中國藥典高效液相色譜詳解演示文稿當前第1頁\共有24頁\編于星期六\20點（優選）中國藥典高效液相色譜當前第2頁\共有24頁\編于星期六\20點一、對儀器的一般要求和色譜條件所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢定并符合有關規定

3儀器包括：儲液器泵進樣器

色譜柱

檢測器當前第3頁\共有24頁\編于星期六\20點色譜柱反相色譜系統使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。4當前第4頁\共有24頁\編于星期六\20點色譜柱填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含炭量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應選擇孔徑在15nm以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。普通分析柱的填充劑粒徑一般在3~10μm之間。粒徑更小（約2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內徑約2mm）。5當前第5頁\共有24頁\編于星期六\20點注意以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃流動相的PH值應控制在2~8的。當PH大于8時，可使載體硅膠溶解；當PH小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用PH值大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、有機-無機雜化填充劑當需使用PH值小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑6當前第6頁\共有24頁\編于星期六\20點檢測器最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器、其他常見的檢測器有熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發光散射檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。紫外、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；示差折光檢測器和蒸發光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發光散檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與供試品的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。7當前第7頁\共有24頁\編于星期六\20點檢測器紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與供試品溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發光散射檢測器響應值與供試品溶液的濃度通常呈指數關系，故進行計算時，一般需經對數轉換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應符合紫外—可見分光光度法（附錄VA）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發鹽組分的流動相。8當前第8頁\共有24頁\編于星期六\20點二極管陣列檢測器（diodearraydetector，DAD）當前第9頁\共有24頁\編于星期六\20點特點：在任一時間內，均可同時得到物質在不同波長下的吸收情況，即三維圖譜當前第10頁\共有24頁\編于星期六\20點多組分混合物的三維圖譜當前第11頁\共有24頁\編于星期六\20點當前第12頁\共有24頁\編于星期六\20點當前第13頁\共有24頁\編于星期六\20點流動相反相色譜系統的流動相首選甲醇-水系統（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統），如經試用不適合時，再選用其他溶劑系統。應盡可能少用含有緩沖液的流動相由于C18鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。14當前第14頁\共有24頁\編于星期六\20點二、系統適用性試驗

色譜系統的適用性試驗通包括理論板數分離度重復性拖尾因子分離度和重復性是尤為重要。15當前第15頁\共有24頁\編于星期六\20點色譜柱的理論板數(n)用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測組分或內標物質的理論板數。在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2）,按n＝16（tR/w）2或n=5.54(tR/Wh/2)2計算色譜柱的理論板數。16當前第16頁\共有24頁\編于星期六\20點分離度(R)

用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當的方法降解，通過測定待測組分與某一降解產物的分離度，對色譜系統進行評價與控制。17當前第17頁\共有24頁\編于星期六\20點無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。除另外有規定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大于1.5。分離度的計算公式為：2(tR2－tR1)2(tR2－tR1)R＝───────或R＝──────────W1＋W21.70（W1，h/2＋W2,h/2）式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1、W2及W1，h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬。當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結果為準。18當前第18頁\共有24頁\編于星期六\20點重復性用于評價連續進樣中，色譜系統響應值的重復性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0％；采用內標法時，通常配制相當于80％、100％和120％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差也應不大于2.0％。19當前第19頁\共有24頁\編于星期六\20點拖尾因子（T）用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規定。拖尾因子計算公式為：W0.05hT＝──────2d1式中W0.05h為0.05峰高處的峰寬；d1為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規定外，峰高法定量時T應在0.95～1.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確測量。必要時，應在各品種項下對拖尾因子作出規定。20當前第20頁\共有24頁\編于星期六\20點測定法

(1)內標法按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：As／Cs校正因子（f）＝─────AR／CR式中As為內標物質的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高；Cs為內標物質的濃度；CR為對照品的濃度。21當前第21頁\共有24頁\編于星期六\20點再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：Ax含量（Cx）＝f·─────As內／Cs內式中Ax為供試品（或其雜質）峰面積或峰高；Cx為供試品（或其雜質）的濃度；As內為內標物質的峰面積或峰高；Cs內為內標物質的濃度；f為較正因子。22當前第22頁\共有24頁\編于星期六\20點（2）外標法：按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量含量（cX）=cR(AX/AR)式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中成分或雜質含量時，以定量環或或自動進樣器