供生物科學(xué)、生物技術(shù)專業(yè)用

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)須知

1.1.基本要求

1.進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生須嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則。

2.課前復(fù)習(xí)有關(guān)課堂講授的理論知識(shí)，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)。

3.明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康模莆諏?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理。做到心中有數(shù)，有備而來。

4.認(rèn)真對(duì)待每一次實(shí)驗(yàn)，按照要求和擬定好的流程進(jìn)行操作，詳細(xì)、真

實(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)中每一個(gè)細(xì)小變化。

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后須按照要求完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫工整、內(nèi)容翔

實(shí)、表述清晰、分析有據(jù)。

除此之外，鼓勵(lì)學(xué)生積極參與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備；保持活躍的思維，積極與教師交

流實(shí)驗(yàn)體會(huì)。

1.2.實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

1.保持肅靜不得喧嘩、嬉鬧，使用器物時(shí)輕拿輕放，討論問題時(shí)不得影

響他人。

2.保持整潔上實(shí)驗(yàn)課時(shí)應(yīng)穿工作服，書包等物品應(yīng)在規(guī)定位置擺放整

齊，盡量避免被試劑等實(shí)驗(yàn)用品玷污。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按具體要求清洗實(shí)驗(yàn)用

品，所用的試劑和器材整理后放回原處，實(shí)驗(yàn)廢品放人指定地方。

3.嚴(yán)格操作做實(shí)驗(yàn)時(shí)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，仔細(xì)觀察，如實(shí)記錄。玻璃器

皿輕拿輕放，移液器吸頭、滴管專用專放，防止交叉污染。使用精密儀器必須

在教師的指導(dǎo)下進(jìn)行，不得隨意動(dòng)用。使用微量移液器前，必須熟悉微量移液

器的使用方法。

4.注意節(jié)約愛惜樣品、器材，節(jié)約試劑、水電，防止器物的破損。使用

不當(dāng)所造成的損壞須酌情賠償。

5.保證安全室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙。使用有毒試劑、腐蝕性試劑等危險(xiǎn)物品時(shí)要

嚴(yán)格按要求操作，注意防護(hù)、防止污染。如有意外立即報(bào)告。實(shí)驗(yàn)完畢后，清

潔室內(nèi)衛(wèi)生，關(guān)好門、窗、水、電等。

1.3.實(shí)驗(yàn)室常識(shí)

1.稱量固體試劑，應(yīng)用硫酸紙，不可用濾紙。量筒是量器，不可用做容

器。

2.取用試劑和溶液后，應(yīng)立即將瓶塞塞嚴(yán)，放回原處。取出的試劑和標(biāo)

準(zhǔn)溶液，如未用盡，切勿倒回瓶內(nèi)，以免污染。

3.使用有揮發(fā)性或毒性的試劑和進(jìn)行會(huì)產(chǎn)生有異味氣體的實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，

均應(yīng)在通風(fēng)柜內(nèi)。試劑用后嚴(yán)密封口，盡量縮短操作時(shí)間、減少外泄。操作者

最好戴口罩、手套進(jìn)行操作。

4.配制完成的試劑須及時(shí)做好標(biāo)記，標(biāo)簽上要寫明試劑的名稱、規(guī)格、

濃度、配制日期及配制

人等必要信息，標(biāo)簽應(yīng)貼在試劑瓶上1/3處。5.使用離心機(jī)前必須配

平樣品，離心時(shí)若有異常的噪音應(yīng)立即停止機(jī)器，關(guān)閉電源后方可仔細(xì)查找原

因，排除故障前不得繼續(xù)使用離心機(jī)。低溫離心結(jié)束后，離心機(jī)應(yīng)敞開晾至室

溫并清理凝結(jié)水后方可關(guān)閉。操作中如有樣品不慎灑入離心機(jī)的管槽或底盤，

必須及時(shí)清理后才能繼續(xù)使用。6.應(yīng)在帶習(xí)老師指導(dǎo)下使用貴重或精密儀

器，并要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，如遇試劑濺污儀器，及時(shí)用潔凈紗布擦拭。發(fā)生

故障時(shí)，應(yīng)立即關(guān)機(jī)，告知帶習(xí)老師，不得擅自拆修。

7.實(shí)驗(yàn)用過的器皿應(yīng)及時(shí)用消毒液或自來水浸泡，以便于清洗和減少試

劑對(duì)器皿的侵蝕。洗凈的器皿應(yīng)倒置架上自然干燥，不能用抹布擦拭。

1.4.實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)

1.最后離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)，一定要將室內(nèi)檢查一遍，應(yīng)將水、電等關(guān)好，門

窗鎖好。

2.使用電器設(shè)備時(shí)，如烤箱、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、電泳儀等，嚴(yán)防觸

電，絕不可用濕手開關(guān)電閘和電器開關(guān)。

3.使用高壓鍋消毒時(shí)，人不得離開。易燃、易爆、腐蝕、有毒等試劑，

不能放入高壓鍋內(nèi)消毒，以防發(fā)生爆炸，造成人身傷亡。

4.使用可燃物，特別是易燃物時(shí)，如乙酸、丙酮、乙醇等，應(yīng)特別小

心。

5.凡使用腐蝕性試劑如濃酸、濃堿等，必須極為小心地操作，防止濺

出，一旦有灑出，立即用自來水沖洗。

6.廢液應(yīng)按要求妥善處理。

2.實(shí)驗(yàn)常用儀器介紹

2.1.微量移液器

微量移液器是一種在一定容量范圍內(nèi)可隨意調(diào)節(jié)的精密取液裝置，基本原

理是依靠裝置內(nèi)活塞的上下移動(dòng)，推動(dòng)按鈕帶動(dòng)推動(dòng)桿使活塞向下移動(dòng)，排除

活塞腔內(nèi)的氣體；松手后，活塞在復(fù)位彈簧的作用下恢復(fù)原位，從而完成一次

吸液過程。常用的有Eppendorf公司各種規(guī)格的的微量移液器，其他還有美

國TOMOS公司、德國BRAND公司等產(chǎn)品。目前使用的移液器有整支可消

毒移液器、半支可消毒移液器、電動(dòng)移液器、PCR專用移液器。此外還有大容

量移液器、電子連續(xù)移液器、瓶口移液器、電子滴定器等不同種類的移液器。

微量移液器的標(biāo)準(zhǔn)操作適用的液體有水、緩沖液、稀釋的鹽溶液和酸堿溶

液，其操作步驟第一步按到第一檔，垂直進(jìn)入液面幾毫米，第二步緩慢松開控

制按鈕，否則液體進(jìn)入吸頭過速會(huì)導(dǎo)致液體倒吸人移液器內(nèi)部吸人體積減少，

第三步打出液體時(shí)貼壁并有一定角度，先按到第一檔，稍微停頓幾秒后，待剩

余液體聚集后，再按到第二檔將剩余液體全部壓出。

在使用移液器的過程中，應(yīng)注意以下幾個(gè)方面：

1）移液器應(yīng)放在專用的架子上，不得隨意放置；

2）移液時(shí)選用適當(dāng)型號(hào)的移液器，不得用大量程的移液器移取小體積樣

品;

3）吸不同的液體時(shí)應(yīng)更換吸頭，防止交叉污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

4）新吸頭在使用前可吸排溶液幾次，浸漬吸頭以消除測(cè)量誤差；

5）移液器吸液后嚴(yán)禁倒置、平放，以免液體倒流損壞活塞；

6）長時(shí)間不用或剛?cè)〕龅男乱埔浩鲬?yīng)輕輕按壓按鈕數(shù)次，再進(jìn)行正常使

用。

2.2.離心機(jī)

離心機(jī)是實(shí)驗(yàn)中最常用的一類儀器，主要用于細(xì)胞的收集和分離、基因片

段的分離以及其它生物樣品的分離制備。離心機(jī)依據(jù)轉(zhuǎn)速不同，可分為低速離

心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速少于6000r/min的為低速離心機(jī)，低于

25000r/min的為高速離心機(jī)，大于30000r/min的是超速離心機(jī)；依據(jù)溫度控

制不同，又可分為冷凍離心機(jī)和普通離心機(jī)，冷凍離心機(jī)帶有制冷系統(tǒng)，能夠

控制溫度最低至-20C,普通離心機(jī)不帶制冷系統(tǒng)。

離心機(jī)在每次接通電源使用前，應(yīng)仔細(xì)檢查所用的轉(zhuǎn)頭及離心管有無裂

紋，或嚴(yán)重腐蝕現(xiàn)象，如有應(yīng)立即更換；保持離心機(jī)腔體內(nèi)清潔，防積水，防

有顆粒狀雜物；配轉(zhuǎn)頭系統(tǒng)時(shí)，必須在儀器斷電條件下操作；儀器加速或減速

過程中，出現(xiàn)短時(shí)振動(dòng)屬正常現(xiàn)象，不必關(guān)斷電源開關(guān)；若出現(xiàn)中途斷電，切

勿馬上開門，必須等電機(jī)停轉(zhuǎn)后方可開門；離心時(shí)樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心

筒離心時(shí)離心筒與樣品應(yīng)同時(shí)平衡，揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋

的離心管，并確保液體不外漏，以免腐蝕機(jī)腔。

2.3.電泳裝置

電泳技術(shù)是實(shí)驗(yàn)中不可缺少的重要分析手段。所謂電泳，是指帶電粒子在

電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)，不同物質(zhì)由于所帶電荷及分子量的不同，因此在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)速

度不同，根據(jù)這一特征，應(yīng)用電泳法便可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析，

或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M(jìn)行組份分析或單個(gè)組份提取制備，這在臨床檢驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)研究

中具有極其重要的意義。

電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳兩大類，自由界面電泳不需支持

物，而區(qū)帶電泳則需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋

酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠薄層等，分子生物學(xué)領(lǐng)域

中最常用的是瓊脂糖凝膠電泳。

電泳裝置是實(shí)現(xiàn)電泳分析的儀器，一般由電泳儀、電泳槽、檢測(cè)單元等組

成。它主要用于檢測(cè)、鑒定各種生物大分子的純度、含量及描述它們的特征，

還可以用于樣品的分離、純化、回收和濃縮。

電泳儀作為電泳時(shí)的外加電源設(shè)備，它既能輸出穩(wěn)定的電流，又能輸出穩(wěn)

定的電壓，起到在被分離樣品兩端加外接電場(chǎng)的作用；電泳槽是電泳的主要部

件，是樣品分離的場(chǎng)所；電泳儀在通電進(jìn)入工作狀態(tài)后，禁止人體接觸電極、

電泳物，也不能到電泳槽內(nèi)取放東西，如需要應(yīng)先斷電，以免觸電。同時(shí)要求

儀器必須有良好接地端，以防漏電；在通電后，不要臨時(shí)增加或撥除輸出導(dǎo)線

插頭，以防短路現(xiàn)象發(fā)生，使用過程中發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象，如較大噪音、放電或異

常氣味，須立即切斷電源，進(jìn)行檢修，以免發(fā)生意外事故。

2.4.生物安全柜

生物安全柜是為操作具有感染性的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，用來保護(hù)操作者本人、實(shí)

驗(yàn)室環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)材料，使其避免暴露于可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而

設(shè)計(jì)的。

根據(jù)生物安全防護(hù)水平的差異，生物安全柜也可以分為I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)

三種類型。I級(jí)生物安全柜可保護(hù)工作人員和環(huán)境而不保護(hù)樣品。氣流原理和

實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)櫥一樣，不同之處在于排氣口安裝有HEPA過濾器。所有類型的

生物安全柜都在排氣和進(jìn)氣口使用HEPA過濾器。H級(jí)生物安全柜是目前臨

床分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最為廣泛的柜型，II級(jí)生物安全柜的一個(gè)獨(dú)特之處在于

經(jīng)過HEPA過濾器過濾的垂直層流氣流從安全柜頂部吹下，被稱作“下沉氣

流”，下沉氣流不斷吹過安全柜工作區(qū)域，以保護(hù)柜中的試驗(yàn)品不被外界塵埃

或細(xì)菌污染。按照《中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY0569-2005生物安全

柜》中的規(guī)定，II級(jí)生物安全柜依照入口氣流風(fēng)速、排氣方式和循環(huán)方式可分

為4個(gè)級(jí)別：A1型，A2型；B1型和B2型。所有的H級(jí)生物安全柜都可提

供工作人員、環(huán)境和樣品的三重保護(hù)。III級(jí)生物安全柜柜體完全氣密，100%

全排放式，工作人員通過連接在柜體的手套進(jìn)行操作，適用于高風(fēng)險(xiǎn)的病原生

物研究，如進(jìn)行SARS、埃博拉病毒相關(guān)的實(shí)驗(yàn)等。

另外，需要了解生物安全柜與通風(fēng)柜和超凈工作臺(tái)的區(qū)別。通風(fēng)柜和超凈

工作臺(tái)不屬于生物安全柜，不可使用在涉及微生物材料的實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)過程中。

通風(fēng)柜（通風(fēng)櫥）是為在化學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中清除腐蝕性化學(xué)氣體和有毒煙霧而設(shè)

計(jì)的，不能有效清除微生物介質(zhì)；放置在通風(fēng)柜內(nèi)的微生物樣品會(huì)散播到柜

外，污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

超凈工作臺(tái)是為了保護(hù)試驗(yàn)品或樣品而設(shè)計(jì)的，通過吹過工作區(qū)域的空氣

防止試驗(yàn)品或樣品受到工作區(qū)域外粉塵或細(xì)菌的污染。一旦微生物樣品放置于

工作區(qū)域，層流空氣將把帶有微生物介質(zhì)的空氣吹向前臺(tái)工作人員而產(chǎn)生危

險(xiǎn)。

在實(shí)驗(yàn)中，被分類為可能涉及或者產(chǎn)生有害生物物質(zhì)的操作過程都應(yīng)該在

生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，一般使用13級(jí)的生物安全柜。

2.5.消毒滅菌設(shè)備

實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基、試劑、器皿、實(shí)驗(yàn)用具等，應(yīng)嚴(yán)格滅菌。常用的滅

菌設(shè)備主要包括濾膜過濾器和高壓蒸汽滅菌器等。

濾膜過濾器的過濾原理主要是分子篩作用，大于膜孔的顆粒被截留（篩除）

在膜的表面，小于膜孔的顆粒通過膜孔。在實(shí)驗(yàn)中常用來制備抗生素濾液。

高壓蒸汽滅菌器是利用飽和壓力蒸汽對(duì)物品進(jìn)行迅速而可靠的消毒，適用

于對(duì)醫(yī)療器械、敷料、

玻璃器皿、培養(yǎng)基等進(jìn)行消毒滅菌。在使用過程中應(yīng)注意：滅菌前應(yīng)先完

全排除鍋內(nèi)冷空氣，使鍋內(nèi)全部充滿水蒸汽時(shí)，滅菌才能徹底；滅菌后當(dāng)壓力

降到零后，才能開蓋；培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保壓徹底，又要防止

培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長時(shí)間。

2.6.水純化設(shè)備

實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)用水的質(zhì)量要求非常高，器皿經(jīng)洗凈后都需要雙蒸水漂洗數(shù)

次，試劑的配制要求用三蒸水甚至超純水，這就要求實(shí)驗(yàn)室必須配備純水裝

置。目前較常用的水純化裝置有石英玻璃雙蒸儲(chǔ)器、離子交換器以及超純水系

統(tǒng)等。

超純水系統(tǒng)是采用預(yù)處理、反滲透技術(shù)、超純化處理等方法，將水中的導(dǎo)

電介質(zhì)幾乎完全去除，

又將水中不解離的膠體物質(zhì)、氣體及有機(jī)物均去除至很低程度的水處理設(shè)

備。所得水可用于高效液相色譜（HPLC）、原子吸收及發(fā)射光譜分析、質(zhì)譜

分析等。

2.7.PCR儀

簡單地說，PCR就是利用耐熱DNA聚合酶對(duì)特定基因在體外的大量合

成。PCR儀是體外擴(kuò)增基因最常用的設(shè)備，主要由機(jī)械自動(dòng)裝置、溫度循環(huán)系

統(tǒng)及附屬設(shè)備等構(gòu)成。根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，可以將PCR儀

分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等種

類。

普通的PCR儀是做定性分析和擴(kuò)增基因片段，熒光定量PCR儀比普通的

PCR儀多了熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，其不僅可對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)

增，而且可通過TaqMan熒光探針，SYBRGreen熒光染料等方法對(duì)擴(kuò)增后的

樣品進(jìn)行定量測(cè)定。且一次可同時(shí)檢測(cè)數(shù)百個(gè)樣品量，樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)

歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)），可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。

2.8.紫外觀察儀及凝膠成像分析系統(tǒng)

主要用于瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳后結(jié)果的觀察和記錄。

2.8.1.紫外觀察儀

DNA片段經(jīng)電泳后肉眼是觀察不到的，經(jīng)由與漠化乙錠等熒光染料結(jié)合，

在紫外燈的照射下會(huì)產(chǎn)生熒光，從而可以利用來紫外觀察儀來進(jìn)行定性和半定

量觀察。用于核酸分析的紫外觀察儀常采用254nm、300nm、365nm等幾個(gè)波

長，在此波長范圍內(nèi)，DNA與漠化乙錠結(jié)合物對(duì)紫外光吸收較強(qiáng)，從而誘導(dǎo)

產(chǎn)生590nm波長的橙紅色熒光。產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與DNA的數(shù)量相關(guān)。

2.8.2.凝膠成像分析系統(tǒng)

通過紫外觀察儀只能對(duì)凝膠電泳圖譜進(jìn)行觀察，如果需要記錄結(jié)果，可以

借助凝膠成像系統(tǒng)拍攝成像。該系統(tǒng)具有強(qiáng)大的圖像采集、檢測(cè)和分析能力，

可以對(duì)DNA、RNA、蛋白質(zhì)等電泳凝膠以及各類雜交，放射自顯影結(jié)果進(jìn)行

拍攝、處理、分析和保存。

2.9.其他常用儀器設(shè)備

2.9.1.紫外/可見分光光度計(jì)

紫外/可見分光光度計(jì)廣泛應(yīng)用臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域的教學(xué)和科研工作中，特別

適合對(duì)各種液態(tài)物質(zhì)進(jìn)行定量及定性分析。其應(yīng)用波長范圍為200~400nm的

紫外光區(qū)、400~850nm的可見光區(qū)。主要由輻射源（光源）、色散系統(tǒng)、檢測(cè)

系統(tǒng)、吸收池、數(shù)據(jù)處理機(jī)、自動(dòng)記錄器及顯示器等部件組成。臨床實(shí)驗(yàn)中常

用紫外260nm、280nm檢測(cè)核酸的含量及純度。

2.9.2.二氧化碳培養(yǎng)箱

二氧化碳培養(yǎng)箱是通過在培養(yǎng)箱箱體內(nèi)模擬形成一個(gè)類似細(xì)胞或組織在生

物體內(nèi)的生長環(huán)境，如穩(wěn)定的溫度（37℃）＞穩(wěn)定的C02水平（5%）、恒定

的酸堿度（pH值：7.2-74）、較高的相對(duì)飽和濕度（95%）,來對(duì)細(xì)胞或組織

進(jìn)行體外培養(yǎng)的一種裝置。其廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、組織培養(yǎng)和某些特殊微生物的

培養(yǎng)。

2.9.3.分析天平

分析天平是實(shí)驗(yàn)中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其

使用方法，是獲得可靠實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天

平、阻尼分析天平及電子分析天平等，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)精確度和量程要求的不同

進(jìn)行選擇。在使用天平的過程中，要注意以下幾個(gè)方面：

1.天平應(yīng)放置在牢固平穩(wěn)的水泥或木質(zhì)臺(tái)面上，稱量室內(nèi)要求清潔、干

燥及較恒定的溫度，同時(shí)應(yīng)避免光線直接照射到天平上；

2.稱量時(shí)應(yīng)從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時(shí)應(yīng)關(guān)閉箱門以免空氣流動(dòng)引起天平

擺動(dòng)；

3.電子分析天平若長時(shí)間不使用，則應(yīng)定時(shí)通電預(yù)熱，每周一次，每次

預(yù)熱2h,以確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)；

4.天平箱內(nèi)應(yīng)放置吸潮劑（如硅膠），當(dāng)吸潮劑吸水變色，應(yīng)立即高溫

烘烤更換，以確保吸濕性能;

5.揮發(fā)性、腐蝕性、強(qiáng)酸強(qiáng)堿類物質(zhì)應(yīng)盛于帶蓋稱量瓶內(nèi)稱量，防止腐

蝕天平。

2.9.4.恒溫水浴箱

實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常需要在某一恒定的溫度下進(jìn)行，有的需要恒溫水浴過夜。此

時(shí)需要用到恒溫水浴箱。使用時(shí)先加蒸儲(chǔ)水于水箱內(nèi)，再接通電源，然后調(diào)節(jié)

至所需溫度，禁止干燒。當(dāng)設(shè)置溫度值超過水溫時(shí)，加熱指示燈亮，表明加熱

器已開始工作；在水溫達(dá)到所需水溫時(shí)，恒溫指示燈亮，加熱指示燈熄滅，此

時(shí)加熱器停止工作。由于水箱內(nèi)水是靜止的，故水溫上下之間有一定差異，需

要經(jīng)過反復(fù)加熱轉(zhuǎn)換后，水溫才能達(dá)到恒定的狀態(tài)。

3.實(shí)驗(yàn)一基因組DNA的分離純化

核酸作為生命信息的主要載體，是分子生物學(xué)重要的分析研究對(duì)象。核酸

包括核糖核酸和脫氧核糖核酸兩種分子，在細(xì)胞中均與蛋白質(zhì)結(jié)合。真核生物

染色體DNA為雙鏈線性分子；原核生物"染色體"DNA為雙鏈環(huán)狀分子。從生

物體中提取分離特定種類的核酸分子，通常是分子生物學(xué)研究的首要任務(wù)和工

作基礎(chǔ)。核酸的分離和提取是分子生物學(xué)研究中重要的技術(shù)，核酸樣品質(zhì)量的

好壞直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。

基因組是細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子，包含

了該物種生長、發(fā)育、繁殖等各項(xiàng)生理活動(dòng)的幾乎全部信息，對(duì)基因組的結(jié)

構(gòu)、組成以及表達(dá)調(diào)控的研究是至關(guān)重要的，而研究的起點(diǎn)就是要獲得純度

高，產(chǎn)率好，且不含蛋白質(zhì)、糖類、酚、氯仿等污染基因組以用于下游分析。

基因組DNA來源不同、性質(zhì)不同以及用途不同，其分離方法也不盡相

同，本實(shí)驗(yàn)以人體外周血細(xì)胞和原核生物細(xì)菌基因組抽提為例，介紹制備基因

組樣品的常用方法。

3.1.第一部分大腸桿菌DNA的分離純化

3.1.1.實(shí)驗(yàn)原理

DNA提取的方法很多，根據(jù)實(shí)驗(yàn)用途可繁可簡。苯酚抽提法為經(jīng)典方法，

是利用核酸與蛋白質(zhì)對(duì)苯酚和氯仿的變性作用具有的不同反應(yīng)性分離核酸與蛋

白質(zhì)。用苯酚抽提和離心以后，樣品中的蛋白質(zhì)成分被變性，或者變成不溶性

物質(zhì)，而核酸則溶解在水相溶液中。苯酚抽提通常采用苯酚、氯仿的混合溶

液。這種混合液a.相對(duì)減少酚的用量，并最終可除去殘留的酚，減輕對(duì)DNA

的破壞；b.使蛋白變性更徹底；c.抑制核酸酶的活性；隨后用氯仿：異戊醇抽

提，將殘留苯酚從含核酸的水相中除去。

3.1.2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握酚-氯仿抽提法的原理。

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2.熟練操作酚抽提法分離DNA的實(shí)驗(yàn)步驟。

3.理解主要試劑的作用。

3.1.3.實(shí)驗(yàn)材料

1.酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）酚的重蒸儲(chǔ)和平衡：

①酚易氧化，其氧化產(chǎn)物對(duì)DNA有破壞作用，使用前需要將酚進(jìn)行重蒸

儲(chǔ)。苯酚16513熔化后，用空氣冷凝管進(jìn)行重蒸儲(chǔ)，183團(tuán)收集純凈酚。由

于酚是中強(qiáng)酸，使用前要進(jìn)行酚的平衡。方法是在純凈酚中加入等體積的

Imol/LTris.Cl緩沖液（PH8.0）并加入固體Tris,激烈震蕩使酚的PH值平

衡到8.0,保存到棕色瓶中，并加入8-羥基喳寧；表面覆蓋一層

0.1mol/LTris.Cl（PH8.0）防止氧化。

②8-羥基口奎寧的作用：a.抗氧化；b.指示顏色（若黃色的酚變色為紅色則表

明產(chǎn)生了酚的氧化物），易于觀察分層情況。

2.TES緩沖液（PH8.0）：lOmmol/LTris.ClPH8.0

Immol/LEDTAPH8.0

O.lmmol/LNaCl

3.TES-蔗糖緩沖液（蔗糖：增加溶液粘度，維持滲透壓，防止

DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。）

4.溶菌酶（50mg/ml，低溫保存,溶菌酶是糖背水解酶，水解菌體細(xì)

胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的供1,4糖昔鍵，因而具有溶菌作

用）。

5.10%SDS溶液（當(dāng)室溫低于2013時(shí),需要加熱使其完全溶解后使

用）

6.氯仿/異戊醇（24/1,異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽

提過程中泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水

相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。）

7.3mol/LNaAC

8.無水乙醇（-20團(tuán)）及70%乙醇四、操作步驟

1.細(xì)菌培養(yǎng)物：取單個(gè)大腸桿菌菌落于LB培養(yǎng)基中，37國振蕩培養(yǎng)

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過夜。

2.吸取已培養(yǎng)好的大腸桿菌液8.0ml于lOmlEP管中,4000rpm離心

5分鐘，棄去上清，加入5ml的TES液，強(qiáng)烈振蕩洗菌體1-2次，如上

述方法收集菌體。

3.棄去TES液后，管底菌體大約200位，加入預(yù)冷TES-蔗糖液約

1ml,在冰浴中充分混勻，加入溶菌酶（50mg/ml）40m至終濃度

2mg/ml,EDTA（0.25mol/L）溶液0.5ml至終濃度為0.1mol/L,充分混勻

后，放置在冰浴上5分鐘，充分抑制DNA酶的活性。

4.加入10%SDS溶液0.2ml,輕輕混勻，于37團(tuán)裂解30分鐘。在

37團(tuán)裂解后呈現(xiàn)為粘稠狀液體。若裂解效果不好，將液體分裝到兩個(gè)

1.5mlEP管中加入20mg/ml的蛋白酶K20uL,7013恒溫金屬浴上再消化

10分鐘。

注意！SDS在室溫小于2013時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色沉淀，使用前需要3713水浴預(yù)

熱。

5.將試管內(nèi)的裂解液分裝在兩個(gè)L5mlEP管中，約0.6ml。取其中

一管進(jìn)行下一步試驗(yàn)，加入等體積（0.6ml）的酚/氯仿/異戊醇

（25/24/1）進(jìn)行抽提。具體操作是：溫和顛倒EP管以混勻兩相液面，使

酚和水兩相在靜置時(shí)呈不分層的乳白色混懸液。然后于12000rpm,離心5

分鐘。注意！①由于酚/氯仿有腐蝕性，務(wù)必戴手套操作此步驟；②使用

專用的刻度吸管而不要用微量移液器加樣。

6.小心取出EP管，將上層水相（含DNA）轉(zhuǎn)移入另一個(gè)1.5mlEP

管中（小心不要吸出水相下的蛋白質(zhì)沉淀），加入等體積的氯仿：異戊醇

（24：1）,抽提一次，操作同前。抽提后于

12000rpm,離心5分鐘。（這一步可視具體情況而做取舍）

7.吸取水相于另一EP管中，加入1/10倍體積的NaAC,和2.5倍

體積的冰乙醇（無水乙醇

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-20因冷凍儲(chǔ)存），顛倒混勻（觀察DNA絮狀物沉淀）。

8.12000rpm,離心2分鐘，棄去乙醇，加入70%的乙醇輕輕振蕩洗

滌DNA沉淀，12000rpm,

離心2分鐘。棄去70%的乙醇。

9.室溫開蓋或真空凍干揮發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥，

視DNA提取量加入20-40|jl

TE于DNA沉淀中，溶解DNA,DNA完全溶解通常需12-24小時(shí)，-2013保

存。

3.2.第二部分真核細(xì)胞基因組DNA的分離純化（離心柱層析

法）

3.2.1.實(shí)驗(yàn)原理

真核生物基因組DNA的分離純化在技術(shù)路線設(shè)計(jì)上與原核生物

DNA分離純化沒有本質(zhì)區(qū)別，但真核生物基因組更龐大，細(xì)胞核內(nèi)染色

體DNA占總DNA的95%以上，這些染色體由組蛋白和雙鏈DNA形

成的核小體組成。所以提取真核生物基因組DNA就必須增加解聚核小體

這一步。

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本次實(shí)驗(yàn)使用了臨床更常見的離心柱層析法去分QIAampDNAMicroProcedure

離DNA,其設(shè)計(jì)思路和原理是①收集抗凝全血

后利用紅細(xì)胞裂解液高效降解紅細(xì)胞，離心后收

集有核細(xì)胞。②使用含SDS的結(jié)合液裂解有核

細(xì)胞的同時(shí)使用蛋白酶K解聚核小體，③基

因組DNA在高鹽離子濃度下選擇性吸附在離心

BindDNA

柱內(nèi)硅基質(zhì)膜上④使用抑制物去除液和70%乙

醇（漂洗液）將蛋白、細(xì)胞代謝物等雜質(zhì)去除。

⑤最后低鹽洗脫液將純凈的基因Wash

DNA從硅基質(zhì)膜洗脫。

3.2.2.實(shí)驗(yàn)材料

1.結(jié)合液CB（細(xì)胞裂解緩沖液）：

lOmmol/ETris.Cl（PH8.0）0.1mmol/LEDTA

20jig/mlRNA酶0.5-1.0%SDSReady-to-useDNA

2.蛋白酶K20mg/ml

3.離心吸附柱

4.抑制物去除液IR

5.漂洗液（70%乙醇）

6.洗脫緩沖液EB

7.異丙醇

3.2.3.操作步驟

結(jié)合液CB

?加入異丙醉?＞吸附柱吸附

雷白施K處理

洗脫液洗脫漂洗液漂洗抑制物去除

4.抗凝血使用前溫和顛倒混勻3~5次，取200口L抗凝全血加入EP管

中。

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5.加入20UL蛋白酶K,充分混勻，加入200UL結(jié)合液CB立刻充分

混勻（渦旋混勻器或是加樣槍吹打）10秒。

6.70團(tuán)金屬浴5分鐘。如果室溫放置，DNA產(chǎn)量將降低10~20%。

7.冰浴1分鐘冷卻后，加入100UL異丙醇，渦旋混勻器充分混均10

秒，此時(shí)溶液可能出現(xiàn)沉淀。一定要確保離心管底的液體被震蕩起來。

8.小心將上一步混合液轉(zhuǎn)移吸附柱AC（吸附柱外套一個(gè)收集管）中，避

免觸及中間的白膜。

室溫放置2分鐘，12000rpm室溫離心2分鐘，棄穿透液（收集管中

的廢液）。

9.加500HL抑制物去除液IR到吸附柱中，12000rpm室溫離心1分

鐘，棄穿透液。

10.加500HL漂洗液到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心1分鐘，棄穿

透液。

11.加500UL漂洗液到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心1分鐘，棄穿

透液。

12.將吸附柱放回到空收集管中，不加任何試劑12000rpm室溫再離心2

分鐘。此步十分重要，否則殘留的乙醇會(huì)污染DNAo

13.室溫放置半分鐘使殘留乙醇揮發(fā)。

14.將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一新的1.5mL塑料離心管中（做好標(biāo)記），加入

50ULDNA洗脫液（預(yù)熱到70國），室溫放置離心吸附柱1-2分鐘。

12000rpm室溫離心1分鐘，離心管中溶液即為DNA樣品，可以立即

使用或存放于-2013冰箱待用。

3.3.注意事項(xiàng)

1.為保證核酸的完整性和純度，實(shí)驗(yàn)中盡量簡化操作步驟，縮短過

程，以減少有害因素破壞。

2.減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解：過酸和過堿的環(huán)境都可引起DNA的

一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，所以實(shí)驗(yàn)中的緩沖液要求使用PH8.0的Tris.Cl緩沖

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液。

3.減少物理因素對(duì)核酸的破壞：分離過程中的離心、吸取、轉(zhuǎn)移等，

產(chǎn)生的機(jī)械剪切力和高溫都對(duì)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)有破壞作用。所以實(shí)驗(yàn)中的

振蕩混勻動(dòng)作要溫和輕柔，要求低溫的操作要在冰浴上進(jìn)行。

4.減少生物因素對(duì)核酸的破壞：防止核酸的生物降解主要針對(duì)DNA

酶對(duì)DNA有降解作用，在實(shí)驗(yàn)中要使用DTA來抑制DNA酶的活性。

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4.實(shí)驗(yàn)二堿裂解法制備質(zhì)粒DNA

4.1.實(shí)驗(yàn)原理

從細(xì)菌中制備質(zhì)粒DNA的方法眾多，目前常用的有堿裂解法等。堿裂解

法抽提效果良好，既經(jīng)濟(jì)且得率又較高，制備的質(zhì)粒DNA可以用于酶切、連

接與轉(zhuǎn)化。

堿裂解法的原理：基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而

達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，

雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉

合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。當(dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其

pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色

體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)

定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

4.2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握堿裂解法的原理。

2.熟練操作堿裂解法制備質(zhì)粒DNA的實(shí)驗(yàn)步驟。

3.理解主要試劑的作用。

4.3.實(shí)驗(yàn)材料

1.轉(zhuǎn)化好的質(zhì)粒菌株(細(xì)菌菌液)

2.STE：O.lmol/LNaCl

lOmmol/LTris.Cl(pH8.O)

1mmol/LEDTA

3.溶液國：50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris.Cl(pH8.0)

10mmol/LEDTA

4.溶液回：0.2mol/LNaOH

1%SDS

加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6,因而促使染色體DNA與質(zhì)粒

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DNA的變性。SDS是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋

白，因溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成

為復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性沉淀下來。

5.溶液團(tuán)：5mol/LKAC60ml

冰醋酸15ml

水28.5ml

pH4.8的KAc溶液是為了把pH12.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒

DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽3moi/LKAc有利于變性的大分子染色

體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體DNA因?yàn)橹泻?/p>

了核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復(fù)合物作

用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

6.酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）

7.乙醇

8.TE（PH8.0）（含無DNA酶的RNA酶20ng/ml）

4.3.1.方案一堿裂解聯(lián)合酚抽提法

4.4.操作步驟

1.增殖細(xì)菌，擴(kuò)增質(zhì)粒

將保存的質(zhì)粒菌株挑取一環(huán)，接種于含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平

板上。37國培養(yǎng)過液（約

16h）；挑取瓊脂培養(yǎng)板上的單菌落，移至200mlLB培養(yǎng)液中（含相應(yīng)的抗

生素）強(qiáng)烈搖蕩過夜約

16小時(shí)。

此步驟已由實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備老師完成。

2.取1.4ml培養(yǎng)液移至EP管中，12000rpm,離心1分鐘，棄上清。

3.加入1mlSTE溶液強(qiáng)烈振蕩懸浮菌體沉淀，以漂洗菌體，在

12000rpm,離心1分鐘回收菌體。

離心后，去盡上清液。可重復(fù)1-2次。

4.將細(xì)菌沉淀懸浮于lOOul冰預(yù)冷的溶液I中，強(qiáng)烈振蕩混勻5-10秒。

5.加入200m溶液團(tuán)，蓋嚴(yán)管蓋顛倒EP離心管5次以混合內(nèi)容物，不要

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強(qiáng)烈振蕩，放置冰上5分鐘左右。

6.加入150ul溶液回，可以將管蓋朝下溫和振蕩10秒鐘，冰水放置3-5

分鐘。

7.12000轉(zhuǎn)，4團(tuán)下離心5分鐘，取上清移至1個(gè)新EP管中。

8.加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）振蕩混勻，12000轉(zhuǎn)，4團(tuán)下離

心2分鐘，取上清移至另一管中。

9.加入2倍體積乙醇（室溫），振蕩混勻。室溫下放置2分鐘。

10.12000rpm4EI離心5分鐘，棄上清。

11.加入1ml70%乙醇振蕩漂洗沉淀，12000rpm,4國離心2分鐘，棄上

清，用消毒的濾紙小條

小心吸凈管壁上的乙醇，將管倒置放在濾紙上，室溫下蒸發(fā)痕量乙醇幾分鐘。

12.加入20-50glTE（pH8.0）（含無DNA酶的RNA酶20pig/ml）,溶解

DNA,通過電泳鑒定后，一20團(tuán)儲(chǔ)存。

4.5.注意事項(xiàng)

1.整個(gè)實(shí)驗(yàn)中變性與復(fù)性的時(shí)間應(yīng)控制好，注意冰上操作。

2.加入溶液I時(shí)可用力振蕩，而加入溶液13以后則只能夠輕輕混勻。

3.當(dāng)加入溶液團(tuán)5分鐘以后，若溶液不變粘稠（用移液嘴沾吸沒有絲狀物出

現(xiàn)）則終止實(shí)驗(yàn)。檢查使用的試劑是否正確，加量是否正確等后重做。

4.乙醇沉淀質(zhì)粒DNA時(shí)宜在室溫下進(jìn)行，并應(yīng)充分混勻。

4.5.1.方案二堿裂解離心柱法

特點(diǎn)：菌體先經(jīng)堿裂解法處理，再通過離心吸附柱，專一結(jié)合DNA,最

后洗去雜質(zhì)，高效快速提取質(zhì)粒DNA,全套操作可以在30分鐘之內(nèi)完成。

使用試劑盒可從1-5mL過夜培養(yǎng)的菌液純化得到高達(dá)20Hg的高純度質(zhì)

粒DNA（OD260/OD280=1.8-2.0）,可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、測(cè)序及PCR

等。

1,快速、步驟少，整個(gè)操作在半個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成。

2.不需要預(yù)平衡離心吸附柱。

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3.純度高，采用本試劑盒提取的質(zhì)粒0D比值在1.8-2.0之間。

4.產(chǎn)量高，每毫升過夜培養(yǎng)的細(xì)菌可以提取到2-5ug/mLo

4.6.操作方法

1.先將全部RNaseA溶液全部加入到溶液A中，搖勻后再取用，未用完的

溶液A最好在4團(tuán)保存。

2.從篩選平板上挑取單菌落至含抗生素的培養(yǎng)基中，37團(tuán)震蕩培養(yǎng)12-16小

時(shí)（搖床轉(zhuǎn)速200-300）。注意：建議使用LB培養(yǎng)基，營養(yǎng)更豐富的培

養(yǎng)基會(huì)使菌體濃度過高，超過純化系統(tǒng)處理能力而降低DNA質(zhì)量。另

外，延長培養(yǎng)時(shí)間有利于提高質(zhì)粒DNA濃度，但是菌液培養(yǎng)過長時(shí)間會(huì)

因細(xì)胞死亡、裂解而造成質(zhì)粒DNA濃度降低。

3.用1.5mL離心管收集1-4mL過夜培養(yǎng)飽和菌液，室溫12,000rpm離心

1分鐘，棄上清，再短暫離心，吸棄殘留液體。

4.加入250"L溶液A,用槍頭充分吹打使菌體重懸（此步在冰上操作效果

更佳）。注意：細(xì)胞未充分懸浮會(huì)影響后續(xù)操作，可以使用漩渦振蕩器幫

助混勻或使用吸頭吹打沉淀至完全混勻。

5.加入250UL溶液B（如果溶液B有沉淀，用前須37團(tuán)加熱溶解后冷卻

到室溫方可使用），溫和反復(fù)顛倒混勻4-6次，看到溶液變粘即可，然后

冰上放置不超過4-5分鐘。注意：此步處理不能超過5分鐘，否則DNA

的堿損傷比較嚴(yán)重。同時(shí)千萬不要?jiǎng)×艺袷帲駝t基因組DNA斷裂產(chǎn)生

的片段非常容易污染質(zhì)粒DNA。溶液B用后需要將蓋擰緊存放，否則空

氣中的二氧化碳會(huì)進(jìn)入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的NaOH,降低

其效率）。

6.加入350UL冰上預(yù)冷的溶液C,反復(fù)顛倒混勻4-6次，可見白色沉淀

物產(chǎn)生，然后冰上放置至少5分鐘。

7.12000rpm離心5分鐘，小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的

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溶液比重較大，有時(shí)候出現(xiàn)沉淀漂浮是正常現(xiàn)象，取上清時(shí)避開漂浮的沉

淀即可。靜置2分鐘以讓質(zhì)粒DNA與吸附柱充分結(jié)合，此步十分重要。

8.室溫12,000rpm離心1分鐘，棄收集管中的廢液。

9.加入500PL的通用洗柱液，室溫12,000rpm離心1分鐘，棄收集管中

廢液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要將蓋擰緊存放，否則乙醇會(huì)

揮發(fā)。

10.重復(fù)上步1次。

11.室溫12,000rpm離心1分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留

乙醇會(huì)影響DNA的后續(xù)使用（如DNA上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中）。

12.將離心吸附柱置于一個(gè)新的1.5mL塑料離心管（自備）中，加入30-100

UL65-8013預(yù)熱的DNA

洗脫液2.0,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液2.0也可以用于洗脫，

但產(chǎn)量稍微有所降低。

13.室溫12,000rpm離心1分鐘，離心管底溶液即質(zhì)粒DNA。

4.7.實(shí)驗(yàn)三瓊脂糖凝膠電泳分離DNA

一、實(shí)驗(yàn)原理

與蛋白質(zhì)分子類似，DNA分子也是兩性電離分子。在pH8.0?8.3時(shí)，堿

基幾乎不解離，磷酸基團(tuán)全部解離，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移

動(dòng)。但不同大小和構(gòu)象的DNA分子的電荷密度大致相同，在自由泳動(dòng)時(shí)，

遷移率區(qū)別很小，難以分開。采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)，發(fā)

揮其分子篩效應(yīng)，則可使分子大小和構(gòu)象不同的DNA分子遷移率出現(xiàn)較大

差異，從而達(dá)到分離目的。電泳后經(jīng)澳化乙錠染色，在紫外光照射下DNA

顯橙紅色熒光，可直接觀察判斷結(jié)果或照相。

DNA在凝膠中的遷移率與它的分子量的對(duì)數(shù)成反比，若將未知DNA的遷

移距離與已知分子大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)物的電泳遷移距離相比較，可以計(jì)算出未

知DNA片段的大小。

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二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳的原理及操作技術(shù)。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.TBE電泳緩沖液

5xTBE稱取Tris54克、硼酸27.5g,0.05mol/LEDTA（pH8.0）20ml,加水

至1000mlo應(yīng)用液為

0.5XTBE,即使用前稀釋10倍。

2.瓊脂糖（agarose,電泳級(jí)）

3.澳化乙錠（EB）1Omg/mJ

稱1克澳化乙錠溶于100ml水中，在攪拌器上攪拌數(shù)小時(shí)，待完全溶解

后，分裝，并用錫薄紙包裹，避光-20團(tuán)保存。

15.6x上樣緩沖液0.25%澳酚藍(lán)或0.25%二甲苯青40%

（W/V）蔗糖溶液

16.DNA分子量標(biāo)記物

如選用限制性內(nèi)切酶肌〃電酶切入DNA后得到的DNA分子量標(biāo)志物，其

參照片段的大小（basepair,bp）為：23130、9416、6557、4361、2332、

2027、564、125o

17.制備好的DNA樣品四、操作步驟

1.量取10ml5xTBE電泳緩沖液加蒸儲(chǔ)水至100ml配置成0.5xTBE電

泳緩沖液。根據(jù)所需濃度稱取一定量的瓊脂糖，加入0.5XTBE電泳緩沖液，

加熱熔化，注意觀察，當(dāng)心煮沸的液體溢出！當(dāng)凝膠冷卻至60回左右時(shí)按

0.5gg/ml加入漠化乙錠溶液，充分混勻。

2.先用透明膠帶封固膠托邊緣，放好梳子，然后再倒入凝膠（凝膠厚度在

5?10mm左右）。

3.在凝膠完全凝固后（室溫放置20?30分鐘），小心移去透明膠帶，將

凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液（液面超過膠面約2?3mm）。再小心取

出梳子。

4.取已制備好的DNA樣品lOgl,加入1/5倍體積的6x樣品緩沖液（即

2可），充分混勻。用移液器將樣品10川小心地加入點(diǎn)樣孔。在另一點(diǎn)樣孔

中，加入DNA分子量標(biāo)記物5pile

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5.蓋上電泳槽，打開電源并調(diào)節(jié)電壓，電壓梯度為10V/cm（通常用100

伏）。電泳40-60分鐘，直到澳酚藍(lán)移出2/3的距離（注意：DNA樣品從

負(fù)極向正極泳動(dòng)）。

6.將凝膠直接置于透射紫外燈下觀察結(jié)果，可見到發(fā)出桔紅色的電泳條

帶。如下圖

600bp

500bp

400bp

300bp

200bp

lOObp

五、注意事項(xiàng)

1.在水浴中加熱溶解瓊脂糖時(shí)應(yīng)不斷搖動(dòng)容器，并對(duì)光檢查溶解的情

況，使附于壁上的顆粒完全溶解。若在微波爐上加熱則時(shí)間不要過長，以免

引起爆沸，如水分蒸發(fā)太多，應(yīng)適當(dāng)補(bǔ)充緩沖液。

2.根據(jù)加樣量選擇合適的梳子，梳子插放的深度不宜過深，取出梳子時(shí)

應(yīng)在電泳槽的緩沖液中緩慢的水平向上取出，避免在加樣孔中產(chǎn)生氣泡。

3.加樣孔的加樣量依據(jù)DNA樣品中片段的數(shù)量及大小而定。對(duì)于

0.5cm寬的加樣孔，通常上樣量為DNA100~500ngo但上樣體積過大，可增

加鄰孔之間相互污染的可能性。

4.澳化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑并有中度毒性。使用含該染料的溶液時(shí)

須戴手套。凡沾染過澳化乙錠的器械或物品，必須經(jīng)專門處理后，才能進(jìn)行清

潔或棄去。

5.紫外光對(duì)眼睛有害，觀察時(shí)應(yīng)戴護(hù)目鏡或防護(hù)面罩。

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4.8.實(shí)驗(yàn)四提取真核細(xì)胞總RNA

一、實(shí)驗(yàn)原理

利用高濃度強(qiáng)變性劑異硫氟酸胭使細(xì)胞結(jié)構(gòu)迅速破壞，釋放出RNA分

子，通過酚/氯仿抽提即可得到總RNAo

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握RNA提取的基本方法。

2.學(xué)習(xí)如何創(chuàng)造一個(gè)無RNA酶的環(huán)境。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.無RNA酶的水的配制在三蒸水中加入0.1%DEPC,37國放置

12-16小時(shí)，高壓滅菌30分鐘，去除殘留的DEPCo

2.變性緩沖液4mol/L異硫鼠酸胭25mmol/L檸檬酸鈉

0.85%十二烷基肌氨酸鈉0.1mol/L。一流基乙醇

3.10%十二烷基肌氨酸鈉

4.2mol/LNaAC（pH4.0）

5.水飽和酚液（pH4.0）

6.Trizol試劑：

胭鹽：1.鹽酸弧；2.異硫氫酸肌;；作用：強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑；

重蒸酚作用：有機(jī)溶劑；蛋白質(zhì)變性劑；

四、操作步驟方案一異硫鼠酸胭一步法

1.取新鮮組織塊（兔肝）500mg,以液氮迅速冷凍或經(jīng)液氮保存組織，放

入研缽中研磨，邊磨邊加液氮，直至磨碎。加入變性液5ml混懸，放入勻漿

器中，冰浴下緩慢勻漿至細(xì)胞裂解，液體變黏稠。

2.在上述裂解液中，加入1/10倍體積的2moi/LNaAC、等體積的水飽

和酚、1/5體積的氯仿：異戊醇（49：1）（每加一種試劑后均應(yīng)充分振蕩混勻），

置冰浴15分鐘，40,12000r/min離心20分鐘，小心吸出上清，注意不要

吸出富含蛋白質(zhì)和DNA的中間界面。

3.加等體積的酚及1/5體積的氯仿:異戊醇（49：1）,顛倒混勻，4團(tuán)、12

000r/min離心20分鐘，小心吸取上清。

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4.加入等體積的異丙醇，一20團(tuán)沉淀1?2h。4團(tuán)、12000r/min離心20

分鐘，棄上清，沉淀用

0.3ml變性液，重新混懸至沉淀完全溶解。加等體積異丙醇，混勻，一20回1?

2h,4團(tuán)、12000r/min離心20分鐘，棄上清，用預(yù)冷的75%酒精洗滌沉淀

1?2次，開蓋干燥RNA片刻，加入20p1DEPC

水溶解，-20舊保存。

注意：切勿讓RNA過分干燥，否則將極難溶解，且測(cè)出的A260/280值

會(huì)低于1.6o

5.對(duì)最后提取的總RNA行1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。如可見28S、18S、

5S三條亮度依次遞減的清晰條帶，泳道上無明顯彌散痕跡，其中28s與18s

條帶亮度比值約為2：1,則說明總RNA提取完整無降解，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要

求。

4.8.1.28S18S5S

4.8.1.1.方案二Trizol法

Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量

從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA無蛋白和DNA污染。RNA

可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交，

Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。

1.將組織在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1mlTrizol液研

磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%o

2.研磨液室溫放置5分鐘，然后以每ImlTrizol液加入0.2ml的比例加入

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氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。冰上靜置3min12000rpm,

4團(tuán)離心15分鐘。

3.取上層水相于一新的離心管（取400gl）,按每mlTrizol液加0.5ml異

丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000rpm離心10分鐘。（此

步中注意：不要吸取任何中間層物質(zhì)，寧缺勿爛）

4.小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失。，按每mlTrizol液加入至少

1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，室溫下8000rpm,室溫離心10分

鐘。

5.小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，

否則會(huì)降低RNA的

溶解度。然后將RNA沉淀用30glDEPC-H2O溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，可

5513-60團(tuán)水溶10分鐘。

RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70團(tuán)。

五、注意事項(xiàng)

1.操作者應(yīng)戴手套與口罩，當(dāng)手套接觸了皮膚或不潔的儀器設(shè)備后，應(yīng)及

時(shí)更換。

2.提取RNA的所有試劑與玻璃器皿均應(yīng)用0.1%的DEPC水進(jìn)行配制與

處理，并在處理完后通

過高壓滅菌以除去殘留的DEPCo玻璃器皿經(jīng)高壓消毒后并不能有效滅活

RNA酶的活性，還應(yīng)置

250-300回烘烤4ho

3.最好選用新的一次性塑料用品，使用前高壓蒸汽消毒，并于常溫下烤干

備用。

4.使用液氮時(shí)要特別小心地防護(hù)，避免吸人液氮汽，避免直接的凍傷。

5.在總RNA制備過程中，移取含RNA的水相時(shí)，為減少界面DNA的

污染，不要吸取靠近界面的下層水相。

問題和處理方法：

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A.樣品裂解或勻漿處理不徹底

低得率

B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解

A.檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品不是溶于TE,而是溶于水。低離子濃度

和低pH條件下，A280值會(huì)較高。

A26O/A28O<1.B.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少。

65C.勻漿后樣品未在室溫放置5分鐘。

D.水相中混有有機(jī)相。

E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

B.樣品或提取的RNA沉淀保存于-5--20團(tuán)，未在-60--7013保存。

RNA降解

C.細(xì)胞在胰酶處理時(shí)被破壞。

D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。

4.9.實(shí)驗(yàn)五核酸的純度、濃度的測(cè)定-紫外分光光度法

一、實(shí)驗(yàn)原理

核酸具有吸收紫外光線的能力，在波長為260nm的條件下具吸收峰值，

而蛋白質(zhì)在280nm時(shí)具有吸收峰值。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，純核酸溶液A260=1.7-

2.0時(shí)，認(rèn)為已達(dá)到所要求的純度。在樣品中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)時(shí)，會(huì)使

A260/A280的比值下降。用此法測(cè)定時(shí)，只能區(qū)別核酸和蛋白質(zhì)，而無法區(qū)別

質(zhì)粒DNA與染色體DNA及RNAo

計(jì)算如下

DNA濃度(|ig/ml)=50pg/mlxA260x

稀釋倍數(shù)/1000RNA濃度(gg/ml)

=40pig/mlxA260x稀釋倍數(shù)/1000

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆蘸怂岬募兌取舛?/p>

測(cè)定的原理和方法

三、實(shí)驗(yàn)材料待

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測(cè)核酸樣品、TE

或雙蒸水四、操作

步驟

1.吸取50-100^1DNA樣品或RNA樣品，加雙蒸水或TE至3ml混勻

后，轉(zhuǎn)入紫外分光光度計(jì)的石英比色杯中。

2.紫外分光光度計(jì)先用1ml雙蒸水或TE校正零點(diǎn)。

3.在260nm和280nm分別讀出光密度值，按上述公式進(jìn)行計(jì)算含量。

五、注意事項(xiàng)

L若為DNA樣品，A260/A280比值大于1.8,說明仍存在RNA,可用

RNA酶處理樣品；小于

1.6,說明樣品中存在蛋白質(zhì)，應(yīng)用酚/氯仿抽提一次。

2.若為RNA樣品，A260/A280比值小于2.0,也應(yīng)考慮蛋白質(zhì)污染，再用酚

/氯仿抽提。

4.10.實(shí)驗(yàn)六WNA的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)

一、實(shí)驗(yàn)原理

團(tuán)型限制性內(nèi)切酶是能特異性識(shí)別雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水

解酶。其識(shí)別序列通

常為4-6bp的回文結(jié)構(gòu)，并在識(shí)別順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段，

從而可用于分析和重建

DNAo

本實(shí)驗(yàn)用國型酶Hind0（特異識(shí)別序列5'-A]AGCTT-3'）對(duì)入DNA進(jìn)

行酶切觀察限制性內(nèi)切酶的特定切割作用。

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握限制性內(nèi)切酶的工作原理。

2.理解標(biāo)準(zhǔn)酶解體系的概念、組成。

三、實(shí)驗(yàn)材料

LlOxBufferE反應(yīng)緩沖液：6mmol/LTris.ClpH7.5

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6mmol/LMgCb

lOOmmol/LNaCl

Immol/LDTT

識(shí)別序列5'...AjAGCT

2.Hind0(lu/pil)T...3'

3'...TTCGAJA...5'

3ADNA(0.5u

g/p.1)四、操作

步驟

1.建立酶解反應(yīng)體系(20gl)：

ddH2O14

uL

lOxBufferE反應(yīng)緩沖液