體外培養細胞的生長與增殖過程第一頁，共111頁。4.1概述4.1.1發展歷史4.1.2動物細胞的特點4.1.3動物細胞與組織培養的概念4.1.4動物細胞的體外培養生長特性第二頁，共111頁。4.1.1發展歷史1、動物細胞（組織）培養技術的起源：19世紀所應用的胚胎學技術。動物細胞培養的奠基人：美國生物學家哈里森（1907年）用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養法將蛙胚神經組織培養在淋巴液中，存活幾周，有細胞突起的生長過程。先驅者中法國學者卡勒爾：設計卡氏培養瓶自1923年用于培養雞胚的心肌組織成功以后，已使多種動物組織培養獲得成功。第三頁，共111頁。4.1.1發展歷史2、20世紀40年代以后：動物組織培養的科學家們研究重點集中在培養基方面。3、20世紀80年代以后：隨著基因工程技術和細胞融合技術的迅速發展，已能把特定的外源基因通過PCR技術擴增幾千倍，并可轉染到細胞內，使其得到高質量的表達。第四頁，共111頁。4.1.1發展歷史4、近年：淋巴細胞雜交瘤技術，使動物細胞培養進入了一個新領域。雜交瘤細胞能在體外懸浮情況下大量繁殖并產生單克隆抗體。隨著基因重組和單克隆抗體技術的發展，動物細胞組織培養展現出越來越可觀的工業化前景。第五頁，共111頁。4.1.2動物細胞的特點（一）動物細胞之間的連接特點：

1.緊密連接：牢固、無間隙。

2.間隙連接：2-3nm間隙。

3.隔壁連接：20-30nm間隔，有橫隔。

4.中間連接：無橫隔、透明，間隔20-30nm。

5.橋粒連接：有間隙，有纖維形成的特殊結構。第六頁，共111頁。4.1.2動物細胞的特點（二）動物細胞的培養特點：

1.動物細胞比微生物細胞大，無細胞壁。

2.動物細胞倍增時間長，生長緩慢，易受污染。

3.培養過程需氧量少，對機械攪拌或剪切力敏感。

4.動物細胞間主要以聚集體形式存在。

5.原代細胞一般繁殖50代左右即退化死亡。第七頁，共111頁。4.1.3動物細胞與組織培養的概念動物細胞與組織培養：從動物體內取出細胞或組織，模擬體內的生理環境條件，在無菌、適宜溫度和豐富營養條件下，使離體細胞或組織生存、生長并維持結構和功能的一門技術。是動物細胞工程的重要技術基礎。第八頁，共111頁。4.1.4體外培養細胞的分型貼附和非貼附生長：

1.貼附型細胞：細胞間相互接觸；細胞與細胞外基質（培養器皿壁或載體）結合。多數細胞屬貼附型細胞。

2.非貼附型細胞：此類細胞體外生長不必貼壁，可在培養液中懸浮生長。如：白細胞、淋巴細胞，腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉化細胞系等。第九頁，共111頁。貼附型細胞(anchorage-dependentcell)哺乳動物大多數細胞必須附著固體表面生長。當細胞布滿表面（單層）時，即停止生長。若取走一片細胞，存留的細胞就會沿著表面生長而重新布滿表面。從生長表面脫落而進入液體的細胞通常不再生長而逐漸退化。（為單層附壁培養）按培養細胞的形態，可分四類：

1.成纖維型細胞(fibroblast)外形與體內成纖維細胞相似，梭形或不規則形。細胞貼壁后呈梭形，胞質外伸出2-3個長短不同的突起，成放射狀，胞間疏松。起源于中胚層的細胞在體外培養時一般表現為這種形式。第十頁，共111頁。貼附型細胞2.上皮型細胞(epithelium)：泛指形狀上類似上皮細胞的細胞。特點：扁平狀，形態較為規則。胞間緊密，單層貼壁。起源于內、外胚層的細胞體外培養時如此。3.游走型細胞(wandering)：類似巨噬細胞樣的特征。外形不規則。分散生長，不連接成片，成群落；通常伸出偽足和突起，貼壁位置不固定，呈活躍的游走和變形運動。單核巨噬細胞系細胞體外培養常如此：顆粒性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞。第十一頁，共111頁。貼附型細胞4.多形型細胞(polymorphic)：形態上不規則（難以確定其形態）的細胞。細胞胞體略呈多角形；細胞胞突細長形；類似絲狀偽足。如神經元和神經膠質細胞第十二頁，共111頁。影響細胞形態的主要因素細胞的來源不同；生理條件不同，功能狀態不同；血清成分、培養基成分、添加成分、培養基的酸堿度、氣象環境、溫度等不同。如HeLa細胞原本是一種上皮型癌細胞，但若在過酸或過堿的條件下培養，可以呈現梭形，當酸堿適中時又可以恢復上皮型特征。第十三頁，共111頁。非貼附型細胞或懸浮型細胞（suspendcell）此類細胞體外生長不必貼壁，可在培養液中懸浮生長。如：白細胞、淋巴細胞，腫瘤細胞和雜交瘤細胞以及轉化細胞系等。

形態：始終為球狀

優點：細胞密度高，培養效率高，易操作控制，便于大規模生長。有些細胞既可懸浮，也可以貼附。第十四頁，共111頁。4.1.5體外培養細胞的生長特性1、貼附：細胞接種后很快形成偽足，與底物點接觸，細胞逐漸呈放射狀伸展，細胞體中心變扁平狀。影響因素：低鈣不利于細胞伸展；低溫和培養液流動過快妨礙貼附；生物因素：表皮生長因子（刺激神經膠質細胞的皺褶活動）、成纖維細胞生長因子（減少3T3細胞的扁平度）。第十五頁，共111頁。4.1.5體外培養細胞的生長特性2、接觸抑制（contactinhibition）：正常細胞移動、靠近而接觸時，細胞不再移動且停止接觸區質膜的皺褶活動和細胞運動以及細胞的重疊生長。腫瘤（癌）細胞無此現象。3、密度抑制（densityinhibition）：只要營養充分，接觸抑制的細胞仍能分裂增殖。但細胞密度進一步加大、營養減少、代謝產物增多時，（因營養和代謝物的影響）細胞分裂停止，出現接觸抑制。第十六頁，共111頁。4.1.6體外培養細胞的生長與增殖過程

、細胞系的生長過程：培養的細胞持續生長的時間有限，最終自行停止生長。細胞的種類、性狀、原供體的年齡決定其生存時間長短。如：人胚成纖維細胞存活一年、傳30~50代相當于150~300個細胞周期）；供體是成體或衰老個體時則存活更短；肝、腎細胞僅能傳幾代或十幾代。獲永生性或惡性轉化（遺傳性改變）生存期則發生變化。第十七頁，共111頁。4.1.6.1細胞系的生長過程：

1、原代培養期（primaryculturephage)：從取出體內組織接種培養到第一次傳代的時期。1~4周。細胞：移動活躍、分裂但不旺盛、相似于（也能代表）體內組織、藥物測試的好對象。

2、傳代期（passagephase）：原代細胞生長一定時間后，將其分開接種到多個培養瓶中繼續培養的過程稱傳代。

細胞系（cellline）：傳代細胞分裂增殖旺盛、能保持一致的二倍體核型，稱細胞系。細胞的代數=轉接的次數。每一代中細胞分裂3~6次。第十八頁，共111頁。4.1.6.1細胞系的生長過程：3、衰亡期（senescencephase）：細胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。細胞可發生自發轉化，其標志之一：獲永久增殖能力而成連續細胞系（株）。連續細胞系（株）：主要發生在傳代期。

細胞系（cellline）：第一次傳代培養后的細胞。

細胞株（cellstrain）：在經過生物學鑒定的細胞系中，通過單細胞培養或篩選法，由單細胞增殖形成的細胞群。亞株（substrain）：？第十九頁，共111頁。體外培養細胞系的生長曲線024681012141618

t∕周接種培養第一次傳代衰老死亡傳代期細胞系連續細胞系原代培養轉化傳代間隔細胞濃度的指數第二十頁，共111頁。4.1.6.2每代（群體）細胞的生長過程每代細胞要經過四個生長階段：1、潛伏期（latentphase）：接種——懸浮——貼附——不馬上分裂（潛伏）。原（初）代培養細胞：24~96h；傳代和腫瘤細胞：6~24h。2、對數生長期（logarthmicgrowthphase）：分裂旺盛、分裂相增多（其數量標志分裂的旺盛程度）。細胞分裂指數（mitoticindex,MI）:MI=(分裂相個數∕1000個細胞)×100%。初代MI低，傳代和腫瘤細胞系MI高達3~5%。第二十一頁，共111頁。4.1.6.2每代（群體）細胞的生長過程

在理想的環境下，細胞處于較恒定的生長分裂狀況，其生長速率：dN∕dt＝

μN

（N——時間t時的細胞個數；μ——細胞比生長速率：在對數生長期，群體細胞數增殖一倍所需要的時間，以時間T表示）積分得：T＝㏑2∕μ

(時間T表示細胞比生長速率)

此時期細胞以指數形式增長繁殖。持續3~5天。

第二十二頁，共111頁。4.1.6.2每代（群體）細胞的生長過程

3、穩定期（stationaryphase）：因培養空間和營養物質有限，特別是代謝廢物的累積，細胞進入：新分裂的細胞數與死亡的細胞數相等的動態平衡時期。

細胞數不增加，但代謝還是活躍的。

4、衰亡期（senescence）：營養物的耗盡和有害物質的作用，細胞死亡數大于細胞分裂數。最高分裂次數限制：正常細胞都有，腫瘤（癌）細胞沒有。

第二十三頁，共111頁。細胞濃度的對數潛伏期對數生長期穩定期衰亡期

024487296120h每代（群體）細胞生長的四個時期第二十四頁，共111頁。4.2動物細胞與組織培養的基本技術4.2.1體外培養的特點4.2.2培養條件和工具4.2.3原代培養和傳代培養技術4.2.4貼壁培養技術4.2.5動物細胞培養的傳統方法4.2.6動物細胞大規模培養技術4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養4.2.8動物細胞培養的現狀與展望第二十五頁，共111頁。4.2.1體外培養的特點

1、動物細胞營養需求苛刻：氨基酸（細胞是不能自主合成必須氨基酸的）、單糖（能源；合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料）、維生素（輔酶、輔基）、其他大量和微量元素、促生長因子和激素（促進細胞生長、維持細胞功能、保持細胞分化和未分化狀態）

2、培養環境條件要求嚴格：溫度、滲透壓（多數哺乳動物細胞260~320mOsm∕kg）、pH（及溶氧量CO2和HO-）的相對恒定、剪切力等。

3、易污染、防污染：細菌、真菌、病毒；血清和組織材料。第二十六頁，共111頁。4.2.2培養條件和工具一、培養條件：1.溫度：2.pH：3.氣體：4.營養：二、培養工具：1.器皿：2.載體：第二十七頁，共111頁。4.2.2培養條件和工具一、培養條件：

1、溫度：多數哺乳動物37℃，偏離則影響代謝和生長。高溫對細胞的威脅更大。

2、pH：最適7.2~7.4，低于6、高于7.6影響生長甚至死亡。

3、氣體：容器空間中O2和CO2細胞代謝的進行。O2

？CO2？CO2培養箱？

4、營養：需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌呤、嘧啶、激素和生長因子。第二十八頁，共111頁。4.2.2培養條件——培養基

1.天然培養基（naturalmedium）：來自動物體液或組織分離提取的培養基。種類：生物性液體（如血清）、組織浸液（如胚胎浸液）、凝固劑（如血漿）等。

（1）血清：主要為牛（胎牛、新生牛、小牛）、馬、雞、兔、羊、人血清。各有特點。含各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生長因子及無機物等，在生理平衡下促進或抑制細胞生長。成分復雜，不同種類、不同廠家、不同批號作用有有差異。第二十九頁，共111頁。4.2.2培養條件——天然培養基

血清提供細胞生存、生長和增殖必須的激素與生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素、類固醇激素（雌二醇、孕酮、睪酮）、成纖維細胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）、血小板生長因子（PDGF）

（2）鼠尾膠原及其他膠原：細胞附著、生長的基質，利于組織（特別是上皮類）細胞的固定。

（3）雞胚浸出液：含生長因子、核蛋白、氨基酸等，刺激細胞生長。

（4）水解乳蛋白：氨基酸含量高。用于原代和細胞系的培養。第三十頁，共111頁。4.2.2培養條件——培養基

2、合成培養基（syntheticmedium）：給細胞提供近似體內的生理環境，且便于控制和標準化。但不是完全培養基，只能維持細胞不死而不能促進細胞分裂。使用時需加天然培養基。

（1）基本培養基（essentialmedium）：人工合成的只能使體外培養細胞短暫生存（添加天然培養基后細胞才能繁殖）的培養基。也稱通用培養基（可用于許多細胞）。低限量基礎培養基主要含：無機鹽、微量元素、氨基酸、維生素、碳水化合物等。現已有幾十種，用途不同。第三十一頁，共111頁。4.2.2培養條件——培養基2、合成培養基：

（2）無血清培養基（serunfreemedium,SFM）：化學限定性培養基或化學成分明確培養基（chemicaldefinedmedium)。不需添加血清就可維持體外細胞較長時間生長繁殖的合成培養基。在基礎理論研究中血清的使用影響實驗結果（原因與結果難以對應）。包括兩部分：基礎培養液：合成培養液，如HamF12和DMEM以及許多已商品化的基礎培養液，SEM用于角質細胞,SFM用于淋巴細胞，等等。第三十二頁，共111頁。4.2.2培養條件——培養基無血清培養基的添加成分：

（1）細胞外基質（extracellularmatrix,ECM）：促進貼壁。如纖連蛋白（FN），層粘連蛋白（LN）等。FN促進中胚層源細胞的貼壁和分化；LN作用于內皮細胞和內胚層源細胞。

（2）促生長因子與激素：

（3）酶抑制劑：如大豆胰酶抑制劑。（胰酶消化傳代）

（4）結合蛋白和轉運蛋白：如轉鐵蛋白、牛血清蛋白，增加黏度，免受機械損傷。第三十三頁，共111頁。4.2.3原代培養與傳代培養技術4.2.3.1原代培養

1、組織塊培養處死動物，無菌取組織塊入小燒杯中，用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎，吸管吸取Hanks液沖下剪刀上的碎片，補加3-5mLHanks液，用吸管輕輕吹打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊。

2、組織消化培養（1）取材、分離、消化消化軟組織：0.25%胰蛋白酶消化纖維組織：膠原酶消化傳代細胞（制成細胞懸液）：EDTA+胰蛋白酶第三十四頁，共111頁。.1原代培養

2、培養：接種：接種量大小視情況而定；防污染；常規檢查：1-2天做一次。

4.2.3.2傳代培養：原代細胞分裂增殖成片，布滿器皿表面時，則需對其分離進行重新培養。傳代技術的關鍵：

1、傳代時機：80-90%匯合時最好（過早：細胞產量不足過晚：細胞健康不佳）。

2.酶消化的方法和細胞對酶的反應：敏感/遲鈍（酶作用時間和方法，細胞的類型和來源）第三十五頁，共111頁。4.2.4貼壁培養技術

4.2.4.1貼壁培養的材料：貼壁培養：細胞貼附在一定的固相表面進行培養。（1）玻璃：明礬——硅硼膠玻璃。（2）塑料：聚苯乙烯。（3）金屬：不銹鋼和肽。（4）微載體：天然葡聚糖和其他天然或合成聚合物第三十六頁，共111頁。4.2.4.2貼壁培養的生長特性

1、游離期：接種的細胞，懸浮，細質回縮變圓。

2、吸附期：細胞類型不同，貼壁時間有差異。貼壁快：單個細胞，傳代細胞；貼壁慢：組織快，較大細胞團；不利于細胞貼壁的：細胞狀態不好，培養基pH不正常，培養瓶不潔。

3、繁殖期：圓形懸浮細胞貼壁后延展成極性細胞，此時有細胞運動，無細胞分裂。經一段停滯，開始分裂。隨著細胞數量的增多，開始接觸并連接成片，這時期細胞分裂及運動停止。

4、退化期：細胞長滿培養瓶壁達一定密度，隨著營養物的消耗和代謝物的積累，細胞開始退化。第三十七頁，共111頁。4.2.5動物細胞培養的傳統方法懸滴培養法旋轉管培養法灌注小室培養法培養瓶培養法培養板培養法第三十八頁，共111頁。4.2.5.1懸滴培養法懸滴培養法：將組織器官植塊接種于一蓋玻片上，加一滴培養液，翻轉蓋玻片（植塊和培養液懸掛）放置于凹形哉玻片上，熔蠟密封入培養箱培養。是最早的傳統技術（1907年Harrison創立）。懸滴培養法示意圖第三十九頁，共111頁。4.2.5.2旋轉管培養法

旋轉管培養法：1933~1934年Gey和Lewis建立管狀培養器皿固定于旋轉裝置上旋轉，培養物接種于器皿中培養。

優點：培養物交替地接觸培養液和氣體環境利于細胞組織生長。

缺點：旋轉管不易在顯微鏡下觀察。可將培養物接種在載玻片上，再入旋轉管培養，取載玻片觀察。第四十頁，共111頁。4.2.5.3灌注小室培養法

灌注小室培養法：最初由Burrows（1912年）設計。載玻片——上下壁，金屬圈——側壁，密封成小室，其側面有液體流入和流出口。

特點：液體可循環供應。后來的許多大規模培養系統在設計上都參考了此方法的原理。第四十一頁，共111頁。4.2.5.4培養瓶培養法

培養瓶培養法：培養物直接接種在培養瓶內，在放入培養箱培養。最早采用的是Carrel（1923年）設計的卡氏瓶。與此相關的方法：載玻片加培養瓶法。優點：避免培養瓶表面粗糙對培養物的影響；方便染色觀察和永久保存；增加了培養面積。第四十二頁，共111頁。4.2.5.5培養板培養法

培養板培養法：將培養物接種在培養板的孔內，放入CO2培養箱內培養。曾叫微量培養法，是最常用的體外培養技術方法。常用的（一次性的）培養板：6孔、24孔、96孔（96孔最常用）。第四十三頁，共111頁。

4.2.6動物細胞大規模培養技術

在貼壁和懸浮培養發基礎基礎上，融合固定化細胞、流式細胞術、填充床、生物反應器和人工灌流等技術而發展起了動物細胞大規模培養技術。包括懸浮培養、微載體培養、微囊化培養、中空纖維法、微多孔載體培養等。第四十四頁，共111頁。4.2.6.1懸浮培養技術

少數動物細胞屬于懸浮生長型，離體培養時不需附著物，只需懸浮于培養液中就可以良好生長。動物活體組織分散、過濾、離心、純化、漂洗，接種到適宜培養液中，于特定培養條件下培養。第四十五頁，共111頁。酶消化形成分散細胞加培養液終止消化吹打分散形成分散細胞剪切成細快酶消化、吹打分散形成細胞懸浮液逐級稀釋細胞懸浮液制備過程示意圖…第四十六頁，共111頁。4.2.6.2微載體培養技術最初在培養液中加小滾瓶增加貼壁細胞的生長面積，此法構造簡單，成本低，重復性好，簡單易行。但：勞動強度大、滾瓶空間大而提供的面積有限、細胞產率低、監控不便。

微載體系統培養貼壁細胞技術(VanWezel,1967):一定程度上改變了其不足、最初的載體為離子交換樹脂微珠（60~250微米）。后經改進，選帶不同基團的葡聚糖交聯成幾種大分子（帶適當電荷）作微載體，利于細胞的貼壁生長。第四十七頁，共111頁。4.2.6.2微載體培養技術

細胞支持物（微載體基質）應具備的特征：1.生物相容性；2.簡便的無毒害固定化3.良好的傳質特性；4.良好的機械穩定性；5.最大的比表面積、6.適合細胞生長的形狀和小；7.粒徑分布均一；8.能高壓滅菌；9.可重復利用，易于清洗；10.保護細胞免受機械損傷；11.接種方便；12.能固定大部分細胞；13.適合大規模細胞培養；14.細胞載體培養基易分離；15.適于貼壁和懸浮培養；第四十八頁，共111頁。4.2.6.3微囊化培養技術

將細胞包裹在微囊中進行懸浮培養。微囊是一種人造半透膜制成的微球體，小分子物質可自由穿過，酶、輔酶、離子交換劑、活性碳、蛋白質包裹在其中不能逸出，催化反應底物。

20世紀80年代初（Lim和Sum）制成了細胞能在其中生長的微囊。微囊材料：海藻酸（1,4-鍵連接的多聚甘露糖醛酸和古羅糖醛酸）、多聚賴氨酸。第四十九頁，共111頁。4.2.6.4中空纖維法中空纖維法：1972年（RichardKncazek）發明。最初由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的半透膜，表面有許多海綿狀多孔結構，構成動物細胞生存的立體三維空間（類似于毛細血管）。

3~6層空心纖維構成培養系統，細胞接種于空心纖維的外腔。分離純化細胞分泌物極其方便。現在已開發出硅膠、聚砜、聚丙烯等的空心纖維。第五十頁，共111頁。4.2.6.5微多孔載體培養技術

傳統實心微載體的不足：只能固定貼壁細胞、后期細胞老化而脫落、貼壁需血清中的因子幫助。

微多孔載體培養：克服了其不足。載體內部有網狀結構的小孔供細胞生長、增加細胞的固定化和穩定化，可用于大規模高密度培養動物細胞。優點：降低血清用量、易固定化、比表面積大、細胞免受機械損傷、適合于懸浮細胞的固定化連續灌流培養、也適合于大規模高密度培養系統。第五十一頁，共111頁。

4.2.6.5微多孔載體培養技術微多孔載體的制作材料：生物相容性（無毒、黏附細胞）、機械穩定性（保證長期攪拌不破粹和清洗處理回收利用）、熱穩定性（高溫高壓滅菌不分解、不破粹、不軟化）要好。制備：1.成球材料和臨時性成孔材料分散于介質中液滴，2.液滴固化成小球，3.去除（如高溫燒結）臨時性成孔材料，形成多孔微球，4.后期處理——表面處理、清洗、滅菌等。第五十二頁，共111頁。多孔微載體的制備成球材料分散介質成球成孔去除球中的成孔物質后期處理多孔微載體第五十三頁，共111頁。

4.2.6.5微多孔載體的制備方法材料不同、制備方法不同。1.高溫燒結法：玻璃、陶瓷等。高嶺土、云母（成孔材料）、礬土、氫氧化鋁、二氧化硅→碾細混勻，加甲基醋酸纖維素→漿液→擠壓→球狀顆粒→干燥→1000℃燒結幾小時→陶瓷小顆粒→1400℃→熔化云母→多孔陶瓷載體。第五十四頁，共111頁。4.2.6.5微多孔載體的制備方法

2.高分子材料成球聚和法：

水（懸浮分散介質）加分散劑，強力攪拌→不溶于水的單體分散成小液珠→加引發劑（油溶性）→成珠狀小球→100~105℃去除未反應的單體和成孔物質→稀酸清洗夾在微球中的分散劑→多孔微球→氧化劑處理使其表面極化→親水的多孔載體。第五十五頁，共111頁。

2.4.6.5微多孔載體的制備方法

3.聚合物快速凝聚法：海藻酸鈉溶液在氯化鈣溶液中快速凝聚成球。

4.銳孔噴液冷凍凝固法：成球材料溶于水溶液→銳孔噴射成小液滴→低溫疏水性物質中→遇冷凝固→含冰晶的固體小球→物理化學方法固化成球材料→去除小球中的冰晶，成多孔性小球。第五十六頁，共111頁。

4.2.6.5微多孔載體的制備方法

5.油浴復相乳液分離法：油溶性成孔材料K劇烈攪拌乳化分散到成球材料P的水溶液中→水包油型小液滴→在分散到油性物質O中→復相油滴→溶劑N（與水混溶但不溶解P）吸出液滴中的水分→硬化成固體小球→加熱、減壓、溶劑萃取、冰凍干燥等去除成孔材料→多孔微球。第五十七頁，共111頁。4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養一、生物反應器：傳統的微生物發酵反應器不適用于動物細胞的大量培養。因為動物細胞沒有細胞壁、非常脆弱、對剪切敏感、對培養環境要求嚴格。

20世紀70年代以來，細胞培養用反應器種類越來越多，規模越來越大。但其結構形式仍以攪拌式、氣升式、固定床為主。國外，氣升式反應器已放大到5000~10000L，攪拌式反應器達到8000L。第五十八頁，共111頁。4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養二、應用：

1962年以后，動物細胞培養規模開始擴大，如今已成為生物、醫學研究和應用領域廣泛采用的技術方法。

利用動物細胞培養生產生物活性物質具有獨特的作用和意義，也是植物、微生物細胞培養所無法替代的。動物細胞的內環境與植物微生物細胞全然不同。動物細胞能精確地轉錄、翻譯、加工較大或更復雜的蛋白質（特別是加工蛋白質的環境、過程、結果等是植物微生物細胞極少有的）；能將目的蛋白分泌到培養液中，從而簡化了蛋白質的分離、純化。第五十九頁，共111頁。4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養

二、應用：目前動物細胞生物反應器培養生產的生物制品主要類型：

1、病毒疫苗：如乙肝疫苗（HbsAg）、脊髓灰質炎疫苗（Polio）、狂犬疫苗（Rabies）等；

2、非抗體免疫調節劑：如干擾素（IFN）、白細胞介素（IL）、B細胞生長因子（BCGF）、巨噬細胞激活因子（MAN）、T細胞替代因子(TRF)等。

3、多肽生長因子：神經生長因子（NGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）、血清生長因子（SF）等。第六十頁，共111頁。4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養的應用

4、酶類：組織血纖維溶酶原激活計（t-PA）等；

5、激素：紅細胞生產素（EPO）、促黃體生成素（LH）、促濾泡素（FSH）;

6、腫瘤特異性抗原：癌胚抗原（CEA）等；

7、單克隆抗體（MCAB）；

8、病毒殺蟲劑：桿狀病毒等。第六十一頁，共111頁。

4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養三、關鍵技術（一）細胞培養環境1.氨離子2.乳酸3.二氧化碳4.甲基乙二醛5.滲透壓6.載體（二）細胞死亡與凋亡（三）培養基與細胞系（四）過程監控第六十二頁，共111頁。4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養三、關鍵技術：（一）細胞培養環境：

1、氨離子：提高細胞密度的主要限制因子是培養環境中抑制因素的積累。氨的積聚（來源于培養基和細胞的代謝）使細胞內UDP氨基己糖增加，影響細胞的生長和蛋白質糖基化過程。應防止培養基中Gln自然分解和盡量去除培養基中的氨。

2、乳酸：糖代謝產物。高濃度乳酸→抑制乳酸脫氫酶（LDH）活性→減少乳酸產生→阻止NAD的再生和丙酮酸∕乳酸轉換→NADH增加→抑制糖酵解、低濃度丙酮酸、Gln消耗減少→產能減少→抑制生長。因此應減少培養基中葡萄糖的濃度（以減少乳酸）同時平衡葡萄糖與Gln的比例。第六十三頁，共111頁。關鍵技術——細胞培養環境：

3、二氧化碳：CO2

累積改變細胞代謝水平、對細胞產生毒性。應通過控制供氣參數，平衡氧的輸送及CO2的去除，防止生物反應器運轉中CO2的積累。

4、甲基乙二醛（MG)：為丙糖磷酸去磷酸基（主要）、脂類、氨基酸代謝產物。對細胞有潛在損傷。MG能改變氨基酸、蛋白質和核酸的氨基和巰基。葡萄糖濃度很高時，MG升高。加小牛血清可降低MG的濃度。第六十四頁，共111頁。關鍵技術——細胞培養環境：

5、滲透壓：高滲透壓提高細胞生產抗體的濃度、影響對數生長期長短、細胞死亡速度。滲透壓保護劑：甘氨酸、甜菜堿和三甲基甘氨酸或脯氨酸可一定程度保護高滲對細胞生長的抑制作用，并不影響目的蛋白的表達水平，還可使細胞長時間維持高表達水平。6、載體：用多孔微載體替代常規載體（細胞易受機械攪拌和噴氣損傷）。第六十五頁，共111頁。4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養（二）細胞死亡與凋亡：細胞系在生物反應器中死亡主要是細胞凋亡。

bel-2基因的過量表達：能抑制Gln或缺氧引起的細胞調亡、減少細胞特定成分的消耗、提高細胞密度和目的蛋白的產量。可通過基因工程方法將bel-2這種抑制細胞調亡的基因導入細胞。

在大規模動物細胞培養條件下，細胞死亡或凋亡主要是：營養成分耗盡、有毒代謝產物增多。第六十六頁，共111頁。4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養（三）培養基與細胞系：

培養基：歷經天然培養基、合成培養基到現今的無血清培養基。無血清培養基：避免了血清的批次、質量、成分等對細胞培養的污染、毒性作用、不利于產品純化等不良影響。

細胞系或細胞珠不同，其無血清培養基需求不同，在細胞早期培養階段，細胞對無血清培養基的適應性往往是特異性的。第六十七頁，共111頁。4.2.7動物細胞生物反應器大規模培養

（四）過程監控：因大量細胞的代謝，培養環境會迅速改變，過程的再線監控是非常重要的。離線測定：需要時間長，來不及指導控制有關參數和培養環境的優化、頻繁取樣易污染和增加費用。在線測定：培養條件、代謝產物、目的產物等是大規模培養動物細胞的需要。重要（有效）參數：溫度、pH、溶解氧濃度。第六十八頁，共111頁。4.2.8動物細胞體外培養現狀與展望

動物細胞培養工程目前存在的問題：1.細胞密度低，產物濃度低。2.細胞群體在大規模、長時間培養過程中分泌產物能力易丟失，或產物活性易降低。3.培養基、培養設備以及培養用微載體很昂貴。4.目前對細胞代謝和生長動力學的研究比較欠缺。5.在線監測不完善，限制了優良培養系統的開發。第六十九頁，共111頁。4.2.8動物細胞體外培養現狀與展望

今后應重點開展的工作：1.細胞培養過程中代謝和產物形成機制等方面的理論研究。2.開發高密度生長、大量分泌目標產品的細胞系。3.開發細胞性能優良、細胞解離容易，并能重復使用的新型廉價的微載體。4.研制高效的培養模式與系統，包括新型的無菌生物反應器培養系統與工藝、先進的在線監測、分析與自動控制技術等。5.相關基因工程與細胞培養技術結合的技術研究。第七十頁，共111頁。4.3組織工程4.3.1概述4.3.1.1組織工程：

組織工程：應用細胞生物學和工程學原理，將人體的某部分組織細胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進行人工培養、繁殖、擴增，然后移植到人體內所需要的部位，從而達到器官修復或再造的治療目的的一種技術。第七十一頁，共111頁。

4.3.1.2修復缺損器官的方法修復缺損器官：

1、自體移植：“拆東墻補西墻”——增加患者痛苦、有的器官獨一無二而無法移植。

2、異體移植：最難解決免疫排斥反應，失敗率極高；異體器官來源有限，供不應求，難以實施移植。動物器官移植同樣存在免疫排斥反應，且有將動物的一些病毒傳染給人類的危險

3、組織代用品：如硅膠、不銹鋼、金屬合金等，致命弱點是與人體組織相容性差，不能長久使用，還易引起感染。第七十二頁，共111頁。4.3.1.3組織工程修復缺損器官采用相容性好的生物可降解材料制成的各鐘三維結構的細胞培養載體（支架），在細胞增殖過程中，提供營養物質，進行氧和二氧化碳交換，排泄廢料，而自身逐漸被人體降解、吸收、排泄，最后形成有特定形態和功能的組織和器官。

其優勢明顯、應用前景誘人：運用生物工程技術，利用人體殘余器官的少量正常細胞進行體外繁殖，既可獲得患者急需的具有相同功能的器官，又無排斥反應，現已取得滿意的成果。第七十三頁，共111頁。4.3.1.4組織工程現狀

1、在進行人體實驗的再生的和實驗室培育的器官：骨骼、軟骨、血管、皮膚、胚胎期的胎兒神經組織。

2、正在實驗室里生長成形的：肝臟、胰臟、心臟乳房、手指、耳朵等。

3、人們甚至正在嘗試：培育能充當藥物釋放渠道的組織。第七十四頁，共111頁。4.3.2組織培養4.3.2.1上皮組織的體外培養1.體外培養細胞生長的形態特性2.表皮組織的體外培養4.3.2.2肌肉組織的體外培養1.肌肉組織的特點2.骨骼肌的培養4.3.2.3神經組織的體外培養第七十五頁，共111頁。4.3.2.1上皮組織的體外培養一、體外培養上皮細胞生長的形態特征：

1、體內上皮組織細胞：排列緊密、形態較一致、有極少量的細胞間質、被覆上皮分為單層和復層上皮

2、體外培養時：（1）部分保留體內生長的特征：成群存在或緊密相連成單層膜，極少離群獨存，表現群體依賴性。（2）接觸抑制：培養一段時間后，細胞增多成片后，運動和生長受到抑制。第七十六頁，共111頁。4.3.2.1上皮組織的體外培養二、表皮組織的體外培養：表皮細胞：角質形成細胞（角蛋白細胞，占絕大多數）和非角質形成細胞（數量不多，更新慢）。角質形成細胞體外培養較經典的方法——飼養層細胞培養法（Rheinwald和Green,1975）：

1、原理及優點：將分離的角質形成細胞種植在經過處理的小鼠3T3滋養細胞形成的飼養層上，以促進角質形成細胞的生長與分化；細胞接種密度抵、增殖快、生長穩定、傳代較好。第七十七頁，共111頁。4.3.2.1上皮組織的體外培養二、表皮組織的體外培養：2、實驗材料：

表皮細胞來源：外科手術取包皮、乳腺、腹部皮膚，流產胎兒皮膚最好，燒傷的依情況定。

飼養層細胞：瑞士小鼠胚胎瘤的成纖維細胞系3T3，能有力促進表皮細胞的貼壁生長，抑制混入的成纖維細胞生長。

3T3細胞培養液：DMEM加10%胎牛血清、4mmol∕L谷氨酰胺、青霉素100IU∕ml、鏈霉素100μg∕ml。

角質形成細胞培養液：DMEM和F12(3﹕1)加10%胎牛血清、4mmol∕L谷氨酰胺、青100IU∕ml、鏈霉素100μg∕ml、5μg∕ml轉鐵蛋白、5μg∕ml胰島素等。

第七十八頁，共111頁。

3、培養過程：

（1）3T3細胞的傳代培養：小鼠胚胎瘤成纖維細胞系3T3→

PBS平衡液洗滌→胰蛋白酶-EDTA消化→細胞變圓（顯微鏡下觀察）→棄消化液，加角質形成細胞培養液（消化液體積的3倍）→吹打分散細胞→接種培養，3~5天發生融合→接近融合成單層時→傳代培養。

（2）飼養層細胞的制備：3T3細胞覆蓋瓶底一半時→換培養液→培養24h→接近融合→加1~10μg∕ml絲裂霉素C，培養12h→培養液洗滌細胞3次→胰蛋白酶消化→種植在培養瓶中→加角質形成細胞培養液→37℃培養→貼壁后12h（再種植角質形成細胞）。

（3）角質形成細胞的培養與傳代：取材消毒、分離皮膚和皮下組織，切成2~3mm小快→中性蛋白酶消化（4℃

過夜或37℃2~4h）→針頭分開表皮（薄而半透明）與真皮→胰蛋白酶消化、離心、培養→細胞覆蓋70%瓶底則傳代。第七十九頁，共111頁。

4、結果分析：

角質形成細胞培養3~5天后開始形成集落、擴展；

10天左右集落融合形成皮片，細胞增速減慢；

3T3漸被排擠，形成整個皮片時，3T3細胞消失。第八十頁，共111頁。4.3.2.2肌肉組織的體外培養

4.3.2.2.1肌肉組織的特點：

又稱肌組織，來自于中胚層具收縮能力的肌細胞。肌細胞間有少量的結締組織、豐富的血管和神經。肌肉組織培養：肌肉組織植快或分散的肌細胞在離體環境中存活、生長或發育。肌肉細胞富含肌原纖維具收縮能力，故培養方法上有其特殊性。骨骼肌細胞：中胚層細胞分化→成肌細胞→有絲分裂→融合→肌管細胞（長條管狀，十多個核串珠狀排列中間）→肌原纖維增加，核向周邊移動→骨骼肌細胞。第八十一頁，共111頁。

肌衛細胞：乃骨骼肌細胞的干細胞（可被看作儲備的成體細胞）。緊貼骨骼肌細胞表面，扁平，有突起能進行有絲分裂。肌肉受傷后，肌衛細胞分裂，轉化為肌細胞，進一步分化為肌纖維，填補受傷部位。成熟的骨骼肌細胞不能進行有絲分裂。第八十二頁，共111頁。

4.3.2.2.2骨骼肌的培養：

1、材料：組織來源——胚胎或新生（1~2天最好）大鼠大腿肌肉；培養液——EagleMEM或DMEM（添加FCS或∕和馬血清、雞胚液）。

2、培養過程：（1）處死動物，分離大腿肌肉，洗滌，胰蛋白酶消化，收集懸浮細胞。（2）接種在10%CO2、飽和濕度環境中培養。（3）取原代或傳代培養的細胞記數，接種在明膠覆蓋的培養板上，進行骨骼肌細胞的培養。第八十三頁，共111頁。3、骨骼肌培養的結果：接種數小時后多數細胞貼壁，主要為單核（外觀明顯）細胞；前2天是細胞增殖的主要時期，無明顯細胞融合；50~52h后，細胞進入快速融和期；多核細胞快速生長導致纖維網的形成；數天后融合結束，之后可觀察到纖維的自發收縮現象；再過1~2天，骨骼肌細胞的特征橫紋開始變得明顯；有時肉眼可見到細胞收縮；適當條件下，細胞增殖一代時間為11~13h。肌肉細胞系的建立：肌細胞的連續選擇性傳代，低密度接種到有（或無）飼養層細胞的培養板上，形成單細胞克隆，可以避免肌源性表型的過早喪失。（不同組織來源的細胞連續傳代會導致生長增殖活動停止，也有肌源性表型喪失的趨勢）第八十四頁，共111頁。4.3.2.3神經組織的體外培養

神經細胞（神經元細胞和神經膠質細胞）組成神經組織。即體外培養神經元細胞和神經膠質細胞。培養對象、條件、設備等不同，培養方法不同。差速處理富集脊髓神經元培養法：

1、材料：動物：胚齡14天的大鼠胚胎；培養液：（1）含血清的培養液：DMEM加20%胎牛血清、50IU∕ml的青霉素、50μg∕ml的鏈霉素（2）無血清的培養液：DMEM加5μg∕ml牛胰島素、50μg∕ml人轉鐵蛋白。（3）多聚賴氨酸液。第八十五頁，共111頁。4.3.2.3神經組織的體外培養2、培養步驟：（1）取大鼠胸、腰段脊髓，剔除脊膜，顯微鏡下分離暗灰色組織，剪碎；（2）37℃0.25%胰蛋白酶消化15min，胎牛血清終止酶活性后，離心、懸浮、吹打，再離心，制得細胞懸浮液；（3）10ml細胞懸液于直徑100mm培養皿中，37℃、5%的CO2孵育2~3h，利于最大限度貼壁；（4）未貼壁的細胞離心，重新獲得細胞懸浮液，記數；（5）用多聚賴氨酸液預先包被培養皿（37℃）24h，每皿接種106個懸浮細胞；（6）CO2

培養箱孵育2h，換無血清化學限制培養基繼續培養，4天后換液。第八十六頁，共111頁。4.3.2.3神經組織的體外培養3、結果：用神經元特異性標志物進行免疫細胞化學鑒定證實，大約98%的細胞是神經元性質的細胞。因材料來源于胚胎組織，所以培養物中還有少量的神經前體細胞。硼酸鹽緩沖液配制的多聚賴氨酸生長基質，其效果好于蒸餾水。第八十七頁，共111頁。4.4器官培養4.4.1概述：

1、器官培養：主要采用類似于組織培養中植塊培養的方式培養器官型植塊。

2、基本技術特點：取出動物器官或進一步修整成器官型植塊，將其接種到培養基上或培養液中，在適當的營養、氣相、生長基質等條件下，使其存活和生長。

3、發展歷史：最早Leob（1897年）進行成年兔一些器官的嘗試性培養——血漿凝快培養兔的肝、腎、甲狀腺、卵巢等（3天）；20世紀初器官培養進入活躍時期（主要限于胚胎器官）；20世紀50年代進入蓬勃發展階段（不限于胚胎器官），技術、器皿、培養基等有了許多改良和革新。第八十八頁，共111頁。4.4.1器官培養概述迄今，文獻報道已在培養的人體器官：乳腺、眼、內耳、肝、腦、角膜、腎、肺、骨、皮膚、子宮、胸腺、腸、牙、氣管、副甲狀腺、心臟、食管等等。

4、現代器官培養的共同點：（1）培養對象：非胚胎和胚胎器官的一部分；（2）浸泡在培養液中培養；（3）被培養組織器官的細胞以簡單擴散方式獲得氧氣和其他營養物質、排除CO2和其他代謝廢物。第八十九頁，共111頁。

4.4.1器官培養概述5、器官培養的特征：器官培養與器官保存、組織培養、細胞培養不同：

（1）被培養器官存活較長時間，保持相對正常功能，器官內的細胞有正常功能甚至增殖。器官保存無細胞增殖。

（2）被培養物是完整器官或具有完整功能的某一器官的一部分。如肝、肺的一葉，一片皮膚等。組織培養物已喪失原器官的完整功能。

（3）器官培養無器官數量的增加。細胞培養有細胞數量的增加。第九十頁，共111頁。

胚胎與成體器官培養的特點1、基本原則：（1）提供充足的營養和O2，及時排除代謝廢物；（2）抑制細胞從植快向外遷移。2、胚胎器官培養的特點：（1）能量來源是糖酵解，培養時不需補充O2。（2）早期胚胎器官（原基）體積較小，可將整個器官進行培養。（3）胚胎器官細胞生長活躍，遷移能力強，容易從植快中遷移出來。第九十一頁，共111頁。

胚胎與成體器官培養的特點3、成體器官培養的特點：

（1）能量來自有氧代謝，因此需充足的O2供應，器官植塊中心才不會缺氧而壞死。

（２）只能成功培養幾周，且僅能維持其存活和保持其結構功能（因其高耗氧率和細胞的高度分化）。

（３）器官內部細胞遷移不明顯。第九十二頁，共111頁。4.4.3傳統的器官培養方法1、表玻璃器官培養法：Ｆell和Robinson（1929）建立。表玻璃上加雞胚質和雞血漿→凝固→培養的器官移植其上→放入培養皿內→入箱培養。已成功用于研究胚胎原基的形態發生，改良后可用于激素、維生素、致癌因子對哺乳動物成年器官的作用等方面的研究。第九十三頁，共111頁。4.4.3傳統的器官培養方法2、瓊脂凝膠培養法：培養液加瓊脂形成凝膠，故培養基質不液化，器官組織的細胞在其上的遷移受到抑制。用此法成功進行了胚胎器官的發育及形態發生的研究，以及腫瘤組織的培養。第九十四頁，共111頁。4.4.3傳統的器官培養方法3、懸浮培養法：是最簡便最早使用的液體培養法，可隨時加影響因子或生化分析（瓊脂凝膠培養法只有在轉培養時才能進行）。器官型植塊置于液體培養基中，適當搖動培養瓶，以使液面的氧盡可能多地溶解在培養液中，并防止植快下沉而黏附。第九十五頁，共111頁。4.4.3傳統的器官培養方法4、直接漂浮培養法：器官浸入培養液中，不能持續接觸空氣（O2）易于缺氧壞死。器官型植塊置于液體培養基與氣象界面上培養，植塊可同時獲取營養和充足的氧氣。此法適合于高耗氧的成體器官的培養。如皮膚表皮向上、真皮向下直接漂浮在培養液表面，并向培養液中充入70%的O2，獲成功（Medarwar,1948）。第九十六頁，共111頁。4.4.3傳統的器官培養方法5、擦鏡紙培養法：直接漂浮培養法的不足：器官易轉曲。最早的在氣—液表面進行器官培養的方法。擦鏡紙（具有疏水性）漂浮在培養液的表面，作為器官的支持物，營養物可透過擦鏡紙進入器官。第九十七頁，共111頁。4.4.3傳統的器官培養方法6、金屬格柵器官培養法：漂浮支持物很難持久地漂浮。金屬格柵替代漂浮支持物（Trowell,1954）。最初為高耗氧的成體器官培養而設計。金屬格柵：堅實、平穩、安全，支托或移動大量的培養器官。第九十八頁，共111頁。4.4.3傳統的器官培養方法7、瓊脂小島器官培養法：瓊脂制成小島狀的支持物，放在液體培養基中，將器官置于瓊脂上進行培養。瓊脂起支持和防止培養器官的細胞發生遷移的作用。

優點：可直接觀察器官的生長情況；維持器官在體外較長時間生長、抑制細胞遷移（瓊脂凝膠培養法的優點）；換液簡便（液體培養基的優點）。第九十九頁，共111頁。4.4.3傳統的器官培養方法8、旋轉管培養法：最早于1933年（Gey）建立。

要培養的器官植塊用血漿凝塊固定于旋轉管一側，管內加入適量培養液，水平旋轉進行培養。旋轉培養期間，植塊斷續地與培養液和氣相接觸，可獲得充足的營養和氧氣。第一百頁，共111頁。4.4.3傳統的器官培養方法9、搖擺式器官培養法：