行定量，擴增產物的變化體現了RNA的變化逆轉錄.實驗方案的設計定量PCR絕對定量相對定量相對標準曲線??CT.??CT實驗的設計目的基因、內參基因、參照樣本、重復反應孔

??CT實驗的設計選擇PCR方法選擇化學方法：選擇RT方法選擇探針和引物TaqMan或SYBRGreenIdye指明??CT實驗中組成部分:.DesigntheComparativeCTExperimentPreparetheReactions.

Preparethereactionplate.AnalyzetheComparativeCTExperiment

.RuntheExperimentPreparethetemplatePreparethesampledilutionsPreparethereactionmixforeachtargetassayPreparefortherunEnablethenotificationsettingsStarttherunMonitortherunUnloadtheinstrumentViewtheGeneExpressionPlotandWellViewtheAmplificationPublishtheData

theComparativeCTExperimentworkflow

.RT反應的操作RT反應提取RNA將提取的總RNA轉化為cDNA:反轉錄試劑盒試劑盒提取RNARNA的濃度:A260/A280在1.9左右總RNA的質量RNA的完整性:瓊脂糖凝膠電泳總RNA初始濃度的調節:50ng/μL.0h12h24h48hRNARNARNARNA.ComponentμL/ReactionμL/21Reactionsa10?ReverseTranscriptionBuffer1021025?dNTPs48410?randomprimers10210MultiScribe?ReverseTranscriptase,50U/μL5105Nuclease-freewater21441Totalperreaction5010501.準備RTmastermix

2.RT反應體系50μLoftheRTmastermix30μLofnuclease-freewater20μLofRNAsampleStepTypeTimeTemperatureHOLD10min25°CHOLD120min37°CHOLD5sec85°C

3.Programthethermalcycler.樣品的稀釋SampleNameStockConcentration(ng/μL)SampleVolume(μL)DiluentVolume(μL)TotalVolumeofDilutedSample(μL)0h100.066.066.0132.012h100.066.066.0132.024h100.066.066.0132.048h100.066.066.0132.0Thestocksampleconcentrationis100ng/μL.AfterdilutingthesampleaccordingtotheSampleDilutionsCalculationstable,thesamplehasaconcentrationof50ng/μL.Adding5μLatthisconcentrationtothefinalreactionmixvolumeof50μLyieldsa1?concentrationinthefinalreaction..配制PCR反應mixComponentVolume(μL)for1ReactionMasterMix(2.0?)25.0AssayMix(20.0?)2.50Water17.50TotalVolume45.0

Thereactionmixcomponentsare:–TaqMan?UniversalPCRMasterMix(2?)–18SAssayMix(20?)–EGR3AssayMix(20?)–MAOBAssayMix(20?)–OGDHAssayMix(20?)–OSGEPAssayMix(20?)–SERPING1AssayMix(20?)–Water反應成分反應成分的體積計算.Forthe18Sassay,addtherequiredcomponentstothe18SReactionMixtube:ComponentVolume(μL)for1ReactionVolume(μL)for16Reaction)TaqMan?UniversalPCRMasterMix(2?)25.0440.018SAssayMix(20?)2.544.0Water17.5308.0TotalReactionMixVolume45.0792.0TubeReactionMixReactionMixVolume(μL)SampleSampleVolume(μL)118SReactionMix198.00h22.0218SReactionMix198.012h22.0318SReactionMix198.024h22.0418SReactionMix198.048h22.0(Plus10%Excess)..ViewtheGeneExpressionPlotandWel