供生物科學、生物技術專業用

分子生物學實驗指導

1.分子生物學實驗須知

1.1.基本要求

1.進入實驗室的學生須嚴格遵守實驗室規則。

2.課前復習有關課堂講授的理論知識，并根據實驗指導認真預習實驗。

3.明確實驗目的，掌握實驗設計的原理。做到心中有數，有備而來。

4.認真對待每一次實驗，按照要求和擬定好的流程進行操作，詳細、真

實地記錄實驗中每一個細小變化。

5.實驗結束后須按照要求完成實驗報告，實驗報告書寫工整、內容翔

實、表述清晰、分析有據。

除此之外，鼓勵學生積極參與實驗準備；保持活躍的思維，積極與教師交

流實驗體會。

1.2.實驗室規則

1.保持肅靜不得喧嘩、嬉鬧，使用器物時輕拿輕放，討論問題時不得影

響他人。

2.保持整潔上實驗課時應穿工作服，書包等物品應在規定位置擺放整

齊，盡量避免被試劑等實驗用品玷污。實驗結束后，按具體要求清洗實驗用

品，所用的試劑和器材整理后放回原處，實驗廢品放人指定地方。

3.嚴格操作做實驗時嚴格遵守操作規程，仔細觀察，如實記錄。玻璃器

皿輕拿輕放，移液器吸頭、滴管專用專放，防止交叉污染。使用精密儀器必須

在教師的指導下進行，不得隨意動用。使用微量移液器前，必須熟悉微量移液

器的使用方法。

4.注意節約愛惜樣品、器材，節約試劑、水電，防止器物的破損。使用

不當所造成的損壞須酌情賠償。

5.保證安全室內嚴禁吸煙。使用有毒試劑、腐蝕性試劑等危險物品時要

嚴格按要求操作，注意防護、防止污染。如有意外立即報告。實驗完畢后，清

潔室內衛生，關好門、窗、水、電等。

1.3.實驗室常識

1.稱量固體試劑，應用硫酸紙，不可用濾紙。量筒是量器，不可用做容

器。

2.取用試劑和溶液后，應立即將瓶塞塞嚴，放回原處。取出的試劑和標

準溶液，如未用盡，切勿倒回瓶內，以免污染。

3.使用有揮發性或毒性的試劑和進行會產生有異味氣體的實驗操作時，

均應在通風柜內。試劑用后嚴密封口，盡量縮短操作時間、減少外泄。操作者

最好戴口罩、手套進行操作。

4.配制完成的試劑須及時做好標記，標簽上要寫明試劑的名稱、規格、

濃度、配制日期及配制

人等必要信息，標簽應貼在試劑瓶上1/3處。5.使用離心機前必須配

平樣品，離心時若有異常的噪音應立即停止機器，關閉電源后方可仔細查找原

因，排除故障前不得繼續使用離心機。低溫離心結束后，離心機應敞開晾至室

溫并清理凝結水后方可關閉。操作中如有樣品不慎灑入離心機的管槽或底盤，

必須及時清理后才能繼續使用。6.應在帶習老師指導下使用貴重或精密儀

器，并要嚴格遵守操作規程，如遇試劑濺污儀器，及時用潔凈紗布擦拭。發生

故障時，應立即關機，告知帶習老師，不得擅自拆修。

7.實驗用過的器皿應及時用消毒液或自來水浸泡，以便于清洗和減少試

劑對器皿的侵蝕。洗凈的器皿應倒置架上自然干燥，不能用抹布擦拭。

1.4.實驗室安全防護

1.最后離開實驗室時，一定要將室內檢查一遍，應將水、電等關好，門

窗鎖好。

2.使用電器設備時，如烤箱、恒溫水浴鍋、離心機、電泳儀等，嚴防觸

電，絕不可用濕手開關電閘和電器開關。

3.使用高壓鍋消毒時，人不得離開。易燃、易爆、腐蝕、有毒等試劑，

不能放入高壓鍋內消毒，以防發生爆炸，造成人身傷亡。

4.使用可燃物，特別是易燃物時，如乙酸、丙酮、乙醇等，應特別小

心。

5.凡使用腐蝕性試劑如濃酸、濃堿等，必須極為小心地操作，防止濺

出，一旦有灑出，立即用自來水沖洗。

6.廢液應按要求妥善處理。

2.實驗常用儀器介紹

2.1.微量移液器

微量移液器是一種在一定容量范圍內可隨意調節的精密取液裝置，基本原

理是依靠裝置內活塞的上下移動，推動按鈕帶動推動桿使活塞向下移動，排除

活塞腔內的氣體；松手后，活塞在復位彈簧的作用下恢復原位，從而完成一次

吸液過程。常用的有Eppendorf公司各種規格的的微量移液器，其他還有美

國TOMOS公司、德國BRAND公司等產品。目前使用的移液器有整支可消

毒移液器、半支可消毒移液器、電動移液器、PCR專用移液器。此外還有大容

量移液器、電子連續移液器、瓶口移液器、電子滴定器等不同種類的移液器。

微量移液器的標準操作適用的液體有水、緩沖液、稀釋的鹽溶液和酸堿溶

液，其操作步驟第一步按到第一檔，垂直進入液面幾毫米，第二步緩慢松開控

制按鈕，否則液體進入吸頭過速會導致液體倒吸人移液器內部吸人體積減少，

第三步打出液體時貼壁并有一定角度，先按到第一檔，稍微停頓幾秒后，待剩

余液體聚集后，再按到第二檔將剩余液體全部壓出。

在使用移液器的過程中，應注意以下幾個方面：

1）移液器應放在專用的架子上，不得隨意放置；

2）移液時選用適當型號的移液器，不得用大量程的移液器移取小體積樣

品;

3）吸不同的液體時應更換吸頭，防止交叉污染影響實驗結果；

4）新吸頭在使用前可吸排溶液幾次，浸漬吸頭以消除測量誤差；

5）移液器吸液后嚴禁倒置、平放，以免液體倒流損壞活塞；

6）長時間不用或剛取出的新移液器應輕輕按壓按鈕數次，再進行正常使

用。

2.2.離心機

離心機是實驗中最常用的一類儀器，主要用于細胞的收集和分離、基因片

段的分離以及其它生物樣品的分離制備。離心機依據轉速不同，可分為低速離

心機、高速離心機和超速離心機，轉速少于6000r/min的為低速離心機，低于

25000r/min的為高速離心機，大于30000r/min的是超速離心機；依據溫度控

制不同，又可分為冷凍離心機和普通離心機，冷凍離心機帶有制冷系統，能夠

控制溫度最低至-20C,普通離心機不帶制冷系統。

離心機在每次接通電源使用前，應仔細檢查所用的轉頭及離心管有無裂

紋，或嚴重腐蝕現象，如有應立即更換；保持離心機腔體內清潔，防積水，防

有顆粒狀雜物；配轉頭系統時，必須在儀器斷電條件下操作；儀器加速或減速

過程中，出現短時振動屬正常現象，不必關斷電源開關；若出現中途斷電，切

勿馬上開門，必須等電機停轉后方可開門；離心時樣品應預先平衡，使用離心

筒離心時離心筒與樣品應同時平衡，揮發性或腐蝕性液體離心時，應使用帶蓋

的離心管，并確保液體不外漏，以免腐蝕機腔。

2.3.電泳裝置

電泳技術是實驗中不可缺少的重要分析手段。所謂電泳，是指帶電粒子在

電場中的運動，不同物質由于所帶電荷及分子量的不同，因此在電場中運動速

度不同，根據這一特征，應用電泳法便可以對不同物質進行定性或定量分析，

或將一定混合物進行組份分析或單個組份提取制備，這在臨床檢驗或實驗研究

中具有極其重要的意義。

電泳一般分為自由界面電泳和區帶電泳兩大類，自由界面電泳不需支持

物，而區帶電泳則需用各種類型的物質作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋

酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠薄層等，分子生物學領域

中最常用的是瓊脂糖凝膠電泳。

電泳裝置是實現電泳分析的儀器，一般由電泳儀、電泳槽、檢測單元等組

成。它主要用于檢測、鑒定各種生物大分子的純度、含量及描述它們的特征，

還可以用于樣品的分離、純化、回收和濃縮。

電泳儀作為電泳時的外加電源設備，它既能輸出穩定的電流，又能輸出穩

定的電壓，起到在被分離樣品兩端加外接電場的作用；電泳槽是電泳的主要部

件，是樣品分離的場所；電泳儀在通電進入工作狀態后，禁止人體接觸電極、

電泳物，也不能到電泳槽內取放東西，如需要應先斷電，以免觸電。同時要求

儀器必須有良好接地端，以防漏電；在通電后，不要臨時增加或撥除輸出導線

插頭，以防短路現象發生，使用過程中發現異常現象，如較大噪音、放電或異

常氣味，須立即切斷電源，進行檢修，以免發生意外事故。

2.4.生物安全柜

生物安全柜是為操作具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實

驗室環境以及實驗材料，使其避免暴露于可能產生的感染性氣溶膠和濺出物而

設計的。

根據生物安全防護水平的差異，生物安全柜也可以分為I級、II級和III級

三種類型。I級生物安全柜可保護工作人員和環境而不保護樣品。氣流原理和

實驗室通風櫥一樣，不同之處在于排氣口安裝有HEPA過濾器。所有類型的

生物安全柜都在排氣和進氣口使用HEPA過濾器。H級生物安全柜是目前臨

床分子診斷實驗室應用最為廣泛的柜型，II級生物安全柜的一個獨特之處在于

經過HEPA過濾器過濾的垂直層流氣流從安全柜頂部吹下，被稱作“下沉氣

流”，下沉氣流不斷吹過安全柜工作區域，以保護柜中的試驗品不被外界塵埃

或細菌污染。按照《中華人民共和國醫藥行業標準YY0569-2005生物安全

柜》中的規定，II級生物安全柜依照入口氣流風速、排氣方式和循環方式可分

為4個級別：A1型，A2型；B1型和B2型。所有的H級生物安全柜都可提

供工作人員、環境和樣品的三重保護。III級生物安全柜柜體完全氣密，100%

全排放式，工作人員通過連接在柜體的手套進行操作，適用于高風險的病原生

物研究，如進行SARS、埃博拉病毒相關的實驗等。

另外，需要了解生物安全柜與通風柜和超凈工作臺的區別。通風柜和超凈

工作臺不屬于生物安全柜，不可使用在涉及微生物材料的實驗或生產過程中。

通風柜（通風櫥）是為在化學實驗過程中清除腐蝕性化學氣體和有毒煙霧而設

計的，不能有效清除微生物介質；放置在通風柜內的微生物樣品會散播到柜

外，污染實驗室環境。

超凈工作臺是為了保護試驗品或樣品而設計的，通過吹過工作區域的空氣

防止試驗品或樣品受到工作區域外粉塵或細菌的污染。一旦微生物樣品放置于

工作區域，層流空氣將把帶有微生物介質的空氣吹向前臺工作人員而產生危

險。

在實驗中，被分類為可能涉及或者產生有害生物物質的操作過程都應該在

生物安全柜內進行，一般使用13級的生物安全柜。

2.5.消毒滅菌設備

實驗中所用的培養基、試劑、器皿、實驗用具等，應嚴格滅菌。常用的滅

菌設備主要包括濾膜過濾器和高壓蒸汽滅菌器等。

濾膜過濾器的過濾原理主要是分子篩作用，大于膜孔的顆粒被截留（篩除）

在膜的表面，小于膜孔的顆粒通過膜孔。在實驗中常用來制備抗生素濾液。

高壓蒸汽滅菌器是利用飽和壓力蒸汽對物品進行迅速而可靠的消毒，適用

于對醫療器械、敷料、

玻璃器皿、培養基等進行消毒滅菌。在使用過程中應注意：滅菌前應先完

全排除鍋內冷空氣，使鍋內全部充滿水蒸汽時，滅菌才能徹底；滅菌后當壓力

降到零后，才能開蓋；培養基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止

培養基中的成分變質或效力降低，不能隨意延長時間。

2.6.水純化設備

實驗中對實驗用水的質量要求非常高，器皿經洗凈后都需要雙蒸水漂洗數

次，試劑的配制要求用三蒸水甚至超純水，這就要求實驗室必須配備純水裝

置。目前較常用的水純化裝置有石英玻璃雙蒸儲器、離子交換器以及超純水系

統等。

超純水系統是采用預處理、反滲透技術、超純化處理等方法，將水中的導

電介質幾乎完全去除，

又將水中不解離的膠體物質、氣體及有機物均去除至很低程度的水處理設

備。所得水可用于高效液相色譜（HPLC）、原子吸收及發射光譜分析、質譜

分析等。

2.7.PCR儀

簡單地說，PCR就是利用耐熱DNA聚合酶對特定基因在體外的大量合

成。PCR儀是體外擴增基因最常用的設備，主要由機械自動裝置、溫度循環系

統及附屬設備等構成。根據DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀

分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀等種

類。

普通的PCR儀是做定性分析和擴增基因片段，熒光定量PCR儀比普通的

PCR儀多了熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，其不僅可對核酸進行擴

增，而且可通過TaqMan熒光探針，SYBRGreen熒光染料等方法對擴增后的

樣品進行定量測定。且一次可同時檢測數百個樣品量，樣品到達域值水平所經

歷的循環數稱為Ct值（限制點的循環數），可以用來計算未知樣品的濃度。

2.8.紫外觀察儀及凝膠成像分析系統

主要用于瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳后結果的觀察和記錄。

2.8.1.紫外觀察儀

DNA片段經電泳后肉眼是觀察不到的，經由與漠化乙錠等熒光染料結合，

在紫外燈的照射下會產生熒光，從而可以利用來紫外觀察儀來進行定性和半定

量觀察。用于核酸分析的紫外觀察儀常采用254nm、300nm、365nm等幾個波

長，在此波長范圍內，DNA與漠化乙錠結合物對紫外光吸收較強，從而誘導

產生590nm波長的橙紅色熒光。產生的熒光強度與DNA的數量相關。

2.8.2.凝膠成像分析系統

通過紫外觀察儀只能對凝膠電泳圖譜進行觀察，如果需要記錄結果，可以

借助凝膠成像系統拍攝成像。該系統具有強大的圖像采集、檢測和分析能力，

可以對DNA、RNA、蛋白質等電泳凝膠以及各類雜交，放射自顯影結果進行

拍攝、處理、分析和保存。

2.9.其他常用儀器設備

2.9.1.紫外/可見分光光度計

紫外/可見分光光度計廣泛應用臨床檢驗等領域的教學和科研工作中，特別

適合對各種液態物質進行定量及定性分析。其應用波長范圍為200~400nm的

紫外光區、400~850nm的可見光區。主要由輻射源（光源）、色散系統、檢測

系統、吸收池、數據處理機、自動記錄器及顯示器等部件組成。臨床實驗中常

用紫外260nm、280nm檢測核酸的含量及純度。

2.9.2.二氧化碳培養箱

二氧化碳培養箱是通過在培養箱箱體內模擬形成一個類似細胞或組織在生

物體內的生長環境，如穩定的溫度（37℃）＞穩定的C02水平（5%）、恒定

的酸堿度（pH值：7.2-74）、較高的相對飽和濕度（95%）,來對細胞或組織

進行體外培養的一種裝置。其廣泛應用于細胞、組織培養和某些特殊微生物的

培養。

2.9.3.分析天平

分析天平是實驗中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其

使用方法，是獲得可靠實驗結果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天

平、阻尼分析天平及電子分析天平等，需要根據實驗精確度和量程要求的不同

進行選擇。在使用天平的過程中，要注意以下幾個方面：

1.天平應放置在牢固平穩的水泥或木質臺面上，稱量室內要求清潔、干

燥及較恒定的溫度，同時應避免光線直接照射到天平上；

2.稱量時應從側門取放物質，讀數時應關閉箱門以免空氣流動引起天平

擺動；

3.電子分析天平若長時間不使用，則應定時通電預熱，每周一次，每次

預熱2h,以確保儀器始終處于良好使用狀態；

4.天平箱內應放置吸潮劑（如硅膠），當吸潮劑吸水變色，應立即高溫

烘烤更換，以確保吸濕性能;

5.揮發性、腐蝕性、強酸強堿類物質應盛于帶蓋稱量瓶內稱量，防止腐

蝕天平。

2.9.4.恒溫水浴箱

實驗中，經常需要在某一恒定的溫度下進行，有的需要恒溫水浴過夜。此

時需要用到恒溫水浴箱。使用時先加蒸儲水于水箱內，再接通電源，然后調節

至所需溫度，禁止干燒。當設置溫度值超過水溫時，加熱指示燈亮，表明加熱

器已開始工作；在水溫達到所需水溫時，恒溫指示燈亮，加熱指示燈熄滅，此

時加熱器停止工作。由于水箱內水是靜止的，故水溫上下之間有一定差異，需

要經過反復加熱轉換后，水溫才能達到恒定的狀態。

3.實驗一基因組DNA的分離純化

核酸作為生命信息的主要載體，是分子生物學重要的分析研究對象。核酸

包括核糖核酸和脫氧核糖核酸兩種分子，在細胞中均與蛋白質結合。真核生物

染色體DNA為雙鏈線性分子；原核生物"染色體"DNA為雙鏈環狀分子。從生

物體中提取分離特定種類的核酸分子，通常是分子生物學研究的首要任務和工

作基礎。核酸的分離和提取是分子生物學研究中重要的技術，核酸樣品質量的

好壞直接關系到實驗的成敗。

基因組是細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子，包含

了該物種生長、發育、繁殖等各項生理活動的幾乎全部信息，對基因組的結

構、組成以及表達調控的研究是至關重要的，而研究的起點就是要獲得純度

高，產率好，且不含蛋白質、糖類、酚、氯仿等污染基因組以用于下游分析。

基因組DNA來源不同、性質不同以及用途不同，其分離方法也不盡相

同，本實驗以人體外周血細胞和原核生物細菌基因組抽提為例，介紹制備基因

組樣品的常用方法。

3.1.第一部分大腸桿菌DNA的分離純化

3.1.1.實驗原理

DNA提取的方法很多，根據實驗用途可繁可簡。苯酚抽提法為經典方法，

是利用核酸與蛋白質對苯酚和氯仿的變性作用具有的不同反應性分離核酸與蛋

白質。用苯酚抽提和離心以后，樣品中的蛋白質成分被變性，或者變成不溶性

物質，而核酸則溶解在水相溶液中。苯酚抽提通常采用苯酚、氯仿的混合溶

液。這種混合液a.相對減少酚的用量，并最終可除去殘留的酚，減輕對DNA

的破壞；b.使蛋白變性更徹底；c.抑制核酸酶的活性；隨后用氯仿：異戊醇抽

提，將殘留苯酚從含核酸的水相中除去。

3.1.2.實驗目的

1.掌握酚-氯仿抽提法的原理。

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2.熟練操作酚抽提法分離DNA的實驗步驟。

3.理解主要試劑的作用。

3.1.3.實驗材料

1.酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）酚的重蒸儲和平衡：

①酚易氧化，其氧化產物對DNA有破壞作用，使用前需要將酚進行重蒸

儲。苯酚16513熔化后，用空氣冷凝管進行重蒸儲，183團收集純凈酚。由

于酚是中強酸，使用前要進行酚的平衡。方法是在純凈酚中加入等體積的

Imol/LTris.Cl緩沖液（PH8.0）并加入固體Tris,激烈震蕩使酚的PH值平

衡到8.0,保存到棕色瓶中，并加入8-羥基喳寧；表面覆蓋一層

0.1mol/LTris.Cl（PH8.0）防止氧化。

②8-羥基口奎寧的作用：a.抗氧化；b.指示顏色（若黃色的酚變色為紅色則表

明產生了酚的氧化物），易于觀察分層情況。

2.TES緩沖液（PH8.0）：lOmmol/LTris.ClPH8.0

Immol/LEDTAPH8.0

O.lmmol/LNaCl

3.TES-蔗糖緩沖液（蔗糖：增加溶液粘度，維持滲透壓，防止

DNA受機械剪切力作用而降解。）

4.溶菌酶（50mg/ml，低溫保存,溶菌酶是糖背水解酶，水解菌體細

胞壁的主要化學成分肽聚糖中的供1,4糖昔鍵，因而具有溶菌作

用）。

5.10%SDS溶液（當室溫低于2013時,需要加熱使其完全溶解后使

用）

6.氯仿/異戊醇（24/1,異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽

提過程中泡沫的產生。同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水

相、中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。）

7.3mol/LNaAC

8.無水乙醇（-20團）及70%乙醇四、操作步驟

1.細菌培養物：取單個大腸桿菌菌落于LB培養基中，37國振蕩培養

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過夜。

2.吸取已培養好的大腸桿菌液8.0ml于lOmlEP管中,4000rpm離心

5分鐘，棄去上清，加入5ml的TES液，強烈振蕩洗菌體1-2次，如上

述方法收集菌體。

3.棄去TES液后，管底菌體大約200位，加入預冷TES-蔗糖液約

1ml,在冰浴中充分混勻，加入溶菌酶（50mg/ml）40m至終濃度

2mg/ml,EDTA（0.25mol/L）溶液0.5ml至終濃度為0.1mol/L,充分混勻

后，放置在冰浴上5分鐘，充分抑制DNA酶的活性。

4.加入10%SDS溶液0.2ml,輕輕混勻，于37團裂解30分鐘。在

37團裂解后呈現為粘稠狀液體。若裂解效果不好，將液體分裝到兩個

1.5mlEP管中加入20mg/ml的蛋白酶K20uL,7013恒溫金屬浴上再消化

10分鐘。

注意！SDS在室溫小于2013時會出現白色沉淀，使用前需要3713水浴預

熱。

5.將試管內的裂解液分裝在兩個L5mlEP管中，約0.6ml。取其中

一管進行下一步試驗，加入等體積（0.6ml）的酚/氯仿/異戊醇

（25/24/1）進行抽提。具體操作是：溫和顛倒EP管以混勻兩相液面，使

酚和水兩相在靜置時呈不分層的乳白色混懸液。然后于12000rpm,離心5

分鐘。注意！①由于酚/氯仿有腐蝕性，務必戴手套操作此步驟；②使用

專用的刻度吸管而不要用微量移液器加樣。

6.小心取出EP管，將上層水相（含DNA）轉移入另一個1.5mlEP

管中（小心不要吸出水相下的蛋白質沉淀），加入等體積的氯仿：異戊醇

（24：1）,抽提一次，操作同前。抽提后于

12000rpm,離心5分鐘。（這一步可視具體情況而做取舍）

7.吸取水相于另一EP管中，加入1/10倍體積的NaAC,和2.5倍

體積的冰乙醇（無水乙醇

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-20因冷凍儲存），顛倒混勻（觀察DNA絮狀物沉淀）。

8.12000rpm,離心2分鐘，棄去乙醇，加入70%的乙醇輕輕振蕩洗

滌DNA沉淀，12000rpm,

離心2分鐘。棄去70%的乙醇。

9.室溫開蓋或真空凍干揮發殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥，

視DNA提取量加入20-40|jl

TE于DNA沉淀中，溶解DNA,DNA完全溶解通常需12-24小時，-2013保

存。

3.2.第二部分真核細胞基因組DNA的分離純化（離心柱層析

法）

3.2.1.實驗原理

真核生物基因組DNA的分離純化在技術路線設計上與原核生物

DNA分離純化沒有本質區別，但真核生物基因組更龐大，細胞核內染色

體DNA占總DNA的95%以上，這些染色體由組蛋白和雙鏈DNA形

成的核小體組成。所以提取真核生物基因組DNA就必須增加解聚核小體

這一步。

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本次實驗使用了臨床更常見的離心柱層析法去分QIAampDNAMicroProcedure

離DNA,其設計思路和原理是①收集抗凝全血

后利用紅細胞裂解液高效降解紅細胞，離心后收

集有核細胞。②使用含SDS的結合液裂解有核

細胞的同時使用蛋白酶K解聚核小體，③基

因組DNA在高鹽離子濃度下選擇性吸附在離心

BindDNA

柱內硅基質膜上④使用抑制物去除液和70%乙

醇（漂洗液）將蛋白、細胞代謝物等雜質去除。

⑤最后低鹽洗脫液將純凈的基因Wash

DNA從硅基質膜洗脫。

3.2.2.實驗材料

1.結合液CB（細胞裂解緩沖液）：

lOmmol/ETris.Cl（PH8.0）0.1mmol/LEDTA

20jig/mlRNA酶0.5-1.0%SDSReady-to-useDNA

2.蛋白酶K20mg/ml

3.離心吸附柱

4.抑制物去除液IR

5.漂洗液（70%乙醇）

6.洗脫緩沖液EB

7.異丙醇

3.2.3.操作步驟

結合液CB

?加入異丙醉?＞吸附柱吸附

雷白施K處理

洗脫液洗脫漂洗液漂洗抑制物去除

4.抗凝血使用前溫和顛倒混勻3~5次，取200口L抗凝全血加入EP管

中。

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5.加入20UL蛋白酶K,充分混勻，加入200UL結合液CB立刻充分

混勻（渦旋混勻器或是加樣槍吹打）10秒。

6.70團金屬浴5分鐘。如果室溫放置，DNA產量將降低10~20%。

7.冰浴1分鐘冷卻后，加入100UL異丙醇，渦旋混勻器充分混均10

秒，此時溶液可能出現沉淀。一定要確保離心管底的液體被震蕩起來。

8.小心將上一步混合液轉移吸附柱AC（吸附柱外套一個收集管）中，避

免觸及中間的白膜。

室溫放置2分鐘，12000rpm室溫離心2分鐘，棄穿透液（收集管中

的廢液）。

9.加500HL抑制物去除液IR到吸附柱中，12000rpm室溫離心1分

鐘，棄穿透液。

10.加500HL漂洗液到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心1分鐘，棄穿

透液。

11.加500UL漂洗液到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心1分鐘，棄穿

透液。

12.將吸附柱放回到空收集管中，不加任何試劑12000rpm室溫再離心2

分鐘。此步十分重要，否則殘留的乙醇會污染DNAo

13.室溫放置半分鐘使殘留乙醇揮發。

14.將離心吸附柱轉移到一新的1.5mL塑料離心管中（做好標記），加入

50ULDNA洗脫液（預熱到70國），室溫放置離心吸附柱1-2分鐘。

12000rpm室溫離心1分鐘，離心管中溶液即為DNA樣品，可以立即

使用或存放于-2013冰箱待用。

3.3.注意事項

1.為保證核酸的完整性和純度，實驗中盡量簡化操作步驟，縮短過

程，以減少有害因素破壞。

2.減少化學因素對核酸的降解：過酸和過堿的環境都可引起DNA的

一級結構的破壞，所以實驗中的緩沖液要求使用PH8.0的Tris.Cl緩沖

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液。

3.減少物理因素對核酸的破壞：分離過程中的離心、吸取、轉移等，

產生的機械剪切力和高溫都對DNA的一級結構有破壞作用。所以實驗中的

振蕩混勻動作要溫和輕柔，要求低溫的操作要在冰浴上進行。

4.減少生物因素對核酸的破壞：防止核酸的生物降解主要針對DNA

酶對DNA有降解作用，在實驗中要使用DTA來抑制DNA酶的活性。

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4.實驗二堿裂解法制備質粒DNA

4.1.實驗原理

從細菌中制備質粒DNA的方法眾多，目前常用的有堿裂解法等。堿裂解

法抽提效果良好，既經濟且得率又較高，制備的質粒DNA可以用于酶切、連

接與轉化。

堿裂解法的原理：基于染色體DNA與質粒DNA變性與復性的差異而

達到分離目的。在pH高達12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，

雙螺旋結構解開而變性，質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉

合環狀的兩條互補鏈不會完全分離。當以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調節其

pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色

體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構。通過離心，染色體DNA與不穩

定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。

4.2.實驗目的

1.掌握堿裂解法的原理。

2.熟練操作堿裂解法制備質粒DNA的實驗步驟。

3.理解主要試劑的作用。

4.3.實驗材料

1.轉化好的質粒菌株(細菌菌液)

2.STE：O.lmol/LNaCl

lOmmol/LTris.Cl(pH8.O)

1mmol/LEDTA

3.溶液國：50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris.Cl(pH8.0)

10mmol/LEDTA

4.溶液回：0.2mol/LNaOH

1%SDS

加抽提液時，該系統的pH就高達12.6,因而促使染色體DNA與質粒

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DNA的變性。SDS是離子型表面活性劑，它可以溶解細胞膜上的脂質與蛋

白，因溶解膜蛋白而破壞細胞膜、解聚細胞中的核蛋白，還能與蛋白質結合成

為復合物，使蛋白質變性沉淀下來。

5.溶液團：5mol/LKAC60ml

冰醋酸15ml

水28.5ml

pH4.8的KAc溶液是為了把pH12.6的抽提液調節至中性，使變性的質粒

DNA能夠復性，并能穩定存在。高鹽3moi/LKAc有利于變性的大分子染色

體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物的凝聚而沉淀。染色體DNA因為中和

了核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復合物作

用后，形成鉀鹽形式復合物，使沉淀更完全。

6.酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）

7.乙醇

8.TE（PH8.0）（含無DNA酶的RNA酶20ng/ml）

4.3.1.方案一堿裂解聯合酚抽提法

4.4.操作步驟

1.增殖細菌，擴增質粒

將保存的質粒菌株挑取一環，接種于含相應抗生素的LB固體培養基平

板上。37國培養過液（約

16h）；挑取瓊脂培養板上的單菌落，移至200mlLB培養液中（含相應的抗

生素）強烈搖蕩過夜約

16小時。

此步驟已由實驗準備老師完成。

2.取1.4ml培養液移至EP管中，12000rpm,離心1分鐘，棄上清。

3.加入1mlSTE溶液強烈振蕩懸浮菌體沉淀，以漂洗菌體，在

12000rpm,離心1分鐘回收菌體。

離心后，去盡上清液。可重復1-2次。

4.將細菌沉淀懸浮于lOOul冰預冷的溶液I中，強烈振蕩混勻5-10秒。

5.加入200m溶液團，蓋嚴管蓋顛倒EP離心管5次以混合內容物，不要

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強烈振蕩，放置冰上5分鐘左右。

6.加入150ul溶液回，可以將管蓋朝下溫和振蕩10秒鐘，冰水放置3-5

分鐘。

7.12000轉，4團下離心5分鐘，取上清移至1個新EP管中。

8.加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25/24/1）振蕩混勻，12000轉，4團下離

心2分鐘，取上清移至另一管中。

9.加入2倍體積乙醇（室溫），振蕩混勻。室溫下放置2分鐘。

10.12000rpm4EI離心5分鐘，棄上清。

11.加入1ml70%乙醇振蕩漂洗沉淀，12000rpm,4國離心2分鐘，棄上

清，用消毒的濾紙小條

小心吸凈管壁上的乙醇，將管倒置放在濾紙上，室溫下蒸發痕量乙醇幾分鐘。

12.加入20-50glTE（pH8.0）（含無DNA酶的RNA酶20pig/ml）,溶解

DNA,通過電泳鑒定后，一20團儲存。

4.5.注意事項

1.整個實驗中變性與復性的時間應控制好，注意冰上操作。

2.加入溶液I時可用力振蕩，而加入溶液13以后則只能夠輕輕混勻。

3.當加入溶液團5分鐘以后，若溶液不變粘稠（用移液嘴沾吸沒有絲狀物出

現）則終止實驗。檢查使用的試劑是否正確，加量是否正確等后重做。

4.乙醇沉淀質粒DNA時宜在室溫下進行，并應充分混勻。

4.5.1.方案二堿裂解離心柱法

特點：菌體先經堿裂解法處理，再通過離心吸附柱，專一結合DNA,最

后洗去雜質，高效快速提取質粒DNA,全套操作可以在30分鐘之內完成。

使用試劑盒可從1-5mL過夜培養的菌液純化得到高達20Hg的高純度質

粒DNA（OD260/OD280=1.8-2.0）,可以直接用于酶切、轉化、測序及PCR

等。

1,快速、步驟少，整個操作在半個小時之內完成。

2.不需要預平衡離心吸附柱。

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3.純度高，采用本試劑盒提取的質粒0D比值在1.8-2.0之間。

4.產量高，每毫升過夜培養的細菌可以提取到2-5ug/mLo

4.6.操作方法

1.先將全部RNaseA溶液全部加入到溶液A中，搖勻后再取用，未用完的

溶液A最好在4團保存。

2.從篩選平板上挑取單菌落至含抗生素的培養基中，37團震蕩培養12-16小

時（搖床轉速200-300）。注意：建議使用LB培養基，營養更豐富的培

養基會使菌體濃度過高，超過純化系統處理能力而降低DNA質量。另

外，延長培養時間有利于提高質粒DNA濃度，但是菌液培養過長時間會

因細胞死亡、裂解而造成質粒DNA濃度降低。

3.用1.5mL離心管收集1-4mL過夜培養飽和菌液，室溫12,000rpm離心

1分鐘，棄上清，再短暫離心，吸棄殘留液體。

4.加入250"L溶液A,用槍頭充分吹打使菌體重懸（此步在冰上操作效果

更佳）。注意：細胞未充分懸浮會影響后續操作，可以使用漩渦振蕩器幫

助混勻或使用吸頭吹打沉淀至完全混勻。

5.加入250UL溶液B（如果溶液B有沉淀，用前須37團加熱溶解后冷卻

到室溫方可使用），溫和反復顛倒混勻4-6次，看到溶液變粘即可，然后

冰上放置不超過4-5分鐘。注意：此步處理不能超過5分鐘，否則DNA

的堿損傷比較嚴重。同時千萬不要劇烈振蕩，否則基因組DNA斷裂產生

的片段非常容易污染質粒DNA。溶液B用后需要將蓋擰緊存放，否則空

氣中的二氧化碳會進入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的NaOH,降低

其效率）。

6.加入350UL冰上預冷的溶液C,反復顛倒混勻4-6次，可見白色沉淀

物產生，然后冰上放置至少5分鐘。

7.12000rpm離心5分鐘，小心將上清液轉移到離心吸附柱中。由于此時的

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溶液比重較大，有時候出現沉淀漂浮是正常現象，取上清時避開漂浮的沉

淀即可。靜置2分鐘以讓質粒DNA與吸附柱充分結合，此步十分重要。

8.室溫12,000rpm離心1分鐘，棄收集管中的廢液。

9.加入500PL的通用洗柱液，室溫12,000rpm離心1分鐘，棄收集管中

廢液。注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要將蓋擰緊存放，否則乙醇會

揮發。

10.重復上步1次。

11.室溫12,000rpm離心1分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留

乙醇會影響DNA的后續使用（如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中）。

12.將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管（自備）中，加入30-100

UL65-8013預熱的DNA

洗脫液2.0,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液2.0也可以用于洗脫，

但產量稍微有所降低。

13.室溫12,000rpm離心1分鐘，離心管底溶液即質粒DNA。

4.7.實驗三瓊脂糖凝膠電泳分離DNA

一、實驗原理

與蛋白質分子類似，DNA分子也是兩性電離分子。在pH8.0?8.3時，堿

基幾乎不解離，磷酸基團全部解離，DNA分子帶負電荷，在電場中向正極移

動。但不同大小和構象的DNA分子的電荷密度大致相同，在自由泳動時，

遷移率區別很小，難以分開。采用適當濃度的瓊脂糖凝膠作為支持介質，發

揮其分子篩效應，則可使分子大小和構象不同的DNA分子遷移率出現較大

差異，從而達到分離目的。電泳后經澳化乙錠染色，在紫外光照射下DNA

顯橙紅色熒光，可直接觀察判斷結果或照相。

DNA在凝膠中的遷移率與它的分子量的對數成反比，若將未知DNA的遷

移距離與已知分子大小的DNA標準物的電泳遷移距離相比較，可以計算出未

知DNA片段的大小。

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二、實驗目的掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理及操作技術。

三、實驗材料

1.TBE電泳緩沖液

5xTBE稱取Tris54克、硼酸27.5g,0.05mol/LEDTA（pH8.0）20ml,加水

至1000mlo應用液為

0.5XTBE,即使用前稀釋10倍。

2.瓊脂糖（agarose,電泳級）

3.澳化乙錠（EB）1Omg/mJ

稱1克澳化乙錠溶于100ml水中，在攪拌器上攪拌數小時，待完全溶解

后，分裝，并用錫薄紙包裹，避光-20團保存。

15.6x上樣緩沖液0.25%澳酚藍或0.25%二甲苯青40%

（W/V）蔗糖溶液

16.DNA分子量標記物

如選用限制性內切酶肌〃電酶切入DNA后得到的DNA分子量標志物，其

參照片段的大小（basepair,bp）為：23130、9416、6557、4361、2332、

2027、564、125o

17.制備好的DNA樣品四、操作步驟

1.量取10ml5xTBE電泳緩沖液加蒸儲水至100ml配置成0.5xTBE電

泳緩沖液。根據所需濃度稱取一定量的瓊脂糖，加入0.5XTBE電泳緩沖液，

加熱熔化，注意觀察，當心煮沸的液體溢出！當凝膠冷卻至60回左右時按

0.5gg/ml加入漠化乙錠溶液，充分混勻。

2.先用透明膠帶封固膠托邊緣，放好梳子，然后再倒入凝膠（凝膠厚度在

5?10mm左右）。

3.在凝膠完全凝固后（室溫放置20?30分鐘），小心移去透明膠帶，將

凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液（液面超過膠面約2?3mm）。再小心取

出梳子。

4.取已制備好的DNA樣品lOgl,加入1/5倍體積的6x樣品緩沖液（即

2可），充分混勻。用移液器將樣品10川小心地加入點樣孔。在另一點樣孔

中，加入DNA分子量標記物5pile

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5.蓋上電泳槽，打開電源并調節電壓，電壓梯度為10V/cm（通常用100

伏）。電泳40-60分鐘，直到澳酚藍移出2/3的距離（注意：DNA樣品從

負極向正極泳動）。

6.將凝膠直接置于透射紫外燈下觀察結果，可見到發出桔紅色的電泳條

帶。如下圖

600bp

500bp

400bp

300bp

200bp

lOObp

五、注意事項

1.在水浴中加熱溶解瓊脂糖時應不斷搖動容器，并對光檢查溶解的情

況，使附于壁上的顆粒完全溶解。若在微波爐上加熱則時間不要過長，以免

引起爆沸，如水分蒸發太多，應適當補充緩沖液。

2.根據加樣量選擇合適的梳子，梳子插放的深度不宜過深，取出梳子時

應在電泳槽的緩沖液中緩慢的水平向上取出，避免在加樣孔中產生氣泡。

3.加樣孔的加樣量依據DNA樣品中片段的數量及大小而定。對于

0.5cm寬的加樣孔，通常上樣量為DNA100~500ngo但上樣體積過大，可增

加鄰孔之間相互污染的可能性。

4.澳化乙錠是一種強烈的誘變劑并有中度毒性。使用含該染料的溶液時

須戴手套。凡沾染過澳化乙錠的器械或物品，必須經專門處理后，才能進行清

潔或棄去。

5.紫外光對眼睛有害，觀察時應戴護目鏡或防護面罩。

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4.8.實驗四提取真核細胞總RNA

一、實驗原理

利用高濃度強變性劑異硫氟酸胭使細胞結構迅速破壞，釋放出RNA分

子，通過酚/氯仿抽提即可得到總RNAo

二、實驗目的

1.掌握RNA提取的基本方法。

2.學習如何創造一個無RNA酶的環境。

三、實驗材料

1.無RNA酶的水的配制在三蒸水中加入0.1%DEPC,37國放置

12-16小時，高壓滅菌30分鐘，去除殘留的DEPCo

2.變性緩沖液4mol/L異硫鼠酸胭25mmol/L檸檬酸鈉

0.85%十二烷基肌氨酸鈉0.1mol/L。一流基乙醇

3.10%十二烷基肌氨酸鈉

4.2mol/LNaAC（pH4.0）

5.水飽和酚液（pH4.0）

6.Trizol試劑：

胭鹽：1.鹽酸弧；2.異硫氫酸肌;；作用：強烈的蛋白質變性劑；

重蒸酚作用：有機溶劑；蛋白質變性劑；

四、操作步驟方案一異硫鼠酸胭一步法

1.取新鮮組織塊（兔肝）500mg,以液氮迅速冷凍或經液氮保存組織，放

入研缽中研磨，邊磨邊加液氮，直至磨碎。加入變性液5ml混懸，放入勻漿

器中，冰浴下緩慢勻漿至細胞裂解，液體變黏稠。

2.在上述裂解液中，加入1/10倍體積的2moi/LNaAC、等體積的水飽

和酚、1/5體積的氯仿：異戊醇（49：1）（每加一種試劑后均應充分振蕩混勻），

置冰浴15分鐘，40,12000r/min離心20分鐘，小心吸出上清，注意不要

吸出富含蛋白質和DNA的中間界面。

3.加等體積的酚及1/5體積的氯仿:異戊醇（49：1）,顛倒混勻，4團、12

000r/min離心20分鐘，小心吸取上清。

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4.加入等體積的異丙醇，一20團沉淀1?2h。4團、12000r/min離心20

分鐘，棄上清，沉淀用

0.3ml變性液，重新混懸至沉淀完全溶解。加等體積異丙醇，混勻，一20回1?

2h,4團、12000r/min離心20分鐘，棄上清，用預冷的75%酒精洗滌沉淀

1?2次，開蓋干燥RNA片刻，加入20p1DEPC

水溶解，-20舊保存。

注意：切勿讓RNA過分干燥，否則將極難溶解，且測出的A260/280值

會低于1.6o

5.對最后提取的總RNA行1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。如可見28S、18S、

5S三條亮度依次遞減的清晰條帶，泳道上無明顯彌散痕跡，其中28s與18s

條帶亮度比值約為2：1,則說明總RNA提取完整無降解，滿足后續實驗要

求。

4.8.1.28S18S5S

4.8.1.1.方案二Trizol法

Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量

從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA無蛋白和DNA污染。RNA

可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，

Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。

1.將組織在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1mlTrizol液研

磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%o

2.研磨液室溫放置5分鐘，然后以每ImlTrizol液加入0.2ml的比例加入

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氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。冰上靜置3min12000rpm,

4團離心15分鐘。

3.取上層水相于一新的離心管（取400gl）,按每mlTrizol液加0.5ml異

丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000rpm離心10分鐘。（此

步中注意：不要吸取任何中間層物質，寧缺勿爛）

4.小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失。，按每mlTrizol液加入至少

1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，室溫下8000rpm,室溫離心10分

鐘。

5.小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，

否則會降低RNA的

溶解度。然后將RNA沉淀用30glDEPC-H2O溶解。如發現沉淀難溶，可

5513-60團水溶10分鐘。

RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70團。

五、注意事項

1.操作者應戴手套與口罩，當手套接觸了皮膚或不潔的儀器設備后，應及

時更換。

2.提取RNA的所有試劑與玻璃器皿均應用0.1%的DEPC水進行配制與

處理，并在處理完后通

過高壓滅菌以除去殘留的DEPCo玻璃器皿經高壓消毒后并不能有效滅活

RNA酶的活性，還應置

250-300回烘烤4ho

3.最好選用新的一次性塑料用品，使用前高壓蒸汽消毒，并于常溫下烤干

備用。

4.使用液氮時要特別小心地防護，避免吸人液氮汽，避免直接的凍傷。

5.在總RNA制備過程中，移取含RNA的水相時，為減少界面DNA的

污染，不要吸取靠近界面的下層水相。

問題和處理方法：

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A.樣品裂解或勻漿處理不徹底

低得率

B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解

A.檢測吸光度時，RNA樣品不是溶于TE,而是溶于水。低離子濃度

和低pH條件下，A280值會較高。

A26O/A28O<1.B.樣品勻漿時加的試劑量太少。

65C.勻漿后樣品未在室溫放置5分鐘。

D.水相中混有有機相。

E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。

A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

B.樣品或提取的RNA沉淀保存于-5--20團，未在-60--7013保存。

RNA降解

C.細胞在胰酶處理時被破壞。

D.溶液或離心管未經RNase去除處理。

4.9.實驗五核酸的純度、濃度的測定-紫外分光光度法

一、實驗原理

核酸具有吸收紫外光線的能力，在波長為260nm的條件下具吸收峰值，

而蛋白質在280nm時具有吸收峰值。根據經驗數據，純核酸溶液A260=1.7-

2.0時，認為已達到所要求的純度。在樣品中含有蛋白質等雜質時，會使

A260/A280的比值下降。用此法測定時，只能區別核酸和蛋白質，而無法區別

質粒DNA與染色體DNA及RNAo

計算如下

DNA濃度(|ig/ml)=50pg/mlxA260x

稀釋倍數/1000RNA濃度(gg/ml)

=40pig/mlxA260x稀釋倍數/1000

二、實驗目的掌握核酸的純度、濃度

測定的原理和方法

三、實驗材料待

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測核酸樣品、TE

或雙蒸水四、操作

步驟

1.吸取50-100^1DNA樣品或RNA樣品，加雙蒸水或TE至3ml混勻

后，轉入紫外分光光度計的石英比色杯中。

2.紫外分光光度計先用1ml雙蒸水或TE校正零點。

3.在260nm和280nm分別讀出光密度值，按上述公式進行計算含量。

五、注意事項

L若為DNA樣品，A260/A280比值大于1.8,說明仍存在RNA,可用

RNA酶處理樣品；小于

1.6,說明樣品中存在蛋白質，應用酚/氯仿抽提一次。

2.若為RNA樣品，A260/A280比值小于2.0,也應考慮蛋白質污染，再用酚

/氯仿抽提。

4.10.實驗六WNA的限制性內切酶反應

一、實驗原理

團型限制性內切酶是能特異性識別雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水

解酶。其識別序列通

常為4-6bp的回文結構，并在識別順序內進行切割，產生特異的DNA片段，

從而可用于分析和重建

DNAo

本實驗用國型酶Hind0（特異識別序列5'-A]AGCTT-3'）對入DNA進

行酶切觀察限制性內切酶的特定切割作用。

二、實驗目的

1.掌握限制性內切酶的工作原理。

2.理解標準酶解體系的概念、組成。

三、實驗材料

LlOxBufferE反應緩沖液：6mmol/LTris.ClpH7.5

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6mmol/LMgCb

lOOmmol/LNaCl

Immol/LDTT

識別序列5'...AjAGCT

2.Hind0(lu/pil)T...3'

3'...TTCGAJA...5'

3ADNA(0.5u

g/p.1)四、操作

步驟

1.建立酶解反應體系(20gl)：

ddH2O14

uL

lOxBufferE反應緩沖液