DBFORMTEXT??DB11/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT食品平安地方標準動物性食品中2-受體沖動劑殘留檢測液相色譜-串聯質譜法FORMTEXTFORMTEXT〔征求意見稿〕FORMTEXTFORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施FORMTEXT北京市衛生和方案生育委員會???發布前??言本標準為首次發布。主要起草單位：北京市疾病預防控制中心。主要起草人：范賽、趙榕、吳國華、張楠、劉平、劉偉、李麗萍、柳靜、趙海燕、趙旭東、陳忠輝等。食品平安地方標準動物性食品中2-受體沖動劑殘留檢測液相色譜-串聯質譜法范圍本標準規定了6種2-受體沖動劑的液相色譜串聯質譜的檢測方法。本標準適用于豬牛羊肉制品中6種2-受體沖動劑的測定。原理動物性食品樣品經酶解提取后，經MCX柱凈化，濃縮復溶后經液相色譜/串聯質譜儀測定，結合內標法峰面積定量。試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。3.1試劑甲醇〔CH3OH，色譜純〕。乙酸〔CH3COOH，色譜純〕。氨水〔NH3·H2O，優級純，濃度25％～28％〕。甲酸甲酸(HCOOH，色譜純，99%)。乙酸鈉〔NaAc·4H2O，色譜純〕。鹽酸〔HCl，分析純〕。3.1.7β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶〔β-Glucuronidase/Arylsulfatase，100000unit/mL〕。3.1.8混合型陽離子交換固相萃取小柱(500mg,6mL,WatersCo.)〔或其他公司等效柱〕。3.2試劑配制3.2.10.1％甲酸水溶液：量取1mL甲酸，用純水定容至1000mL。3.2.23%甲醇氨溶液：量取3mL氨水，用甲醇定容至100mL。3.2.3乙酸-乙酸鈉緩沖溶液〔pH5.2〕：稱取43.0gNaAC·4H2O，參加25mL乙酸，用水溶解并定容到1000mL，用乙酸調節pH到5.2。3.2.41%鹽酸甲醇：量取鹽酸1mL,用甲醇定容至100mL。3.3標準品3.3.12-受體沖動劑標準標準品：可樂定〔Clonidine〕、賽庚啶〔Cyproheptadine〕、溴莫尼定〔Brimonidine〕、替扎尼定〔Tizanidine〕、胍法辛〔Guanfacine〕、胍那芐〔Guanabcnz〕。以上各標準品的純度均大于90.0%，購自sigma公司。3.3.22-受體沖動劑內標同位素內標標準：D4-可樂定〔D4-Clonidine〕、D4-溴莫尼定〔D4-Brimonidine〕、D4-替扎尼定〔D4-Tizanidine〕、C13-N15-胍法辛〔C13-N15-Guanfacine〕。以上標準品均購自TRC公司3.4標準溶液配制3.4.1標準儲藏溶液：精確稱取3.3的標準品各0.0100g，分別用甲醇溶解并定容至10mL，濃度為1000mg/L，-18℃冰箱中保存，有效期24個月。對于同位素標準品，直接用1mL甲醇溶解，制成10mg/L的標準溶液，有效期24中間標準工作液：根據需要，用甲醇將標準儲藏溶液〔〕配制為適當濃度的標中間準工作液。標準工作液應使用前配制。儀器和設備4.1高效液相色譜-串聯質譜儀。4.2色譜柱：DIKMALeapsilC18色譜柱〔2.7μm，2.1*100mm〕。4.3電子天平：感量0.001g。4.4組織勻漿機。4.5漩渦混合器。4.6冷凍離心機〔最大轉速高于10000r/min〕。4.7酸度計〔0.01〕。4.8氮吹儀。4.9固相萃取裝置。4.10超聲清洗儀。分析步驟5.1試樣制備5.1.1樣品制備制樣操作過程中必須防止樣品污染或殘留物發生變化。動物肌肉、肝臟、腎臟從所取全部樣品中取出有代表性樣品約500g，剔除筋膜，用組織搗碎機充分搗碎均勻，裝入潔凈容器中，密封，并標明標記，于-18°C以下冷凍存放。5.1.2樣品提取及酸解精確稱取勻漿的動物肌肉〔肝臟或腎臟〕樣品約5.0g，參加濃度為100g/L的氘代同位素標準溶液20μL，參加醋酸－醋酸鈉緩沖溶液〔pH=5.2〕5mL，參加5μL的β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混均，37℃水解過夜，冷卻至室溫；參加1%鹽酸甲醇20mL，渦旋混均后超聲提取30min，以12000轉4℃離心10min。沉淀參加2mL純水，8mL1%鹽酸甲醇，渦旋混均，重復提取一次。合并提取液，以12000轉0℃離心10min5.1.3凈化WatersOasisMCX柱依次用6mL甲醇、6mL水活化后，將提取液上MCX柱，棄去流出液，依次用3mL純水、3mL1%鹽酸甲醇淋洗，抽真空使柱中的甲醇全部流出，用1mL正己烷淋洗柱子，抽真空使柱中的溶液全部流出，用3mL甲醇淋洗。用5mL含3%濃氨水的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，將洗脫液置于N2-濃縮儀上濃縮至近干，用1mL甲醇復溶，10000rpm于0℃離心5min，再用1.0mL甲醇洗滌沉淀，再次離心，合并上清液，氮吹濃縮至干，以流動相復溶，將此溶液過0.22μm的有機濾膜待進行LC-MS5.2儀器參考條件5.2.1液相色譜條件流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，參考梯度洗脫條件見表1，流速：350μL/min，柱溫：30℃，進樣量：5μL表1液相色譜參考梯度條件時間〔min〕0.1％甲酸-水溶液〔％〕甲醇〔％〕0.09552.585154.050508.001008.501009.095510.09555.2.2質譜參考條件采用ESI正離子掃描模式〔MRM〕，毛細管電壓：3.5kV；錐孔電壓：35V；源溫度：100℃；脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流量：700L/h；電子倍增電壓：650V；噴撞室壓力：其它參考質譜條件見表2。表2質譜主要質譜參數〔WatersXevoTQ-S〕1化合物名稱母離子錐孔電壓子離子碰撞能量Clonidine229.82443.922212.824Guanabcnz231.92543.922214.920Clonidine-D4233.9234822216.924Tizanidine253.82643.92068.822Tizanidine-D4257.92248226324Brimonidine291.82421226248.926Brimonidine-D4295.92321626248.926Guanfacine245.93659.914158.826Guanfacine-C13-N15249.81263.814158.826Cyproheptadine288299624190.9281：*為定量離子，所有質譜參數均在WatersXevoTQ-S上完成，采用離子阱質譜采集時，子離子碎片或碰撞能量有可能出現差異，以各自儀器為準。5.3基質匹配的標準工作曲線的制備空白基質溶液的制備：稱取與試樣基質相應的陰性樣品5.0g，與試樣同時進行提取、凈化和復溶得到。準確吸取1mg/L的混合標準使用液，用初始流動相配比溶液復溶的空白基質溶液制成0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μg/L的標準系列溶液。以系列標準溶液中分析物的濃度〔μg/L〕與對應的氘代同位素內標的峰面積比值繪制校正曲線，按內標法計算試樣中2-受體沖動劑的含量。5.4試樣溶液的測定將試樣溶液注入液相色譜串聯質譜儀中，得到峰面積，根據標準曲線得到待測液中beta-受體沖動劑的濃度，平行測定次數不少于兩次。分析結果的表述按下式計算殘留量〔μg/kg〕：……………..…………〔1〕式中：X——樣品中待測組分的含量，單位微克每千克，μg/kg；C——測定液中待測組分的濃度，單位納克每毫升，ng/mL；V——定容體積，單位毫升，mL；M——樣品稱樣量，單位克，g。注：計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保存兩位有效數字。精密度在分析實際試樣前，實驗室必須到達可接受的精密度和準確度水平。通過對加標試樣的分析，驗證分析方法的可靠性。取不少于3份基質與實際試樣相似的空白樣品，分別參加標準溶液。將制備好的加標試樣按上述方法進行分析，各目標化合物的回收率應在75-125%范圍內，相對標準偏差〔RSD〕小于20%。在進行實際試樣分析之前，必須到達上述標準。當試樣的提取、凈化方法進行了修改以及更換分析操作人員后，必須重復上述試驗并直至到達上述標準。實驗室每6個月應進行上述試驗，并直至到達上述標準。如果可以獲得與試樣具有相似基質的標準參考物，那么可以用標準參考物代替加標試樣進行精密度和準確度試驗。其他8.1方法空白每個批次最多15個樣品，需做一次方法空白試驗。8.2質控樣品每個批次最多15個樣品，需帶一個質控樣品。質控樣品可以是標準參考物也可以是濃度的加標樣品。目標化合物的測定值根據加標濃度應在標準值的75%～125%范圍之內。8.3質譜儀的質量數校正每周用校正液進行一次質譜儀的質量校正，確保監測離子的質量數不發生改變。8.4定性每種化合物的質譜定性離子必須出現，至少應包括一個母離子和一個子離子，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當的標準溶液相比，其允許偏差不超過表3規定的范圍。表3定性時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度＞50%＞20%至50%＞10%至20%≤10%允許相對偏差±20%±25%±30%±50%8.5方法檢出限與定量限試樣中目標化合物色譜峰的保存時間與相應標準色譜峰的保存時間一致，變化范圍應在±2.5%之內。待測化合物的定性離子的重構離子色譜峰的信噪比應大于等于3〔S/N≥3〕，定量離子的重構離子色譜峰的信噪比應大于等于10〔S/N≥10〕。所得的方法檢出限與定量限見表4。表4方法的檢出限和定量限〔μg/kg〕化合物豬肉豬肝豬腎檢出限定量限檢出限定量限檢出限定量限Clonidine0.0600.2000.1500.5000.1500.500Guanabcnz0.0600.2000.1500.5000.1500.500Tizanidine0.0600.2000.1500.5000.1500.500Brimonidine0.0600.2000.1500.5000.1500.500Guanfacine0.1000.3000.3001.0000.3001.000Cyproheptadine0.0600.2000.1500.5000.1500.500附錄A〔資料性附錄〕2-受體沖動劑化合物詳細信息2-受體沖動劑化合物詳細信息。表A.12-受體沖動劑信息編號中文名稱英文名稱CAS號分子量分子式結構式1鹽酸可樂定Clonidinehydrochloride4205-90-7266.55C9H10Cl3N32鹽酸賽庚啶Cyproheptadinehydrochloride41354-29-4323.86C21H22ClN