實(shí)驗(yàn)1果蠅遺傳性狀的觀察及飼養(yǎng) 果蠅是在世界各地常見的昆蟲,屬于昆蟲綱,雙翅目,果蠅科,果蠅屬。果蠅屬(Drosophila)有3000多種,我國(guó)已發(fā)現(xiàn)800多種,遺傳學(xué)研究中通常用的是黑腹果蠅(D.melanogaster)。作為遺傳學(xué)研究的材料,果蠅具有非常突出的優(yōu)點(diǎn)。它形體小,生長(zhǎng)迅速,繁殖率高,飼養(yǎng)方便;世代周期短(約12d即可繁殖一代);突變性狀多;染色體數(shù)目少,基因組小;實(shí)驗(yàn)處理十分方便,容易重復(fù)實(shí)驗(yàn),便于觀察和分析。果蠅的遺傳學(xué)研究廣泛而深入,尤其在基因分離、連鎖、互換等方面十分突出,為遺傳學(xué)的發(fā)展作出了突出的貢獻(xiàn)。目前果蠅仍然是遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等研究中常用的模式動(dòng)物。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握果蠅的基本特征及鑒別雌、雄果蠅的方法,熟悉常見突變型。2.了解果蠅生活周期特征及各階段的形態(tài)變化。3．學(xué)會(huì)果蠅的飼料制備，為以后實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。二、實(shí)驗(yàn)材料野生型和幾種常見的突變型黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)。三、儀器設(shè)備與藥品試劑雙筒立體解剖鏡,培養(yǎng)瓶(粗平底試管或牛奶瓶)及麻醉瓶(與培養(yǎng)瓶一致的空瓶),白瓷板,毛筆。恒溫箱、培養(yǎng)瓶、棉花、紗布、剪刀、麻醉瓶、干燥箱、滅菌鍋、白瓷板、鋁鍋、電爐、玻璃棒、200毫升量筒、1000毫升和250毫升燒杯、酒精燈、鑷子、角匙、毛筆、濾紙。丙酸(或乳酸)、乙醚、煤油、75％酒精、瓊脂、蔗糖、米粉、麩皮、酵母粉(片)四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟(一)生活周期的觀察果蠅是完全變態(tài)昆蟲,其完整的生活周期可分為4個(gè)明顯的時(shí)期,即卵、幼蟲、蛹和成蟲(圖1-1)。用放大鏡從培養(yǎng)瓶外即可觀察到這四個(gè)時(shí)期,也可取出用立體解剖鏡仔細(xì)觀察。果蠅的生活史果蠅的生活史表1-1生活周期長(zhǎng)短與飼養(yǎng)溫度的關(guān)系溫度10℃15℃20℃25℃卵→幼蟲8天5天幼蟲→成蟲57天18天6天4天果蠅的生活周期長(zhǎng)短與溫度關(guān)系很密切,低溫使生活周期延長(zhǎng),生活力減低,高于30℃使果蠅不育甚至死亡。果蠅培養(yǎng)的最適溫度為20～25℃,25℃培養(yǎng)條件下果蠅從受精卵到成蟲約10d,其中卵和幼蟲期5d,蛹4d。成蟲果蠅在25℃時(shí)約成活15d。卵:受精卵白色,橢圓形,腹面稍扁平,長(zhǎng)約0.5mm,在前端背面伸出一觸絲,它能使卵附著在食物上。幼蟲:受精卵經(jīng)24h就可孵化成幼蟲,幼蟲經(jīng)兩次蛻皮到第三齡期體長(zhǎng)可達(dá)4～5mm。肉眼觀察可見幼蟲一端稍尖為頭部,上有一黑色鉤狀口器。蛹:幼蟲4d左右即開始化蛹。化蛹前三齡幼蟲停止攝食,爬到相對(duì)干燥的表面(如培養(yǎng)瓶壁),漸次形成一個(gè)菱形的蛹,起初顏色淡黃、柔軟,以后逐漸硬化變成深褐色,此時(shí)即將羽化。成蟲:剛從蛹?xì)ぶ杏鸹鰜淼墓?蟲體較肥大,翅還未展開,體表也未完全幾丁質(zhì)化,所以呈半透明的乳白色。透過腹部體壁還可以觀察到消化道和性腺。約1h后蠅體即變?yōu)榇侄虣E圓形,雙翅伸展,體色加深,如野生型果蠅初為淺灰,后變成灰褐色。成蟲果蠅自羽化后8h即可交配。雄果蠅的精子可貯存于雌果蠅的受精囊,以后逐漸釋放到輸卵管。雌蠅2d后即開始產(chǎn)卵。最初幾天每天可產(chǎn)50～70個(gè),隨后逐漸減少。(二)果蠅的形態(tài)特征和常見的突變類型1.果蠅雌雄性別的鑒別雌雄成蠅在一些形態(tài)結(jié)構(gòu)上的區(qū)別很明顯,可以通過放大鏡或直接觀察進(jìn)行鑒別。只有雄性果蠅在腹尖下側(cè)具可識(shí)別的外生殖器,但是太微小,難以直接觀察辨認(rèn)。通常在分辨雌雄果蠅時(shí),綜合各種形態(tài)特征進(jìn)行觀察確定(參見表1-2,圖1-2)。表1-2雌雄果蠅的形態(tài)特征2.一些常見的突變性狀果蠅的突變性狀很多,已知的達(dá)幾百種,并且隨著研究的深入會(huì)發(fā)現(xiàn)或誘變產(chǎn)生更多的突變性狀。果蠅的許多突變都是明顯而穩(wěn)定的,而且大多是形態(tài)變異,容易觀察。圖1-3和表1-3列出若干常見的突變性狀及其基因符號(hào)等,以供參考。表1-3果蠅部分突變性狀(三)培養(yǎng)基的配制玉米粉培養(yǎng)基將1.5g瓊脂搗碎放入38ml的水中煮溶后，加入10g白糖，制成瓊脂糖混合物，再將9g玉米粉和37ml的水加熱攪拌成糊狀傾入正在煮沸的瓊脂糖混合物中，煮沸3-5分鐘。待稍降溫后加入1ml丙酸，或加入溶于95%乙醇的苯甲酸少許以防腐，攪拌調(diào)勻后，將配好的培養(yǎng)基倒入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)瓶中（1-1.5cm厚），傾倒時(shí)應(yīng)注意勿將培養(yǎng)基粘到瓶口或瓶壁上。用滅菌的紗布棉塞塞好瓶口，冷卻待用。暫時(shí)不用的培養(yǎng)基應(yīng)放入4℃冰箱中或清潔陰涼處保存。使用前在培養(yǎng)瓶中加入適量干酵母粉或1—2滴酵母菌液。制備前培養(yǎng)瓶、濾紙(用酒精浸濕)、100毫升燒杯干燥滅菌、棉花、紗布高壓蒸汽消毒。培養(yǎng)瓶棉塞在飼料制成前做完。高溫滅菌，121℃，20min。注：攪拌以免將玉米粉煮糊。煮沸后將燒杯從電爐上取下,稍放置冷卻一會(huì)兒,將酵母和丙酸加入,用玻璃棒攪拌均勻后分裝到5個(gè)經(jīng)高溫滅菌的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),塞好棉塞備用。注意在分裝時(shí)不要把培養(yǎng)基倒在瓶壁上。剛配制完的培養(yǎng)基放涼后在瓶壁上會(huì)有許多水滴,這時(shí)如果把果蠅放進(jìn)去,水滴可能將果蠅的翅膀粘住,為避免發(fā)生此事,可將配好的培養(yǎng)基放在溫箱內(nèi)2～3d,待水分蒸發(fā)后再使用,或用酒精棉將瓶壁上的水分擦掉。（四）果蠅麻醉方法 對(duì)果蠅進(jìn)行麻醉處理,是進(jìn)行性狀觀察或雜交的必需步驟。麻醉程度是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵步驟,麻醉不夠,果蠅就會(huì)飛掉,麻醉過頭又會(huì)殺死果蠅。用于麻醉的瓶子可用與培養(yǎng)瓶一樣的瓶子,麻醉瓶要配上棉塞或軟木塞。倒瓶麻醉的操作步驟如下:1.輕搖或輕拍培養(yǎng)瓶使果蠅落于培養(yǎng)瓶底部。2.右手兩指取下培養(yǎng)瓶塞,迅速將麻醉瓶口與培養(yǎng)瓶口對(duì)接嚴(yán)密。3.左手握緊兩瓶接口處,倒轉(zhuǎn)使培養(yǎng)瓶在上。4.緊握兩瓶接口,使兩瓶稍傾斜,右手輕拍培養(yǎng)瓶將果蠅震落到麻醉瓶中。注意不要將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒入麻醉瓶。如培養(yǎng)基已變得太稀而易掉落,可采用麻醉瓶在上,而用黑紙或雙手遮住培養(yǎng)瓶,使果蠅趨光自動(dòng)飛入培養(yǎng)瓶中。5.當(dāng)果蠅進(jìn)入麻醉瓶后,迅速分開,將兩瓶各自蓋好。再將麻醉瓶的果蠅拍到瓶底,迅速拔出塞子,在塞子上滴上幾滴乙醚,重新塞上麻醉瓶。6.觀察麻醉瓶中的果蠅。約半分鐘后果蠅便不再爬動(dòng)。轉(zhuǎn)動(dòng)瓶子,果蠅在瓶壁上站不穩(wěn),麻醉完成,即可倒在白瓷板上進(jìn)行觀察。因麻醉過度被殺死的果蠅翅膀外展,與身體呈45°角。7.果蠅麻醉狀態(tài)通常可維持5～10min。如果觀察中蘇醒過來,可進(jìn)行補(bǔ)救麻醉,即用一平皿,內(nèi)貼一帶乙醚的濾紙條,罩住果蠅形成一臨時(shí)麻醉小室。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.熟悉野生型和常見突變型果蠅的形態(tài)學(xué)特征。2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)中介紹的方法,描述自己所觀察到的果蠅雌雄個(gè)體的形態(tài)學(xué)特征。七、思考題1.果蠅作為遺傳學(xué)模式材料的優(yōu)點(diǎn)有哪些?2.仔細(xì)觀察果蠅形態(tài),列出雌雄果蠅的各種形態(tài)差別。實(shí)驗(yàn)二單因子試驗(yàn)(3:1分離試驗(yàn))一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^果蠅單因子雜交試驗(yàn)驗(yàn)證分離規(guī)律。二、實(shí)驗(yàn)材料及說明 果蠅灰體(++)×黑檀體(ee) 或長(zhǎng)翅(++)×痕跡翅(VgVg)三、實(shí)驗(yàn)儀器和用品解剖鏡、放大鏡、米粉培養(yǎng)基用料、培養(yǎng)瓶、麻醉瓶、乙醚、恒溫箱、白瓷板(或表玻璃）、毛筆、酒精棉、棉花塞、電爐、鋁鍋、250毫升燒杯、100毫升燒杯、標(biāo)簽、漿糊、死蠅收集瓶(裝煤油)、鑷子、200毫升量筒。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)確定雜交組合(用正反交比較)(二)選取處女蠅和雄蠅為保證產(chǎn)生的后代均為雜交個(gè)體，雌繩必須是處女蠅，可將原種瓶中的果蠅全部倒人死蠅收集瓶?jī)?nèi)(一個(gè)也不留)，在此后8個(gè)小時(shí)內(nèi)由蛹羽化的雌繩即是處女蠅。選用處女蠅和雄蠅各3—4對(duì)。注：處女蠅的選擇過程：用于雜交的親本雌蠅應(yīng)該是沒有交尾的處女蠅,這樣才能保證雜交結(jié)果按照實(shí)驗(yàn)者所設(shè)計(jì)的路線進(jìn)行。那么如何才能得到處女蠅呢?一般來說,剛羽化出來的果蠅在12h之內(nèi)是不進(jìn)行交配的,所以在這段時(shí)間內(nèi)選出的雌蠅即為處女蠅。為了保險(xiǎn)起見,可以在羽化后的8h內(nèi)挑選。因此,在雜交實(shí)驗(yàn)開始的一段時(shí)間內(nèi),各實(shí)驗(yàn)小組要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),精心挑選處女蠅。為了操作方便,可以在每天晚上22:00～23:00將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的成蠅殺死,次日早晨8:00～9:00對(duì)新羽化出的果蠅進(jìn)行挑選。可能需要2-3天時(shí)間收集。(三)雜交(正反交)用某品種的處女蠅與另一個(gè)雜交親本的雄繩雜交(放入同一個(gè)培養(yǎng)瓶)用該品種的雄蠅與另一雜交親本的處女蠅作反交(放入另一個(gè)培養(yǎng)瓶中)，貼上標(biāo)簽，每瓶須保證有5~6對(duì)以上。在恒溫箱培養(yǎng)。注意：麻醉后的果蠅用毛筆掃人培養(yǎng)瓶時(shí)，瓶壁要干燥，培養(yǎng)瓶要橫放，待果蠅醒后方可豎起，以免果蠅沾在培養(yǎng)基或濕的瓶壁上造成死亡。麻醉時(shí)宜輕度，過重果蠅雙翅與身體外展450角表示已死亡。(四)觀察果蠅從產(chǎn)卵→孵化→幼蟲→蛹的變化，待見第一個(gè)蛹出現(xiàn)時(shí)(7、8天后)將親本全部倒出處死。(五)待F1代成蟲果蠅出來后(13天后)進(jìn)行觀察并作好記錄(接種后20天內(nèi)為安全期)。(六)選取F1代果蛹5—6對(duì)移人另一新配培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行自交。(七)待有蛹出現(xiàn)即倒出F1代果蠅。(八)對(duì)F2代果蠅進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)(F1代接種后20天內(nèi)為安全期)，凡已觀察記錄過的果蠅立即處死。(九)整理記錄資料作適合性檢驗(yàn)并作出統(tǒng)計(jì)推斷。(十)做好實(shí)驗(yàn)小結(jié)。五、作業(yè)寫好實(shí)驗(yàn)報(bào)告

附：觀察記錄表（正反交分別記錄）試驗(yàn)編號(hào)開始日期P表型（基因型）×表型（基因型）↓F1表型（基因型）↓F2表型（基因型）：表型（基因型）理論比例：F1記錄表表表型統(tǒng)計(jì)日期果蠅數(shù)目總計(jì)百分?jǐn)?shù)F2記錄表表表型統(tǒng)計(jì)日期果蠅數(shù)目總計(jì)百分?jǐn)?shù)

實(shí)驗(yàn)三兩對(duì)因子的自由組合一、試驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^果蠅的兩因子雜交試驗(yàn)，驗(yàn)證自由組合規(guī)律。二、實(shí)驗(yàn)材料及說明果蠅黑檀體長(zhǎng)翅(ee++)×灰體痕跡翅(++VgVg)要進(jìn)行正反交三、實(shí)驗(yàn)儀器和用品與單因子試驗(yàn)同。四、實(shí)驗(yàn)步驟與單因子試驗(yàn)同。 五、作業(yè)寫好實(shí)驗(yàn)報(bào)告。附：觀察記錄表與單因子的類同。

實(shí)驗(yàn)四伴性遺傳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夤壈樾赃z傳的規(guī)律，比較正反交在F1及F2代之間的差異。二、實(shí)驗(yàn)材料及說明果蠅雌紅眼(x+x+)×雄白眼(xwy)雄白眼(xwxw）×雌紅眼(x+y)雜交設(shè)計(jì)： 按照所設(shè)計(jì)的雜交組合,如白眼♀×紅眼♂選出白眼處女雌蠅2～3只,紅眼雄蠅5～7只共同放入一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。在培養(yǎng)瓶上貼好標(biāo)簽,注明雜交內(nèi)容、日期、實(shí)驗(yàn)組號(hào)等,然后將培養(yǎng)瓶放入25℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。如果溫度適宜,也可在實(shí)驗(yàn)室的窗臺(tái)上放置培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)有蛹出現(xiàn)后應(yīng)及時(shí)將親本處死以防發(fā)生回交 當(dāng)有F1個(gè)體出現(xiàn)后,觀察其表型,注意顯、隱性關(guān)系并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。在一個(gè)新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)放入5對(duì)F1配成F1×F1,此時(shí)不需要選處女蠅。當(dāng)看到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)有蛹出現(xiàn)時(shí),將親本處死。F2果蠅出現(xiàn)后,進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),觀測(cè)數(shù)目在200只以上。按照所配制的雜交組合,提出理論假設(shè)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。注意:無論是對(duì)F1還是對(duì)F2進(jìn)行統(tǒng)計(jì),都要及時(shí)進(jìn)行,避免陸續(xù)羽化出的果蠅在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)交尾后將卵產(chǎn)在培養(yǎng)基內(nèi)。因此要求實(shí)驗(yàn)者不斷進(jìn)行觀察,只要有新羽化出的果蠅就要及時(shí)取出并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和觀察。三、實(shí)驗(yàn)儀器和用品與單因子試驗(yàn)同。四、實(shí)驗(yàn)步驟附：觀察記錄與單因子的類同。

實(shí)驗(yàn)4-2果蠅唾腺染色體標(biāo)本的制備和觀察1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過實(shí)驗(yàn)掌握果蠅唾腺染色體的制片方法,了解果蠅唾腺染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并練習(xí)解剖果蠅幼蟲的技術(shù)。2.實(shí)驗(yàn)原理 唾腺染色體(salivaryglandchromosome)是一類存在于雙翅目昆蟲的幼蟲唾液腺內(nèi)的巨大染色體。果蠅的唾腺染色體是典型的巨大染色體,它的巨大性的成因是核內(nèi)有絲分裂(endomitosis)造成的。由于其染色體DNA經(jīng)過多次復(fù)制(可達(dá)210～215次),但并未發(fā)生細(xì)胞核分裂,同時(shí)唾腺細(xì)胞中的染色體總是處在配對(duì)狀態(tài)即體細(xì)胞聯(lián)會(huì)(somaticsynapsis),重復(fù)復(fù)制后的染色線聚集在一起,所以在顯微鏡下看到唾腺染色體要比一般的染色體大得多(可以達(dá)到5μm寬,400μm長(zhǎng),是一般中期染色體的100～150倍),又稱多線染色體(poletenechromosome)。通過細(xì)胞遺傳學(xué)的研究已經(jīng)證明多線染色體的帶紋與某些特定的基因相聯(lián)系。由于它的巨大性及其染色體上帶紋清晰可數(shù),根據(jù)C.B.Bridges等人的研究,至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5149條可以區(qū)別的帶紋并已經(jīng)建立了帶紋分布圖。因此巨大染色體是遺傳學(xué)上研究染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)及染色體畸變的好材料。 黑腹果蠅的染色體數(shù)目2n=8,其中第Ⅱ、第Ⅲ染色體為中部著絲粒染色體,第Ⅳ和第Ⅰ(X染色體)染色體為端著絲粒染色體(圖9-1)。唾液腺染色體形成時(shí),染色體著絲粒和近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)聚于一起形成一個(gè)染色中心(chromo-center),所以在光學(xué)顯微鏡下可見從染色中心處伸出6條配對(duì)的染色體臂,其中5條為長(zhǎng)臂,1條為緊靠染色中心的很短的臂。唾液腺染色體經(jīng)染色后,呈現(xiàn)深淺不同、疏密各異的橫紋(band)。這些橫紋的數(shù)目、位置、寬窄及排列順序都具有物種的特異性。研究認(rèn)為這些橫紋與染色體的基因是有一定關(guān)系的。從其橫紋分布特征可對(duì)物種的進(jìn)化特征進(jìn)行比較分析,而一旦染色體上發(fā)生了缺失、重復(fù)、倒位、易位等結(jié)構(gòu)變化,也可較容易地在唾液腺染色體上觀察識(shí)別出來。3.實(shí)驗(yàn)用具及材料 雙筒解剖鏡、顯微鏡、解剖針、普通果蠅的三齡幼蟲(初學(xué)者可使用黑檀體突變體,其幼蟲個(gè)體較大,易分離得到唾液腺)、生理鹽水(NaCl7.5g、KCl0.35g、Ca