實驗酶切和連接第一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二DNA克?。ㄖ亟M）技術的基本程序包括：（1）獲得外源DNA：外源DNA是進行DNA重組的目的DNA片段，一般采用DNA聚合酶鏈式反應(PCR)或逆轉錄-DNA聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、基因組文庫或cDNA文庫篩選等方法獲得。（2）載體的構建或選擇：分子生物學中用的載體是指能在特定宿主細胞中自主復制的DNA分子，例如細菌的質粒、噬菌體、病毒等，常用的載體一般為質粒；根據需要可直接從公司購買合適的載體，也可以自己構建。第二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二（3）連接：目的DNA片段和適當載體的連接,一般采用核酸內切酶分別消化DNA片段和載體，使它們的末端能夠連接到一起構成重組DNA分子。由于所用內切酶的切割特點不同，產生三種連接方式：粘端連接、平端連接和不相配的連接。（4）轉化：將連接的重組DNA產物導入合適的宿主細胞，使其在宿主細胞內復制擴增或表達，賦予宿主細胞新的生物特征。（5）克隆化：重組DNA分子轉化大腸桿菌后，在平板培養基上篩選出單個菌落，此菌落經過酶切鑒定或雜交實驗后確定為含重組DNA分子的單克隆。第三頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二DNA克隆

DNA克隆的技術路線大致包括以下幾個程序：①分離制備待克隆的DNA片段(目的DNA)。②選擇合適的載體。③在體外連接目的DNA和載體。④將重組DNA分子轉入宿主細胞，并篩選和鑒定陽性重組子。⑤擴增陽性重組子。第四頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二實驗九質粒酶切與鑒定第五頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二一.實驗目的了解質粒酶切鑒定原理。掌握核酸片斷回收純化操作技術3.學習核酸片斷連接的原理和方法第六頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二二.實驗原理(質粒酶切與鑒定)使用限制性內切酶獲得粘性末端的目的基因核酸限制性內切酶是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發現，它們的功能猶似高等功物的免疫系統，用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲限制性內切酶以內切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，產生的ＤＮＡ片段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。第七頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二

限制性內切酶是一種工具酶，這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA分子上的特異核苷酸順序的能力，能在這個特異性核苷酸序列內，切斷DNA的雙鏈，形成一定長度和順序DNA片段。如：NotI的識別序列和切口是：

限制性內切酶切口酶切片段電泳凝膠的區帶數,酶切片段大小第八頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二三.儀器和試劑1．主要儀器

（1）1.5mL塑料離心管

（2）微量加樣器10μL、100μL、1000μL各一支

（3）臺式高速離心機（20000r/min）

（4）水浴鍋（5）電泳儀，電泳槽

2．材料

大腸桿菌DH5α質粒第九頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二3．試劑

（1）限制性內切酶NotI及相應的緩沖液；

（2）電泳試劑1xTBE緩沖液

EB染色液(0.5μg/mL)。第十頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二四.操作步驟1.反應體系的建立：

⑴在一無菌1.5mlEppendorf管中加入：

無菌雙蒸水10.5μl

10×酶切緩沖液2μl

質粒DNA(100ng/μl)7μl

NotⅠ(10U/μl)0.5μl

總體積為20μl

⑵輕輕混勻，12000rpm離心5sec。第十一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二操作注意事項：

1.吸樣量一定要準確

2.加樣按體積從大到小，最后加酶

3.要求在冰上操作，并充分混勻，

4.開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內面，以防污染。

5.樣品在37℃與65℃保溫時，將離心管蓋嚴，以防水進入管內造成實驗失敗。2.37℃水浴1h。3.將Eppendorf管置65℃水浴中10min，通過加熱使酶失活以終止反應。

第十二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二4．DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

（1）水平放置膠槽，放入合適的梳子。（2）1%瓊脂糖凝膠的制備：稱取0.3g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入30mLTBE緩沖液，微波爐加熱融解，待冷卻至65℃左右加入2ulEB，將凝膠液緩慢倒入膠槽，室溫下靜置30min，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，將膠板放在電泳槽中使用。

（3）加樣：用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內。第十三頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二（4）電泳

120V電泳，當指示劑前沿移動至距離膠板1~2cm處，停止電泳。

（5）觀察

紫外等下觀察瓊脂糖凝膠中的DNA條帶。

第十四頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二實驗十DNA片斷的回收純化及連接第十五頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二一.實驗原理(目的片段的回收與連接)

載體及目的DNA片斷經酶切后，必須電泳分離后回收目的片斷。回收的方法傳統的方法：基于降低凝膠的熔點以釋放DNA，然后通過酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收。商品化的試劑盒：采用凝膠裂解液（如含有降低熔點的NaI）融化凝膠釋放DNA后，采用特殊的硅膠樹脂吸附DNA后，用洗液洗去雜質，最后用洗脫液洗出DNA。

第十六頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二DNA片段之間的連接主要是在DNA連接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3’羥基和5’磷酸之間形成共價結合的磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA裂口連接起來,需ATP。第十七頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二連接酶：把基因連在一起第十八頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二二.儀器和試劑1.儀器：離心機，水浴鍋，電泳儀2.材料：待回收DNA樣品

3.試劑：

1)DNA回收試劑盒

2）T4DNA連接酶

3）10XT4DNAligasebuffer：Tris-HCl（pH7.6）；MgCl2；DTT；ATP。第十九頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二三.操作步驟DNA酶切條帶回收（北京艾德萊生物膠回收試劑盒）1)用干凈無菌的刀片在365nm紫外光下切割目的DNA條帶，放入1.5mLEp管中，積累凝膠至大約300ul。2)將目標片段切下的膠轉移到預先稱重的1.5mleppendorf管中，稱取凝膠重量。按照0.1g=100ul估算凝膠體積，3)加入3倍體積的溶膠液DD。4)56℃水浴10min或直到凝膠完全溶解。每隔2min搖蕩一次。

第二十頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二5）取回收試劑盒中吸附柱EC裝在2ml收集管上，將上一步所得溶液加入吸附柱EC中。室溫放置1min,

12000rpm離心1min,棄去收集管中平衡液，將柱子套回；6）加入700ul漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm離心1min，棄去廢液；7）加入500ul漂洗液WB(乙醇已溶解)，12000rpm離心1min，棄去廢液；8）將吸附柱EC裝回收集管上，12000rpm離心2min甩干柱子中殘液；9）將吸附柱轉移到1個干凈的1.5mleppendorf管中，加入50ul洗脫緩沖液EB至柱子底部膜中央，室溫放置2min,12000rpm離心1min，收集離心液為洗脫的DNA.第二十一頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二2.片斷與載體連接反應1）連接反應液的制備：加入含有質粒載體的DNA溶液：2μl；插入片段DNA溶液：5μl；

10XT4DNAligasebuffer：1μl；

T4DNA連接酶：0.5μl

滅菌的雙蒸水：1.5μl

總體積為10μl

渦旋后混合均勻，渦旋至無氣泡。2）16℃反應過夜。第二十二頁，共二十四頁，編輯于2023年，星期二注意：DNA純化回收后,電泳檢測應為單一的條帶。如果切膠過程中不慎帶上雜帶,那么回收后電泳結果可能會出現兩條以上的帶。這時可以進行重復純化回收。2.當連接反應難以進行時，可以適當延長反應時間。