EGCG對高糖誘導的大鼠系膜細胞增殖及炎癥因子調控的影響【摘要】目的探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯對高糖誘導的大鼠系膜細胞增殖及炎癥因子分泌的影響。方法通過體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞進行研究。設立低糖對照組和高糖組，分別培養(yǎng)12、24、48h。CCK細胞計數法檢測不同濃度EGCG作用下大鼠系膜細胞的OD值，判斷細胞增殖情況。采用ELISA方法檢測培養(yǎng)細胞上清中MCP1和ICAM1蛋白濃度。結果EGCG能抑制高糖時系膜細胞的增殖活性，其抑制作用呈劑量和時間依賴的方式。系膜細胞處于高糖環(huán)境時，MCP1和ICAM1蛋白表達上調，低濃度的EGCG對MCP1和ICAM1蛋白的抑制效果不明顯，高濃度的EGCG能明顯抑制MCP1和ICAM1的分泌。結論在體外高糖條件下，大鼠系膜細胞在48h內以增殖為主，一定濃度的EGCG可抑制其增殖。EGCG可在蛋白水平抑制高糖刺激的大鼠系膜細胞MCP1和ICAM1的分泌。

【關鍵詞】糖尿病腎病；系膜細胞；單核細胞趨化蛋白1；細胞間粘附分子1；表沒食子兒茶素沒食子酸酯

ABSTRACT：ObjectiveToexploretheeffectsofepigallocatechin3gallate(EGCG)onproliferationofmesangialcellsandthecontentsofMonocytechemoattractantprotein1(MCP1)andintercellularadhesionmolecule1(ICAM1)inhighglucoseculturedratmesangialcells.MethodsRatmesangialcellsweredividedintocontrolgroup(lowglucosemmol·L-1withoutEGCG)andexperimentgroups(highglucose25mmol·L-1withEGCG(0,100,200,400μg·L-1),eachgroupwasincubatedfor12,24,48hours.ThegrowthinhibitingeffectofEGCGonmesangialcellswasmeasuredbyCCK8methods.ThelevelsofMCP1andICAM1insupernatantweredeterminedbyenzymelinkedimmunosorbantassay(ELISA).ResultsTheresultsshowedthathyperglycemiastimulatedmesangialcellproliferationandreleaseofMCP1andICAM1.EGCGcouldinhibitcellgrowthinadoseandtimedependentmanner.Inaddition,highconcentrationsofEGCGcouldalsodecreasethelevelsofMCP1andICAM1insupernatant.ConclusionEGCGcansignificantlyinhibitproliferationandsecretionofMCP1andICAM1inhighglucoseinducedratmesangialcells.

KEYWORDS:Diabeticnephropathy;Mesangialcell;Monocytechemoattractantprotein1;Intercellularadhesionmolecule1;Epigallocatechin3gallate

糖尿病腎病是糖尿病特有的慢性微血管并發(fā)癥，其病變周圍常有大量單核/巨噬細胞浸潤，后者與細胞粘附分子及化學趨化因子有關。SassyPrigent等[1]證實在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型中，腎小球表達過量的細胞間粘附分子1(ICAM1)、VCAM1及單核細胞趨化蛋白1(MCP1)等細胞因子，導致單核巨噬細胞浸潤，隨后出現IV型膠原鏈mRNA增加，系膜細胞面積增加及腎小球肥大。說明糖尿病狀態(tài)下腎組織中粘附分子、趨化因子導致早期單核/巨噬細胞浸潤在致腎小球硬化中起著重要作用。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯為綠茶中的一種有效成分。茶多酚具有清除自由基、抗脂質過氧化、抗突變、抗腫瘤、抗炎、抗病毒和增強機體免疫功能等多種生物學效應，對肥胖、糖尿病、腫瘤等多種疾病均有明顯的藥理作用。本實驗采用高糖環(huán)境下培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞，探討EGCG干預后對系膜細胞增殖及炎癥因子ICAM1和MCP1蛋白影響，初步探索EGCG對糖尿病腎病的保護機制。

1材料和方法

材料

大鼠腎系膜細胞株HBZY1，培養(yǎng)于含10％胎牛血清的正常糖DMEM中，常規(guī)置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育，用％胰蛋白酶消化傳代，每周傳代2～3次。EGCG購自Sigma公司，純度98%；正常葡萄糖及高糖DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；FCS購自天津正江科技有限公司；CCK試劑購自上海同仁化學研究所；大鼠MCP1和ICAM1試劑盒購自美國TPI公司。酶標儀為美國產品；細胞分析儀/CASY細胞計數儀為德國CASY公司產品。

方法

CCK8法檢測細胞增殖活力

取對數生長期系膜細胞，以2000個/孔鋪于96孔板，待細胞貼壁后，吸去原有DMEM培養(yǎng)液，換為1%FCS培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h使所有細胞的生長同步化。隨即分5組：①NG組，②HG組，③E100組，HG＋EGCG，④E200組，HG＋EGCG，⑤E400組，HG＋EGCG。空白對照組只加低糖培養(yǎng)基而不加細胞。各組分別培養(yǎng)12、24、48h，終止前2h在每個孔內加入10μl的CCK8試劑。應用SpectrafluorPlus光度儀在450nm處測定吸光度。以空白對照組調零，每組設3個復孔。吸光度的改變反應細胞活力的變化。

檢測細胞上清中MCP1和ICAM1含量

雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞上清中MCP1和ICAM1含量，按試劑盒說明書操作。每項指標設6孔，根據標準品的標準曲線求出相應的含量，為排除細胞數目對上清中MCP1和ICAM1含量的影響，對每孔細胞數目進行校正，按每孔細胞數為1×106個來校正所得數據。

統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，率的比較用χ2檢驗，計量數據采用均數±標準差(±s)，進行方差分析和Studentt檢驗，以為顯著性標準。

2結果

CCK8法檢測的各組細胞增殖活力比較

培養(yǎng)48h以內，高糖可促進系膜細胞的增殖(與對照組相比，)。作用早期(12h)EGCG對細胞生長的抑制作用不顯著；隨作用時間的延長(24h及48h)，各濃度組EGCG的抑制作用明顯增強。對于同一濃度的EGCG而言，隨著作用時間的延長抑制率升高；對于同一時間而言(24h及48h)隨EGCG濃度的升高，抑制作用加強。說明EGCG對細胞生長的抑制作用具有時間、劑量依賴效應。見表1。表1不同濃度、時間的EGCG作用于各組大鼠系膜細胞的OD值比較與NG組比較，*、**；與HG組比較，△、△△

ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液MCP1的含量比較

本研究顯示，在實驗的48h內高糖可刺激系膜細胞MCP1的合成，在24h時高糖刺激下系膜細胞MCP1的合成達高峰，培養(yǎng)至48hMCP1的分泌已無明顯增加。低濃度的EGCG(100μg·L-1)對高糖誘導下系膜細胞MCP1的合成無明顯抑制作用。而隨著EGCG濃度的增加，400μg·L-1的EGCG干預組可明顯抑制MCP1的活性。見表2。表2各組細胞培養(yǎng)上清液中MCP1的含量比較

ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液ICAM1蛋白的含量比較

高糖刺激24h時，HG組上清液中ICAM1的濃度較NG組明顯升高()；400μg·L-1的EGCG干預組ICAM1的濃度明顯低于HG組()。低濃度EGCG組與HG組相比差別無顯著性。見表3。表3各組細胞培養(yǎng)上清液中ICAM1的含量比較與NG組比較，*、**；與HG組比較，△、△△

3討論

文獻報道體外高糖環(huán)境對大鼠系膜細胞的生長具有雙重作用，在培養(yǎng)的24～48h內可刺激細胞增殖，培養(yǎng)72～96h則抑制細胞增殖，促使細胞發(fā)生肥大，這種現象的產生可能與細胞內葡萄糖代謝增加而細胞外滲透壓未增加有關。我們將高糖(25mmol·L-1)作用于系膜細胞，發(fā)現在48h內高糖促進系膜細胞增殖。本實驗中，EGCG和高糖共同培養(yǎng)系膜細胞12、24、48h后，發(fā)現EGCG對高糖誘導的系膜細胞增殖有明顯的抑制作用，在一定范圍內濃度越高，抑制作用越強。

DN早期表現為腎小球系膜細胞增生、小管間質擴張、腎小球系膜區(qū)和小管間質細胞外基質積聚。近年來的研究資料顯示，細胞外基質的聚集與單核/巨噬細胞在腎組織的廣泛浸潤有關。而MCP1是單核/巨噬細胞特異性的趨化因子，MCP1介導的單核細胞在腎臟的聚集和活化對DN的發(fā)生、發(fā)展起重要的作用。有研究顯示[4～6]，高糖有直接刺激腎小球系膜細胞MCP1mRNA表達和蛋白合成、分泌增高的作用。在DN發(fā)展過程中，ICAM1增強白細胞的粘附，造成相應毛細血管阻塞和內皮細胞損傷，滲出的白細胞和受損的內皮細胞分泌一些細胞因子使ICAM1的表達增多，加重內皮細胞的損傷，造成血管通透性增強，蛋白漏出，形成蛋白尿；漏出的蛋白又刺激細胞外基質的積聚，促進了腎小球硬化的發(fā)生。

EGCG在機體的生物學效應與抑制炎癥因子是密不可分的[7～9]。因此，本實驗探討了炎癥因子ICAM1和MCP1是否參與EGCG對糖尿病腎病的保護機制，發(fā)現在高糖環(huán)境下ICAM1和MCP1蛋白表達上調。而用EGCG進行干預后，均可抑制ICAM1和MCP1蛋白的分泌，其機制可能是[7～9]：①由于抑制IL6、IL1、TNFα等細胞因子活性，降低腎小球內皮細胞、系膜細胞、腎小管上皮細胞ICAM1和MCP1的表達;②通過抑制AP1途徑，抑制細胞因子誘導腎臟細胞合成和分泌ICAM1和MCP1;③直接抑制巨噬細胞活性。綜上所述，EGCG在抑制系膜細胞增殖的同時，直接作用于腎組織發(fā)揮保護作用，其保護作用至少部分是通過抑制ICAM1和MCP1的產生，從而減輕腎臟炎癥反應實現的，這可能為DN的治療提供了新的思路。同時也證實了炎癥是DN發(fā)生發(fā)展中的一個重要因素，抑制ICAM1和MCP1的表達和活性則有望減輕腎臟損害，而EGCG作為茶葉中的一種有效成分，具有安全性高、副作用小等優(yōu)點，用于阻斷這一病理過程、延緩DN的發(fā)生發(fā)展將是值得研究的一個方向。

【參考文獻】

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IhmCG,ParkJK,HongSP,ethighglucoseconcentrationstimulatestheexpressionofmonocytechemotacticpeptid