高效液相色譜法

——原理及儀器結構

主講教師曹龍輝莫家樂ppt再整理付翠彥學習內容高效液相色譜的基本原理1高效液相色譜的結構2●高效液相色譜(HPLC)是色譜法的一個重要分支。1.工作原理

儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內；由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別而被分離開；被分離后的單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式呈現出來。一、高效液相色譜基本原理2.高效液相色譜與經典液相色譜方法的比較一、高效液相色譜基本原理●高速：HPLC采用高壓輸液設備，流速大大增加，分析速度極快，只需數分鐘；而經典方法靠重力加料，完成一次分析需數小時。●高效：填充物顆粒極細且規則，固定相涂漬均勻、傳質阻力小，因而柱效很高，可以在數分鐘內完成數百種物質的分離。●高靈敏度：檢測器靈敏度極高：紫外UV—10-9g；熒光檢測器—10-11g。●分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩定化合物，而這些物質只占有機物總數的20%；HPLC可以分析高沸點、高分子量的穩定或不穩定化合物，這類物質占有機物總數的80%。●流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用小；HPLC采用的流動相為液體或多種液體的混合，可供選擇的機會多，它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。●操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進行。一、高效液相色譜基本原理3.HPLC與GC的比較（GC：氣相色譜）4.應用由于HPLC分離分析的高靈敏度、定量的準確性、適于非揮發性和熱不穩定組分的分析，因此，在工業、科學研究，尤其是在生物學、醫學、環境監測等方面應用極為廣泛，如氨基酸、蛋白質、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農藥、抗生素、膽固醇等分析，大多是通過HPLC來完成的。一、高效液相色譜基本原理二、高效液相色譜結構HPLC儀器組成：(1)高壓輸液系統;(2)進樣系統;(3)分離系統;(4)檢測系統;(5)數據顯示系統。

此外還配有梯度淋洗、自動進樣裝置。二、高效液相色譜結構二、高效液相色譜結構1.高壓輸液系統（150～350×105Pa）1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進入泵內。2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去（因為氣泡會影響檢測）。3）高壓泵：對輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩定無脈動、可調范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。●恒壓泵：可迅速獲得高壓，但因泵腔體積大，在往復推動時會引起脈動，且輸出流量隨色譜系統阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現已較少使用。●恒流型：溶劑流量恒定，與柱填充情況無關，使用較多。有機械注射式和機械往復式兩種。應用最多的是機械往復式恒流泵（每分鐘往復25~100次，因此脈動小。對流量變化敏感的檢測器也會有噪聲干擾，此時可連接脈動阻尼器)。二、高效液相色譜結構4）梯度淋洗裝置：

在分離過程中逐漸改變流動相組成或極性（從而改變分配比k值）的裝置。如果只有一個泵，可采用低壓混合設計（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出）；如果有兩個或以上泵，調節各自的流量，在高壓下混合。二、高效液相色譜結構2.進樣系統

與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產生的峰形展寬相對要小些。即，HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進樣系統、連接管道及檢測器的死體積。進樣裝置包括兩種。1）隔膜注射進樣：使用微量注射器進樣。裝置簡單、死體積小。但進樣量小且重現性差。2）高壓進樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準確，重復性好，如圖。裝入樣品出口進樣采樣環泵入溶劑進色譜柱二、高效液相色譜結構3.分離系統（色譜柱）1）對色譜柱的要求：內壁光滑的優質不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為10~30cm，內徑為4~5mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內徑更大)；2）柱的填充：主要采用勻漿法。根據使用勻漿試劑的性質不同可分為：①平衡密度法：使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時顆粒沉降速度趨于0。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；②非平衡密度法：采用粘度較大的試劑，如CCl4，CH3OH,丙酮，二氧雜環已烷、THF等。●填充方法：填充時，按上述方法制作勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結塊)、且無空氣進入(影響填充均勻性)。二、高效液相色譜結構3）流動相與GC流動相不同，HPLC流動相為溶劑，它既有運載作用，又和固定相一樣，參予對組分的競爭，因此溶劑的選擇對分離十分重要。理想的溶劑應有下列特性：對待測物具一定極性和選擇性；使用UV檢測器時，溶劑截止波長要小于測量波長(為什么？)；使用折光率檢測器，溶劑的折光率要與待測物的折光率有較大差別；高純度。否則基線不穩或產生雜峰，同時可使截止波長增加；化學穩定性好；適宜的粘度。粘度過高，柱壓增加；過低，易產生氣泡。二、高效液相色譜結構4.檢測系統（檢測器）液相色譜檢測器包括紫外吸收、熒光發射、示差折光和安培檢測器等。1）紫外檢測器其檢測原理和UV-Vis方法一樣。只是此時所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10L。

HPLC分析中，約有80%的物質可以在254nm或280nm處產生紫外吸收，因此該類檢測器應用很廣。在選擇測量波長時注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液二、高效液相色譜結構2）熒光檢測器許多有機物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強的活性。熒光檢測器是一種選擇性很強的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高2~3個數量級。二、高效液相色譜結構3）示差折光檢測器原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對光的折射率不同，其中一束光（通常是通過樣品+溶劑相）因為發生偏轉造成兩束光的強度差發生變化，將此差示信號放大并記錄，該信號代表樣品的濃度。為通用型檢測器，靈敏度為10-7g/mL。但對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。光源調零光學零參比樣品平面鏡透鏡光電轉換記錄儀放大器遮光板二、高效液相色譜結構4）安培檢測器

由恒電位儀和一薄層反應池（體積為1~5L）組成。如圖。該檢測器是利用待測物流入反應池時在工作電極表面發生氧化或還原反應，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測物濃度成正比。采用安培檢測器時，流動相必須含有電解質，且呈化學隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測器只能檢測具有電活性的物質。接參比電極和對電極接色譜柱Teflon塑料塊1cm工作電極(Pt,Au,碳糊)二、高效液相色譜結構5）電導檢測器

電導檢測器主要用于離子色譜的檢測。其原理是基于待測物在一些介質中電離后所產生的電導（電阻的倒數）變化來測量電離物質的含量。電導檢測器的主要部件是電導池。其響應受溫度影響較大，因此需要將電導池置于恒溫箱中。另外，當pH>7時，該檢測器不夠靈敏。其它檢測器還包括：MS、IR、Evaporativelightscatteringdetector(光散射)、極譜等。二、高效液相色譜結構有機氯農藥殘留量分析：固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內徑)

檢測器：差示折光檢測器可對水果、蔬菜中的農藥殘留量進行分析。多環芳烴分析：固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

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