轉基因食品及PCR檢測轉基因食品第一頁，共57頁。轉基因食品（geneticallymodifiedfoods,GMF)是由細胞DNA中經非生殖方法插入了特定外源基因或基因片段，并獲得某種良好性狀的動物、植物或微生物制成的食品。例如抗蟲害、抗病毒、抗雜草的轉基因玉米、黃豆、油菜、土豆、西葫蘆等。第二頁，共57頁。3.1轉基因產品的種植情況轉基因作物自1996年進行商業化種植以來，全球轉基因作物種植面積持續增長。截至2004年，在八年間增加了將近40倍左右。已批準商品化轉基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、亞麻、煙草、西瓜等。據估計，用這些轉基因作物生產加工的食品全世界有近萬種。第三頁，共57頁。目前，轉基因作物主要集中種植在工業化國家。1999-2003年，美國、阿根廷、加拿大和中國這四個國家種植了全球99％的轉基因作物。全球種植的轉基因作物主要是大豆、玉米、棉花和油菜。目前，國際上進行實驗室研究和田間實驗的轉基因作物種類較多，但批準商業化種植的轉基因作物種類卻只有幾十種。第四頁，共57頁。第五頁，共57頁。第六頁，共57頁。目前我國正式批準投入商業種植的轉基因作物只有兩種：一是具有自主知識產權的抗蟲棉，另一個是延遲成熟的番茄，其中抗蟲棉的種植面積2003年已累計達到4000萬畝，而番茄則還處于小范圍種植階段，僅10000畝。進口的轉基因食品局限在大豆、玉米、油菜等領域。我國進口的大豆中，70%是轉基因大豆，在我國市場上70%的含有大豆成分的食物中都有轉基因成分，像大豆油、色拉油、磷脂、醬油、膨化食品等等。第七頁，共57頁。美國市場上的轉基因食品：在美國，轉基因食品已進入尋常百姓的餐桌,轉基因大豆也已用于制作數百種食品，其中包括食物油、糖果和人造黃油。超過70%的食品含有轉基因成分，像飲料、糖果、糕點、冰激凌等，有3/4的奶酪是轉基因奶酪。近年來，美國的轉基因作物品種越來越多，如轉基因玉米約占美國玉米種植面積的一半。第八頁，共57頁。3.2轉基因食品的種類

3.2.1植物性轉基因食品

目前全球種植的轉基因作物可分為以下三類：1、抗除草劑轉基因作物：2000年全球種植抗除草劑轉基因作物的面積達到3，270萬公頃，占總轉基因植種植面積的72%，其中主要為抗除草劑大豆。舉例：RoundupReadysoybean(RR大豆)，乃美國孟山都公司Roundup除草劑。第九頁，共57頁。2、抗蟲轉基因作物：2000年全球種植抗蟲轉基因作物的面積達到830萬公頃，占總轉基因植物種植面積的19%，其中以抗蟲玉米為主。舉例：BT玉米，抵抗三種毒素：Cry1Ab、Cry1Ac、Cry9c。3、其他轉基因作物：改善產品的品質；增強抵抗病毒病、真菌病及細菌病的能力。第十頁，共57頁。3.2.2動物性轉基因食品

比如，牛體內轉入了人的基因，牛長大后產生的牛乳中含有基因藥物，提取后可用于人類病癥的治療。在豬的基因組中轉入人的生長素基因，豬的生長速度增加了一倍，豬肉質量大大提高，現在這樣的豬肉已在澳大利亞被請上了餐桌。第十一頁，共57頁。3.2.3轉基因微生物食品

微生物是轉基因最常用的轉化材料，所以，轉基因微生物比較容易培育，應用也最廣泛。例如，生產奶酪的凝乳酶，以往只能從殺死的小牛的胃中才能取出，現在利用轉基因微生物已能夠使凝乳酶在體外大量產生，避免了小牛的無辜死亡，也降低了生產成本。

第十二頁，共57頁。3.2.4轉基因特殊食品

科學家利用生物遺傳工程，將普通的蔬菜、水果、糧食等農作物，變成能預防疾病的神奇的“疫苗食品”。科學家培育出了一種能預防霍亂的苜蓿植物。用這種苜蓿來喂小白鼠，能使小白鼠的抗病能力大大增強。而且這種霍亂抗原，能經受胃酸的腐蝕而不被破壞，并能激發人體對霍亂的免疫能力。于是，越來越多的抗病基因正在被轉入植物，使人們在品嘗鮮果美味的同時，達到防病的目的。

第十三頁，共57頁。轉基因棉花中國的轉基因羊日本研發的轉基因大豆

各種各樣的轉基因水果浙江省種植的轉基因油菜第十四頁，共57頁。3.3轉基因食品的安全性問題美國宣稱轉基因食品與傳統食品一樣，是安全的，對人體無害，迄今沒有報告表明轉基因農產品給人體健康造成了危害。歐盟等國家認為轉基因食品應用于生產和消費的時間尚短，食品的安全性和可靠性都有待于進一步的研究和證明，轉基因食品可能會導致一些遺傳學或營養成分的非預期改變，可能會對人類健康產生危害。第十五頁，共57頁。3.3.1轉基因產品對人體健康可能產生的影響該類食品攜帶的抗生素基因有可能使動物與人的腸道病原微生物產生耐藥性，這是人們最關心的問題。抗蟲農作物體內的蛋白酶抑制劑和殘留的抗蟲內毒素，可能對人體健康有害。有人認為，抗蟲農作物體內的蛋白酶抑制劑和抗蟲內毒素，既然能使咬食其葉片的昆蟲的消化系統功能收到損害，那么誰又能擔保其葉片、果實、種子不會對人畜產生類似的傷害呢？第十六頁，共57頁。隨著基因改造的抗除草劑農作物的推廣，可能導致除草劑的用量增加，從而導致除草劑在食品種殘留量加大。轉基因作物中病毒基因有可能與浸染該植物的其他病毒進行重組，產生新病毒或超級病毒。轉基因生物作為食品進入人體，可能使人出現某些毒理作用和過敏反應，國外已有兒童飲用轉基因大豆豆漿產生過敏反應的報道。第十七頁，共57頁。3.3.2轉基因產品對環境生態可能產生的影響轉基因作物本身可能轉變成雜草。如果轉入的抗性基因逃逸到其他作物上，也會使這些作物的野生近緣種并成雜草；如果轉基因高產作物一旦通過花粉導入方式將高產基因傳給周圍雜草，會引發超級雜草出現，對天然森林造成基因污染和對這些地區的其他作物帶來不可預見的后果。第十八頁，共57頁。如果轉基因不育品種的不育基因在種植地大肆傳播，會導致當地農業崩潰。抗蟲、抗病和抗除草劑類轉基因植物，除對害蟲產生毒害而使其死亡外，對環境中的許多有益生物也產生直接或間接的影響，甚至使其死亡。如果用于食品的植物通過基因改良成為要用植物，那么通過異花授粉會使食用的植物產生藥性，從而污染人類的食品供應。第十九頁，共57頁。基于轉基因食品潛在安全的不確定性，世界各國政府都加強對轉基因食品進行管理。主要原則是：一、執行嚴格的安全評價制度；二、標識制度，即在轉基因食品包裝上加貼標識。目前我國轉基因食品法規主要為《農業轉基因生物標識管理辦法》，2002年3月20日起實施，規定對轉基因產品實施標識制度。第一批標識管理的轉基因生物目錄是：大豆種子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕、玉米種子、玉米、玉米油、玉米粉、油菜種子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕、棉花種子、番茄種子、鮮番茄、番茄醬。第二十頁，共57頁。3.4DNA提取轉基因產品檢測的第一步是提取樣品中的DNA。植物細胞中DNA主要存在于細胞核內，細胞質中的DNA主要存在于線粒體和葉綠體中。細胞內各種DNA總稱為總DNA。進行轉基因檢測需要提取的是總DNA。第二十一頁，共57頁。提取DNA的質量關鍵在于DNA分子的平均長度、化學純度和DNA結構的完整性。DNA提取的基本原理是：從樣品中釋放DNA和純化DNA。為了得到高質量的DNA，必須去除：①蛋白質如用蛋白酶或有機試劑去除；②多糖（如果膠、纖維素、半纖維素、淀粉和增稠劑等），以酶（果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶等）方法或有機溶劑（CTAB/氯仿等）去除；③脂類，以酶法或溶劑（如正己烷）去除；④RNA，用RNA酶去除；⑤鹽類（提取/裂解緩沖液或沉淀液的殘留物）。第二十二頁，共57頁。DNA的純化采用不同方式，主要有沉淀法和固體介質吸附法。沉淀法是用試劑乙醇和異丙醇等沉淀濃縮DNA，在DNA沉淀過程中可使用DNA共沉淀劑如糖原、PEG或tRNA以提高DNA的得率。固體介質吸附法是指采用陰離子交換樹脂、硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。提取DNA時，可同時采取幾種純化方法。關于植物總DNA的提取方法有很多，如苯酚－氯仿法、CTAB法、SDS法、二氧化硅法和胍鹽等方法。第二十三頁，共57頁。3.4.1苯酚－氯仿法本方法是常用的DNA提取方法。苯酚能破壞細胞和核酸酶。氯仿使蛋白質變性并有助于液相和水相的分離。苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）的效果更好，異戊醇能消除抽提過程中出現的泡沫。苯酚：氯仿將蛋白質、多糖和核酸酶等從含有DNA的水相中去除，再用氯仿抽提去除苯酚，最后用乙醇沉淀濃縮DNA，去除鹽類和殘余氯仿。本方法的關鍵步驟是裂解，在細胞裂解時，最好是在SDS和高EDTA濃度的溶液中熱裂解。第二十四頁，共57頁。3.4.2SDS法本方法側重于細胞的裂解和DNA的釋放。高濃度的SDS在較高溫度（55-65℃）條件下裂解細胞，使染色體解析，蛋白質變性，釋放出核酸。然后采用高鹽濃度（如5mol/LKAc）及降低溫度（置于冰上保溫），使蛋白質和多糖等雜質沉淀，離心去除沉淀，上清液中的DNA反復用酚/氯仿抽提，最后用乙醇沉淀水相中的DNA。第二十五頁，共57頁。對于富含蛋白質的材料常加蛋白酶K來除去蛋白質，對于富含多酚類物質的樣品，如馬鈴薯、西紅柿等，一般加入6％的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），PVP可與多酚類物質結合形成復合物，經離心可被除去。該法操作簡單，條件溫和，但所提取的DNA溶液中糖類雜質較多。多糖含量高的樣品不宜采用此方法。第二十六頁，共57頁。3.4.3CTAB法本方法是轉基因成分檢測常用的方法。CTAB是一種去污劑，能溶解細胞膜并能與核酸形成復合物，該復合物在高鹽溶液（0.7mol/LNaCl）中是可溶的，但當NaCl濃度降低到0.3mol/L時，會從溶液中析出。通過離心可將復合物同蛋白質、多糖類物質分開。然后將復合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀。CTAB與核酸的復合物發生沉淀時，多糖、色素、多酚類物質不發生沉淀，所得到的DNA為乳白色或灰白色。此法最大的優點是通過高鹽溶液的選擇性沉淀能很好的去除糖類和酚類等雜質，所以提取含糖類和酚類含量較高的樣品可優先采用此方法。第二十七頁，共57頁。3.4.4二氧化硅法本方法是一個專利方法，操作簡單，適用于大多數物質的DNA提取，側重于DNA純化。本方法不適合于高脂物質DNA的提取。首先以裂解液裂解細胞，常用SDS和高EDTA溶液熱裂解。在鹽酸胍溶液中用二氧化硅樹脂純化DNA，DNA吸附在樹脂上，再用異丙醇將污染物質從樹脂上去除，最后用低鹽緩沖液洗脫溶解DNA。第二十八頁，共57頁。3.4.5試劑盒法在日常檢驗中一般采用DNA提取試劑盒來提取樣品的DNA。DNA提取試劑盒的步驟是：首先裂解細胞，再抽提去除蛋白質等污染物質，純化DNA，最后去除鹽分溶解DNA，也是上述集中方法的結合。提取樣品的DNA時，每個樣品必須設置兩個提取平行樣和一個提取空白對照（水代替樣品）。第二十九頁，共57頁。3.5轉基因食品檢測轉基因食品檢測主要采用普通定性PCR、多重PCR、基因芯片和ELISA方法。第三十頁，共57頁。3.5.1PCR技術介紹聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,PCR)是1985年由美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的K.B.Mullis等發明的一種體外核酸擴增技術，又稱為無細胞分子克隆系統。1993年K.B.Mullis獲諾貝爾化學獎。它具有特異、敏感、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點。第三十一頁，共57頁。3.5.1.1PCR技術的原理PCR技術類似于DNA的天然復制過程。在適宜的條件下，人工合成寡核苷酸引物與模板DNA單鏈互補結合，在DNA聚合酶的作用下，以四種脫氧核苷酸(dNTP)為底物，不斷延伸，使被擴增的基因片斷以幾何倍數增長。第三十二頁，共57頁。PCR過程包括變性－退火－延伸三個基本反應步驟：模板DNA的變性：加熱至93-95℃，模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA離解成為單鏈；模板DNA與引物的退火（復性）：溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，合成一條與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復變性－退火－延伸三個過程，目的基因被擴增放大幾百萬倍。每個循環需2-4min，整個PCR反應需要2-3h。第三十三頁，共57頁。PCR擴增遵循酶促反應動力學原理：反應初期靶序列DNA片斷呈指數形式增加；隨著PCR產物的逐漸積累、原料的消耗、酶活性的降低，酶的促化反應趨于飽和，擴增的DNA片斷增加緩慢，進入所謂的平臺期。第三十四頁，共57頁。3.5.1.2PCR反應的主要因素模板、引物、酶、dNTP和Mg2+是PCR反應的五個重要因素，決定了PCR反應的成敗。模板DNA：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一。抽提的DNA溶液中含有氯仿、乙醇等有機溶劑、Taq酶抑制劑和雜蛋白等會影響PCR擴增，產生假陰性。第三十五頁，共57頁。②引物：PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度，引物的設計和合成對PCR結果起著決定性作用。設計引物應遵循以下原則：引物長度：15-30bp，不能過長，引物過長導致延伸溫度過高，不適于Taq酶促反應。退火溫度：60℃左右。引物堿基：G+C含量以40-60％為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布。避免引物內部出現二級結構。避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。第三十六頁，共57頁。引物3’端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其他序列無明顯同源性。

引物設計多采用計算機軟件，例如PermierPrimer、Oligo等。在軟件的基礎上輔以人工分析，以達到最佳效果。PCR反應中引物濃度也影響PCR擴增效果。引物濃度低，PCR擴增量低，會出現假陰性現象；濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。第三十七頁，共57頁。③TaqDNA聚合酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性ＤＮＡ聚合酶，其活力的高低決定了PCR擴增是否成功。此酶的最適溫度很高（79℃），使引物在高溫下進行退火和延伸，增加了反應的特異性和擴增效率。酶濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。第三十八頁，共57頁。④dNTPdNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系。在PCR反應中，4種dNTP的濃度要相等，反應濃度為200umol/L左右，濃度過低會降低PCR產物的產量；濃度過高會導致錯配。⑤Mg2+濃度Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，直接影響著酶的活性和可靠性。在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5-2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異性擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應產物減少。DNA模板、引物和dNTP可與Mg2+結合，降低Mg2+實際濃度。第三十九頁，共57頁。3.5.1.3PCR熱循環條件PCR退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。變性后溫度快速冷卻至50-65℃，引物和模板結合。退火溫度與時間的設置，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度和靶序列的長度。循環次數決定PCR擴增產量。在其他參數優化的條件下，循環次數主要取決于模板DNA的初始濃度。一般的循環次數在30-40之間，循環次數過多會增加非特異性擴增產物量。第四十頁，共57頁。3.5.1.4PCR擴增產物分析對PCR擴增產物的檢測和分析有許多方法，如凝膠電泳、Southern雜交和PCR-ELISA等方法，最常用的是瓊脂糖凝膠電泳。通常應用1-2％的瓊脂糖凝膠，經溴化乙錠染色，通過凝膠成像系統，初步判斷產物的特異性，PCR產物片段的大小應與預計的一致。對PCR產物的鑒定通常采用限制性內切酶酶切反應和核酸序列分析等方法。第四十一頁，共57頁。3.5.1.5PCR檢測常見問題在進行PCR檢測時，常見的問題是假陽性和假陰性現象。⒈假陽性由于PCR的高靈敏性，極微量的目標DNA污染都有可能出現擴增條帶。因此要防止污染，尤其是DNA抽提中的樣品交叉污染、PCR試劑污染和PCR產物的污染。第四十二頁，共57頁。引物設計不合適也會出現假陽性現象。選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性，需要重新設計引物。第四十三頁，共57頁。⒉假陰性產生假陰性的原因主要有DNA模板、酶、試劑、引物用量低或含有抑制劑和循環參數不正確等。在PCR實驗中設置陽性對照、陰性對照和空白對照。引起假陰性現象的可能原因：模板中含有雜蛋白質，Taq酶抑制劑，酚、氯仿、乙醇等有機溶劑或DNA量不足，Taq酶失活、酶活降低或量不足，引物設計不合理，變性溫度低，變性時間短，退火溫度不適合等等。第四十四頁，共57頁。PCR常見的問題還有非特異性擴增和涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶（Smear現象）。非特異性擴增：引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體，Mg2+濃度過高、退火溫度過低或PCR循環次數過多，酶質量較差，或酶量過多等。Smear現象：酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低等。第四十五頁，共57頁。3.5.2實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且比常規PCR相比，它具有特異性更強、自動化程度高、不使用溴化乙錠、不污染環境等特點，目前已得到廣泛應用。實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR所使用的化學物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。第四十六頁，共57頁。TaqMan熒光探針PCR擴增時，加入一對引物，同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記了一個報告熒光基團和一個猝滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被猝滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和猝滅熒光基團分離，從而熒光檢測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。第四十七頁，共57頁。第四十八頁，共57頁。SYBR熒光染料在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，雙鏈越多，嵌入的SYBR染料越多；而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。用SYBR染料比較方便而且成本低，但在模板濃度較低時，引物二聚體作用影響較大。目前主要采用的還是TaqMan熒光探針。第四十九頁，共57頁。3.5.3基因芯片DNA芯片，又稱DNA微集陣列，因為在微集陣列的制備過程中采用了硅芯片，所以稱為DNA芯片或基因芯片。DNA芯片技術起源于核酸分子雜交，于20世紀80年代提出，90年代初期迅速發展。第五十頁，共57頁。檢測原理DNA芯片是指應用大規模集成電路的微陣列技術，在固相支持物如硅、尼龍膜表面，有規律地合成數萬個代表不同基因的寡核苷酸“探針”或液相合成探針后由點陣器有規律地點樣于固相支持物表面，然后將要研究的目的材料中的DNA、RNA或cDNA用同位素或熒光物質標記后，與固相支持物表面的探針進行雜交，通過放射自顯影或熒光共聚焦顯微鏡掃描，利用計算機對每一個探針上的雜交信號作檢測、分析，從而反映所用材料中大量基因的信息。第五十一頁，共57頁。3