第二章茶樹次級代謝

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第1頁第一節茶樹次級代謝特點、主要路徑及調整

次級代謝特點1）初級代謝primarymetabolism:

蛋白質、脂肪、核酸、碳水化合物等是植物生命活動不可缺乏物質，為生物體生存、生長、發育、繁殖提供能源和中間產物，這類物質代謝我們稱之為初級代謝或一級代謝。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第2頁2）次級代謝secondarymetabolism:植物在長久進化過程中，在特定條件下，以一些主要初級代謝產物為前體，經過一些不一樣代謝過程，產生一些對維持植物生長發育起著一定作用化合物，如生物堿、黃酮、芳香物質等，合成這些化合物過程稱之為次級代謝。由次級代謝產生物質稱為次生物質或次生代謝產物。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第3頁3）植物次級代謝作用:植物次級代謝對于植物整個生命活動含有主要意義。協調植物與周圍環境相互作用，如植物與昆蟲、植物與微生物以及植物之間相互作用。有利于植物繁殖，如能夠吸引其它動物來授粉。植物次級代謝產物是決定人類食物質量主要方面，如味覺、顏色、氣味等。而且植物色素能表達植物和花多樣性。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第4頁初級代謝和次級代謝關系及代謝主要路徑

在高等植物中，次級代謝主要系統是從糖酵解系統(EMP)，磷酸戊糖循環（PPPorHMP)，檸檬酸循環(TCA)等初級代謝中間產物派生出來三個路徑莽草酸路徑、甲瓦龍酸路徑、多酮化路徑，借助這3個合成路徑和氨基酸合成路徑相結合生成生物堿、萜烯、黃酮類等次級代謝產物。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第5頁初級代謝和次級代謝關系茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第6頁1）初級代謝對次級代謝調整初級代謝許多主要中間產物是次級代謝始點，因而可經過調控初級代謝而增加次級代謝產量和各種次級代謝百分比。當鹽酸乙胺添加到培養基中，在茶樹愈傷組織中氨基酸積累大大提升，而多酚類、咖啡堿積累則下降。次級代謝調整

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第7頁2）次級代謝酶促調整在高等植物中，多酚類化合物合成是由莽草酸路徑合成芳香族氨基酸后深入合成。而在這其中苯丙氨酸裂解酶（PAL，phenylalanineammonialyase)起著主要作用。如茶樹新梢中PAL以芽最高，按第一葉、第二葉、嫩莖次序遞減，隨葉片成熟與老化而降低，多酚類則也伴隨葉片老化而下降。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第8頁3）環境原因對次級代謝調整和初級代謝相類似，在一定程度范圍內，高等植物次級代謝受環境原因影響和調整。如激素、光照、溫度、肥料等都會對次級代謝起著調整作用。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第9頁第二節茶樹中生物堿代謝1、茶樹體內咖啡堿分布2、茶樹體內咖啡堿生物合成咖啡堿生物合成部位咖啡堿生物合成中嘌呤環起源及嘌呤環甲基化（嘌呤環直接生物合成；核酸降解；嘌呤甲基化）嘌呤合成代謝與咖啡堿生物合成路徑咖啡堿生物合成中主要酶3、茶樹體內咖啡堿分解茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第10頁茶樹中生物堿以嘌呤堿為主，而嘌呤堿中又以咖啡堿為主體成份。咖啡堿為茶樹特征性成份之一。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第11頁一、茶樹體內咖啡堿分布茶樹體內咖啡堿是從茶籽萌發開始形成，今后就一直參加茶樹體內代謝活動，并貫通與生命活動一直。咖啡堿廣泛地分布在茶樹體內。但各部位含量，差異很大。除種子外，其它各部位均含有咖啡堿。并比較集中地分布在新梢部位，以葉部最多，莖梗中較少，花果中更少。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第12頁咖啡堿是比較集中地分布在新梢部位，但新梢中各部位含量又不相同。以嫩芽葉含量最多，老葉最少。說明咖啡堿在新梢中含量是隨芽葉老化而降低，所以咖啡堿能作為茶葉老嫩度標志成份之一。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第13頁茶樹新梢中咖啡堿生成量還隨品種、氣候、栽培條件不一樣而有改變。在不一樣品種中，云南大種常比普通品種咖啡堿含量高。在不一樣季節中，夏茶常比春茶和秋茶含量高。在不一樣栽培條件中，遮陰和施肥，常比露天和不施肥含量高。這些生育中動態改變，都是茶樹體內咖啡堿因代謝受不一樣環境條件影響，從而造成不一樣條件下咖啡堿含量差異。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第14頁二、茶樹體內咖啡堿生物合成

咖啡堿生物合成部位

研究表明，咖啡堿是在茶樹幼嫩葉片中進行生物合成，而在莖、根與子葉中合成能力能低甚至沒有。而茶花中亦能合成咖啡堿。細胞中合成部位則是在葉綠體中。在葉綠體中含有咖啡堿生物合成所需酶類。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第15頁咖啡堿生物合成中嘌呤環起源及嘌呤環甲基化

咖啡堿結構特點是黃嘌呤，在1，3，7位置N上連接3個甲基，生物合成中，一需要嘌呤環起源，二需要甲基供體。

茶樹中咖啡堿生物合成嘌呤環，既可來自甘氨酸、谷酰胺、甲酸鹽和CO2直接合成，又可來自核酸代謝核苷酸代謝庫中嘌呤，其中核苷酸庫中腺嘌呤是咖啡堿合成最有效前體。咖啡堿合成中甲基主要起源于S-腺苷蛋氨酸，而轉甲基作用則依賴于N-甲基轉移酶活性。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第16頁嘌呤環生物合成

應用同位素標識法對表明嘌呤中各氮、碳原子先質起源進行了詳細研究。結果證實，環中C4、C5分別來自甘氨酸中羧基和α-碳原子。N7來自甘氨酸中氨基。C2、C8來自甲酸鹽，N3、N9來自谷氨酰胺，N1來自天冬氨酸，C6來自CO2,如圖。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第17頁嘌呤環生物合成不是先形成游離嘌呤骨架而后轉變成嘌呤核苷酸，而是首先以核糖-5-磷酸為起始物質，并在此基礎上逐步將先質中碳、氮原子一個一個連接而成次黃嘌呤核苷酸。詳細過程以下。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第18頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第19頁以上合成次黃嘌呤是形成其它嘌呤核苷酸先質,由它可轉變成腺苷酸、黃苷酸、鳥苷酸。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第20頁生物體內除上述方式合成嘌呤核苷酸外，尚能利用已經有嘌呤堿和核苷形成嘌呤核苷酸。現已知道，嘌呤堿與1-磷酸核糖經過核苷磷酸化酶作用，可生成嘌呤核苷，后者再經核苷磷酸激酶作用，由ATP供給磷酸基，即形成嘌呤核苷酸。嘌呤堿與5-磷酸核糖焦磷酸經過核苷酸焦磷酸化酶作用，也可形成嘌呤核苷酸。其反應以下：茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第21頁由此可知，腺嘌呤能夠合成腺嘌呤核苷酸，鳥嘌呤能夠合成鳥嘌呤核苷酸。這些嘌呤核苷酸產生，在生物體內除參加核酸合成外，還能轉化成各種嘌呤衍生物。在茶樹體內用于合成生物堿嘌呤大多來自核苷酸庫，庫中腺嘌呤核苷酸被認為是最有效前體，由它可在一系列酶作用下轉化成為咖啡堿。

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第22頁核酸降解

因為核酸組成中有嘌呤核苷酸，當大分子核酸降解時，就有許多腺苷酸和鳥苷酸從結合態中游離出來，而它們又能分別轉化為次黃嘌呤核苷酸和黃嘌呤核苷酸。因為這些嘌呤核苷酸相互轉化，能夠為咖啡堿合成提供嘌呤環起源，所以核酸降解與咖啡堿合成有親密關系。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第23頁以上嘌呤起源路徑可看出，不論是直接合成，還是核酸降解，它們和咖啡堿合成關系，都是嘌呤核苷酸為咖啡堿提供嘌呤環起源結果。而嘌呤核苷酸既是合成原料，又是核酸降解產物，當核酸合成時，就經過直接合成路徑形成嘌呤核苷酸，當核酸降解時，又能游離出嘌呤核苷酸。所以，咖啡堿中嘌呤環起源實際上是和核酸代謝相關。當然也不能排除咖啡堿能夠經過嘌呤基重新再利用路徑來合成嘌呤核苷酸可能。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第24頁嘌呤甲基化（1）甲基供給體咖啡堿中嘌呤環上直接甲基供體為S-腺苷蛋氨酸，它是由蛋氨酸與ATP作用轉化而來。

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第25頁

蛋氨酸活化為S-腺苷蛋氨酸后即可提供甲基，當供出甲基后，變成S-腺苷同型半胱氨酸，它脫去腺苷，就變成同型半胱氨酸。而它再接收甲基，又能變成蛋氨酸。蛋氨酸再活化后，又產生S-腺苷蛋氨酸。這么循環往復，在生物體內形成蛋氨酸甲基轉移循環。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第26頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第27頁(２)甲基轉移和甲基化次序

咖啡堿合成中，嘌呤甲基化過程，是先由7-甲基黃嘌呤甲基化形成可可堿（3，7-二甲基黃嘌呤），再由可可堿甲基化形成咖啡堿。咖啡堿嘌呤環上甲基是由Ｓ-腺苷蛋氨酸供給，在甲基轉移酶作用下，按7、3、1氮原子位置先后次序進行甲基化作用。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第28頁(三)、茶樹體內嘌呤合成代謝與咖啡堿生物合成路徑

1、腺苷酸琥珀合成酶與裂解酶；2、AMP脫氨酶；3、IMP脫氫酶；4、GMP合成酶；5、GMP脫氨酶；6、GMP還原酶；7、核苷激酶或核苷轉磷酸酶；8、5′-核苷酸酶或磷酸酶；9、11、12、N-甲基轉移酶；10、N-甲基核苷酶；13、鳥嘌呤核苷脫氨酶；14、PRPP合成酶。

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第29頁(四)咖啡堿生物合成中主要酶

N-甲基轉移酶茶樹體內只有三種N-甲基轉移酶，分別為黃嘌呤核苷N-甲基轉移酶(7-NMT)、7-甲基黃嘌呤N-甲基轉移酶(3-NMT)和可可堿N-甲基轉移酶(1-NMT)。其中以3-NMT活性最高，它活性是7-NMT和1-NMT活性總和10倍以上，所以，在生物合成旺盛芽葉中，經常有可可堿大量積累。H.Ashihara等研究發覺，四個月茶樹幼苗中咖啡堿主要分布在葉片內，而合成咖啡堿先質可可堿只存在嫩葉中，咖啡堿是在嫩葉中經可可堿合成。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第30頁茶樹中咖啡堿合成酶(Caffeinesynthase,CS)為3-NMT

和1-NMT總稱。即催化由7-甲基黃嘌呤生成咖啡堿兩步反應。茶葉中咖啡堿合成酶已經得到分離純化，并對性質進行了全方面研究(KatoM.MizunoK.etal.1999)而且，茶樹中咖啡堿合成酶基因cDNA全長已經克隆(KatoM.MizunoK.etal.)

，催化甲基化反應兩種N-甲基化轉移酶(3-NMT

、1-NMT)很多性質相同，比如，最適pH值均為8.5,Mg2+、Ca2+和Mn2+都能微弱刺激酶活性，Hg2+和Cu2+能強烈抑制酶活性，巰基試劑對活性幾乎沒有影響，有些人把兩種酶看作同一個酶，稱為咖啡堿合成酶(Caffeinesynthase,CS)(SuzukiT.andTakahashiE.1975)。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第31頁若以黃嘌呤核苷和嘌呤核苷酸為底物，則不能檢測到咖啡堿合成酶活性。上述研究表明最少有兩種不一樣N-甲基轉移酶(7-NMT,咖啡堿合成酶)參加了咖啡堿合成。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第32頁N.Fujimori等測定了茶樹體內嘌呤堿生物合成中N－甲基轉移酶與5-磷酸核糖焦磷酸酯（PRPP，phosphaoribosylpyrophosphate）合成酶活性，發覺N-甲基轉移酶在四、五月份茶樹葉片上活性最強，但到七、八月份酶活性就消失，而PRPP合成酶活性依然維持到可檢測水平。這說明咖啡堿生物合成能力主要決定于N-甲基轉移酶活性，所以可望經過對N－甲基轉移酶誘導與抑制來調控茶樹體中咖啡堿合成。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第33頁N-甲基核苷酶此酶為水解酶，主要是催化7-甲基黃嘌呤核苷水解脫去核糖而轉變為7-甲基黃嘌呤反應。其分子量大約為55,000，最適pH為8.0-8.5,最適溫度為40-450C。它是咖啡堿合成中一個調整酶，假如沒有該酶對7-甲基黃嘌呤核苷水解，以后嘌呤甲基化，進而生成咖啡堿反應就無法進行。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第34頁次黃嘌呤核苷酸脫氫酶（IMPDH,inosinemonophosphatedehydrogenase）該酶催化咖啡堿生物合成路徑中由次黃嘌呤核苷酸脫氫產生黃嘌呤核苷酸過程。此酶最適pH范圍較寬（8.8~9.8）。受嘌呤核苷酸抑制，抑制敏感性為GMP＞XMP＞AMP。IMPDH可能是嘌呤類核苷酸轉化為咖啡堿和鳥嘌呤核苷酸合成關鍵酶類。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第35頁AMP脫氨酶(adenosinemonophosphatedeaminase)此酶是催化腺苷酸脫氨產生次黃嘌呤核苷酸反應。FujimoriN,AshiharaH,(1993)研究了茶樹花芽中嘌呤堿生物合成，試驗表明[8-14C]腺嘌呤在雄蕊中先轉化成腺嘌呤核苷酸，然后轉化成可可堿和咖啡堿，假如加入AMP脫氨酶抑制劑（Coformycin），能夠抑制轉化成嘌呤堿放射強度。說明從腺嘌呤核苷酸合成咖啡堿受AMP脫氨酶活性所調控。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第36頁三、茶樹體內咖啡堿分解

咖啡堿分解與腺嘌呤和鳥嘌呤分解相類似，都是先脫去環上基團，變成黃嘌呤。所不一樣是腺嘌呤和鳥嘌呤脫去是氨基，而咖啡堿脫去是甲基，脫下甲基又能夠經過四氫葉酸載體，在對應酶作用下，轉移到其它化合物中。黃嘌呤會有兩種去向，一個是繼續分解，另一個也可能又轉化為其它嘌呤核苷酸被再利用。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第37頁黃嘌呤分解代謝路徑

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第38頁植物體內這類嘌呤堿分解代謝主要發生于老葉，分解后生成尿酸，尿囊素可從葉子中轉運出來，作為貯備物質到春天生長時再重新利用。而茶樹體內黃嘌呤分解產物中，又是以尿酸和尿囊素為主。所以這種形式分解產物，在茶樹體內還有貯藏組分作用。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第39頁人們飲茶后，咖啡堿進入人體內分解情況有所不一樣，因為人體內缺乏分解尿酸能力，所以咖啡堿在人體內除脫去部分甲基外，就被氧化成尿酸，所以大部分是以甲基尿酸或尿酸形式排出體外，而不在體內積累，所以不會對人體造成危害。血中尿酸正常含量：149-416μmol/L，溶解度低。一旦嘌呤代謝障礙時，血中尿酸濃度升高，尿酸鹽結晶沉積于軟組織、軟骨及關節等處，而造成關節炎、尿路結石及腎臟疾病。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第40頁由咖啡堿合成與分解研究可知，茶樹體內咖啡堿代謝和核酸、蛋白質代謝緊密相連。核酸中嘌呤核苷酸，蛋白質中蛋氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸等都和咖啡堿合成相關。所以，在核酸、蛋白質代謝旺盛嫩葉中，咖啡堿含量最多，伴隨芽葉老化，代謝強度減弱，以及嘌呤本身分解代謝加強，老葉中咖啡堿含量顯著降低。它們之間這種顯著相關性，也說明咖啡堿在茶樹體內是主動參加新梢中物質代謝活動，并隨代謝強度改變而改變。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第41頁本節小結咖啡堿分布：茶樹體內除種子外，其它各部位均含有咖啡堿。主要分布在茶新梢部位，以芽、葉部最多而且伴隨葉部老化而降低。在莖梗中較少，花果中更少。咖啡堿生物合成部位：主要是在茶樹幼嫩葉片中合成，另外茶花中也可進行咖啡堿生物合成。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第42頁咖啡堿生物合成

1、嘌呤環起源

直接生物合成：以核糖-5-磷酸為起始物，分別由甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甲酸鹽、二氧化碳提供對應C、N原子，按N9-（C4-C5-N7）-C8-N3-C6-N1-C2次序合成次黃嘌呤核苷酸。核酸降解：核酸降解產生腺嘌呤為咖啡堿最有效合成前體。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第43頁2、嘌呤甲基化由蛋氨酸在腺苷酸轉移酶催化下經ATP活化后產生S-腺苷蛋氨酸提供甲基。甲基化次序為N7-N3-N1。3、咖啡堿合成路徑及主要酶

咖啡堿降解茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第44頁作業題什么是植物次級代謝？茶樹中有哪幾類特征性次級代謝產物？茶樹中咖啡堿嘌呤環中C、N起源？咖啡堿最有效合成前體、甲基供體、生物合成中主要酶類分別是什么？茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第45頁第三節茶樹中茶氨酸代謝

一氨基酸在茶樹中分布二茶氨酸生物合成

1.茶氨酸合成酶

2.茶氨酸生物合成先質（谷氨酸、乙胺）三茶氨酸分解代謝四茶氨酸規模化發酵生產茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第46頁茶氨酸，一個非蛋白質氨基酸，是茶葉中特色成份之一，占茶葉干重1-2%、占整個游離氨基酸70%。除茶氨酸外，茶葉中還含有一定量谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、天冬氨酸。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第47頁一、氨基酸在茶樹中分布發芽前后種子中主要氨基酸是茶氨酸和精氨酸；當幼根和莖葉開始生長時，所含氨基化合物由子葉中蛋白質水解產物運輸而來。當幼苗開始分化時，則吸收無機氮合成氨基酸。茶樹氨基酸在各個組織都含有，但含量差異較大。游離氨基酸以第一葉最高、莖木質部最低。茶氨酸在各組織（果實除外）含量都十分突出，以芽葉最高，第二、三及四五葉依次下降。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第48頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第49頁

茶樹因施肥種類不一樣，氨基酸分配和積累有顯著差異，施用銨態氮肥早期，茶樹體谷氨酰胺濃度急劇上升，茶樹根部茶氨酸、精氨酸和谷氨酰胺濃度也呈直線上升，但很快，除茶氨酸濃度仍繼續提升外，其它氨基酸都有所下降。這時，地上部分以精氨酸為主，根部主要是茶氨酸。硝態氮肥用量與根部氨基酸類化合物濃度不展現上述關系。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第50頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第51頁

茶樹氨基酸尤其是茶氨酸積累和分布也與其轉移速度和利用速度相關。茶樹氨基酸中以谷氨酸在茶樹中利用最快，而茶氨酸貯存期長，因為茶氨酸由根部轉移到葉部速度和葉部利用速度都比谷氨酰胺慢，新梢中茶氨酸從萌發開始就含有較高含量，伴隨新梢生長一直保持較高水平，這一點亦可看作茶氨酸在新梢中含量高理由。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第52頁

冬季茶樹處于休眠期，茶氨酸和谷氨酰胺主要貯存在根部，精氨酸則貯存于地上部，谷氨酸在各器官中含量均較高。茶樹根部貯存養分對翌年春茶萌發時往新梢中運輸，對新梢生長發育起著較大作用。氨基酸季節性改變規律顯著，按氨基酸總量和茶氨酸表現出春高、秋低、夏居中趨勢，而精氨酸則相反。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第53頁二茶氨酸生物合成

1.茶氨酸合成酶（theaninesynthase)茶氨酸合成酶催化由L-谷氨酸和乙胺合成茶氨酸反應。該酶最適pH為7.5左右，對Mg2+離子濃度有依賴性。茶氨酸合成酶底物特異性很強，一樣反應條件下，用D-谷氨酸、L-α-氨基己二酸或L-天冬氨酸替換L-谷氨酸均不能與乙胺反應生成茶氨酸。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第54頁2.茶氨酸生物合成先質日本佐佐岡啟等人同位素試驗結果表明，谷氨酸和乙胺可能是形成茶氨酸直接先質。而且在生物合成中需要ATP活化。今后，小西茂毅等研究表明茶氨酸是在茶樹根部由乙胺與L-谷氨酸生物合成。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第55頁（1）茶根中，谷氨酸合成路徑及相關酶性質

谷氨酸脫氫酶（GDH，glutamatedehydrogenase)催化還原氨基化反應合成谷氨酸

茶樹利用銨態氮，形成茶氨酸等氨基酸和酰胺，首先要經過這一路徑。

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第56頁

茶樹根部GDH在氨基化反應過程中，存在基質抑制現象，即當α-酮戊二酸濃度、NH4+濃度超出一定值時，酶活性受到抑制。

GDH催化氨基化反應，用NADH+H+

做輔酶，比用NADPH+H+

作輔酶，親和性要強9倍。

Zn2+、Ca2+

、Mg2+

等金屬離子影響GDH氨基化反應。添加適量Ca2+

、Mg2+能提升酶活性，當濃度超出一定范圍時則對酶活性有抑制作用。Zn2+對此酶則表現顯著抑制作用。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第57頁茶樹含有喜銨性和耐銨性，盡管茶園施用較多量銨態氮，但茶樹根部存在高效率將銨態氮轉變成谷氨酸能力。高濃度谷氨酸雖有抑制此酶催化氨基化反應，但茶樹能夠很快地將體內谷氨酸轉換成谷氨酰胺，茶氨酸之類酰胺或其它氨基酸，因而，消除了這種抑制。這一研究結果，解釋了在茶樹吸收高濃度銨態氮時，而茶根部谷氨酸濃度并不太高，而是大大地提升了茶氨酸和谷氨酰胺濃度現象。也就是說，茶樹根部吸收了銨態氮，但并不以L-谷氨酸形態積累，而是很快地將谷氨酸轉換成茶氨酸等酰胺類化合物。

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第58頁在谷氨酰胺合成酶/谷酰胺-α-酮戊二酸氨基轉移酶（GS/GOGAT）系作用下合成谷氨酸路徑

GS/GOGAT:glutaminesynthase/glutamine:2-oxoglutarateaminotransferase谷酰胺-α-酮戊二酸氨基轉移酶，即谷氨酸合成酶茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第59頁研究認為，在高等植物內，這一GS/GOGAT路徑可能是氮同化主要路徑。谷酰胺-α-酮戊二酸氨基轉移酶，它與轉氨酶不一樣，既催化轉氨作用，又催化α-酮戊二酸還原氨化，為了把它和普通轉氨酶區分開來，又將它稱為谷氨酸合成酶。現在普通稱為GS／GOGAT路徑。茶樹是多年生作物，又是一個喜銨性作物，耐銨性比普通植物強，多量施用銨態氮亦未見銨中毒現象。尤其引人注目標是茶樹體內大量積累著茶樹特有酰胺—茶氨酸，那么茶樹經過GS/GOGAT酶系對銨態氮利用是必定。

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第60頁用L-蛋氨酸-DL-亞砜基亞胺（谷酰胺合成酶和谷氨酸合成酶抑制劑）處理茶實生苗后，發覺茶苗根部合成氨基酸和酰胺能力顯著降低。同時發覺用L-蛋氨酸-DL-亞砜基亞胺處理茶根，并不影響GDH活性。說明抑制效應主要發生在對GS/GOGAT抑制作用上。研究表明，在普通情況下GDH只起著輔助GS/GOGAT系作用。也就是說，茶根利用銨態氮合成氨基酸及其酰胺，是以GS/GOGAT系起著主導作用。倘若此酶受到抑制時，根部茶氨酸等酰胺化合物濃度便趨于下降。顯然，抑制了茶樹體內GS／GOGAT酶系，就幾乎抑制了茶樹體內茶氨酸生物合成。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第61頁（2）茶氨酸生物合成前導物—乙胺代謝同位素標識研究表明，茶氨酸乙胺部分是來自于丙氨酸降解產物乙胺。茶根只要同時吸收L-丙氨酸和L-谷氨酸就能夠合成L-茶氨酸。茶樹體內，根和茶芽葉中都有茶氨酸合成酶，為何茶氨酸僅在茶根部合成？這是因為由L-丙氨酸脫羧形成乙胺反應只能在根部進行，而不能在莖或其它器官中進行。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第62頁茶樹體內茶氨酸合成路徑

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第63頁三茶氨酸分解代謝

茶樹體內，茶氨酸降解，有它獨特地方。首先是酰胺鍵酶促水解，而不是馬上脫胺或脫羧。水解生成谷氨酸和乙胺，生成乙胺，部分地參加兒茶素合成。研究表明茶氨酸降解代謝與光照相關，遮蔭葉片茶氨酸含量高，這是因為弱光對茶氨酸分解有抑制作用，從而抑制了茶氨酸向兒茶素轉化，使茶氨酸得以積累，這對提升茶葉品質有主要作用。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第64頁茶氨酸降解生成乙胺，在茶樹中深入怎樣代謝，研究還不夠。不過從植物生化研究表明，植物體內存在有胺氧化酶，使乙胺氧化生成乙醛。乙醛普通可氧化變成乙酸，乙酸可進入三羧循環，或進行其它轉化。如乙酸可進行烯醇化產生乙烯醇。三分子乙烯醇聚合(脫氫……)可生成間苯三酚和鄰苯二酚，再深入轉化生成兒茶素和沒食子兒茶素。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第65頁四茶氨酸規模化發酵生產

茶氨酸即使為茶樹獨有氨基酸，而利用微生物發酵方法大規模合成L-茶氨酸已成為現實。1993年，日本報道了用k-甲叉菜膠固定一個硝酸還原假單胞z細菌IF012694（Pseudomonasnitroreducens）大規模生產茶氨酸。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第66頁詳細方法是將浸泡在0.9%NaCl中4.5%k-甲叉菜膠在80℃下溶化，冷卻至45℃后與細胞混合，使其固定為直徑3mm左右顆粒，再填充于四根1.7×40cm柱狀反應器中。在30℃下，50mM硼酸緩沖液（pH9.5）中，以0.3ML-谷氨酰胺和0.7M乙胺為底物,以0.3個床體積每小時流速經過反應器。采取這種方法固定細胞，其合成反應活性可維持幾個星期，反應器半壽期預計可達120次反應，第51次合成反應時，茶氨酸產量仍到達40mmol/h。

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第67頁用于合成茶氨酸硝酸還原假單胞Z細菌細胞固定化

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第68頁①L-谷氨酰胺，②乙胺，③送液泵，*1恒溫循環水

利用固定化細胞填裝反應器生產茶氨酸茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第69頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第70頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第71頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第72頁茶細胞培養生物合成茶氨酸利用植物細胞發酵生產各種天然次級代謝產物是近代生物技術細胞工程研究和開發領域,自20世紀90年代以來,有不少資料報道了利用茶樹細胞培養生產茶氨酸。結果表明ＭＳ培養基為茶氨酸積累最適培養基,外加適量ＩＡＡ、6ＢＡ或ＩＢＡ等,同時,添加鹽酸乙胺、谷氨酸等前體能夠顯著促進茶氨酸合成。另外普遍認為暗培養利于茶氨酸生成。不過,因為產量低(最高達194±16ｍｇ/ｇ干細胞重),產品分離純化過程復雜及生產工藝控制難度大等限制了該方法工業化。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第73頁構建工程菌生物合成茶氨酸伴隨當代基因工程操作技術發展,經過構建茶氨酸合成酶基因轉化工程菌能夠實現微生物發酵直接生產茶氨酸,但需要對茶氨酸合成酶有深入研究,而當前茶氨酸合成酶基因研究仍為空白,相關茶氨酸合成酶研究,國內、國外報道甚少。由工程菌合成茶氨酸,要處理構建ＡＴＰ再生系統問題。ＴａｋａｓｈｉＴａｃｈｉｋｉ等用微生物發酵法合成茶氨酸時是以細菌谷氨酰胺合成酶匹配酵母ＡＴＰ再生系統,不過因為反應體系復雜,茶氨酸產量不高。而工程菌能夠實現茶氨酸合成酶基因表示及ＡＴＰ再生系統構建于同一菌株。進而開辟茶氨酸生物合成新路徑。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第74頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第75頁本節小結茶氨酸是茶葉特征性成份之一，占茶葉整個游離氨基酸70%以上。在茶樹中芽葉含量最高，第二、三及四五葉含量依次下降。同時，以春茶中含量最高，夏茶和秋茶依次降低。在冬季茶樹休眠期間茶氨酸逐步積累，以供明年春梢萌發之用。施用銨態氮肥有利于茶氨酸積累。茶樹體內茶氨酸分布茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第76頁茶氨酸是在茶樹根部由茶氨酸合成酶催化L-谷氨酸和乙胺合成而來。茶氨酸生物合成茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第77頁茶氨酸前體谷氨酸主要是在谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）體系中生物合成而來。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第78頁谷氨酸起源還存在一個次要合成路徑，即在谷氨酸脫氫酶作用下，由α-酮戊二酸加氨合成。茶氨酸另一前體乙胺是在丙氨酸脫羧酶作用下由丙氨酸脫羧反應而成。因為丙氨酸脫羧酶只存在于茶樹根部，盡管茶氨酸合成酶分布在各個組織，但茶氨酸只能在根部合成。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第79頁茶氨酸降解茶氨酸降解時，先進行酰胺鍵水解，產生谷氨酸和乙胺。谷氨酸可進入三羧酸循環進行代謝。而乙胺可在胺氧化酶作用下產生乙醛，再經烯醇化作用產生乙烯醇，再深入轉化生成兒茶素和沒食子兒茶素。

遮蔭條件下，可抑制茶氨酸向兒茶素轉化，茶氨酸得以積累，從而提升茶葉品質。茶氨酸規模化發酵生產：已利用微生物發酵中產生茶氨酸合成酶由L-谷氨酸和乙胺進行合成。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第80頁作業題不一樣葉位、不一樣季節對新梢中茶氨酸含量影響？簡述茶氨酸及其前體生物合成路徑及包括酶系？茶氨酸生物合成部位？從茶樹中氨基酸代謝路徑解釋茶樹為何有喜銨耐氨特征。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第81頁第四節茶樹中多酚類物質代謝

一、多酚類物質在茶樹體內分布二、茶樹體內多酚物質形成與轉化

1.兒茶素在茶樹體內形成

2.兒茶素生物合成路徑（莽草酸路徑）莽草酸、苯丙酸鹽、兒茶素三、茶樹中多酚類分解代謝茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第82頁一.多酚類物質在茶樹體內分布

茶葉中含有大量多酚類化合物，含量普通為干重15-35%，表現為茶葉澀味。黃烷醇類化合物在茶葉中含有12-24%干量，占多酚類總量80%左右。其中以EGCG為主要成份，含量常占黃烷醇總量50%。而EC，C，GC和D-GC等含量較少，總共只占黃烷醇類總量10%左右。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第83頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第84頁多酚類在茶樹體內分布，主要集中在茶樹新梢生長旺盛部分，老葉、莖、根內含量少些，尤其是根中含量極微，而且只含有非酯型兒茶素L-EC和D，L-C。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第85頁茶樹新梢不一樣伸育程度，黃烷醇類化合物含量與組成差異很大，尤其是L-EGCG，L-EGC和L-ECG改變顯著。L-EGCG、L-ECG隨伸育程度增加含量漸次降低，而L-EGC卻有增加趨勢。黃烷醇類總量在幼嫩新梢中含量較高，而粗老茶梢中含量較低。嫩葉中兒茶素沒食子酰基化作用能力較強，伴隨伸育而降低，但兒茶素羥基化作用卻隨伸育而增強。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第86頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第87頁不一樣品種茶樹，多酚類含量與組成是有差異。云南大葉種黃烷醇類含量較高，而小葉種龍井種含量較低。普通來說，茶葉中黃烷醇類化合物組成中以L-EGCG含量最高，其次是L-ECG和L-EGC，但在云南大葉種中L-ECG含量較多,幾乎靠近L-EGCG含量，而且L-EC和D，L-C含量卻超出了L-EGC。云南大葉種芽葉中黃烷醇類含量與組成異于別品種，被認為是它保持了原始特征關系，這對判別茶樹品種原始性方面是有意義。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第88頁茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第89頁茶葉中黃烷醇類化合物含量也隨不一樣季節而有改變，夏梢中黃烷醇類含量最高，秋梢次之，春梢最少。從其組成來看：L-EGCG含量能反應出不一樣季節新梢嫩度或品質。

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第90頁茶葉中多酚類含量與組成和茶樹栽培環境條件與技術辦法親密相關。栽培在不一樣海拔高度茶樹新梢中黃烷醇類以及黃酮苷含量不一樣。普通超出一定海拔高度（約500米）時，多酚類含量隨海拔增加而降低。

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第91頁干旱季節進行澆灌能提升茶葉中多酚類含量。適當增施磷肥或有機肥料均能提升茶葉中多酚類含量。夏季光照過強時適度遮蔭不但能使茶樹生長勢好，“持嫩性”強，而且能使多酚類含量保持一定水平（過分遮蔭會使其含量降低）。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第92頁植物中類黃酮物質形成受外界環境條件影響，尤其是光影響較大。遮蔭降低光照而直接影響到L-EC形成，但對兒茶素沒食子酸酯化作用影響較小。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第93頁茶葉色澤不一樣，黃烷醇類含量與組成則有差異。紫色芽葉中黃烷醇類含量較高，黃綠色芽葉次之，深綠色芽葉含量較低。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第94頁總之，茶葉中多酚類含量與組成是和外界環境條件矛盾統一集中表現，它隨品種、老嫩、自然環境條件、施肥、采摘等不一樣而有差異。因而，搞清茶樹中多酚類物質相互轉化與分解代謝，在茶樹生理生化研究中有主要意義，對提升茶葉產量及質量，改良茶樹品種和茶多酚人工合成與利用有主要作用。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第95頁二、茶樹體內多酚物質形成與轉化

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第96頁(一).兒茶素在茶樹體內形成

(一)兒茶素在茶樹體內形成試驗證實，休眠茶樹種子胚中黃烷醇類化合物含量微少，從茶樹種子萌發開始，就伴伴隨黃烷醇類合成，并一直進行，而且黃烷醇分布于茶樹植株各個部分。種子萌發中，首先形成是非酯型兒茶素如D,L-C，L-EC。隨即經羥基化，沒食子酰基化而形成沒食子基兒茶素和兒茶素沒食子酸酯等，如：L-EGC，L-EGCG等。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第97頁詳細情況以下：（1）25~30天幼苗最初形成了D,L-C和L-EC。（2）40~45天幼苗已經有D,L-C和L-EC，L-ECG，GCG和L-EGCG五種。已能進行羥基化和沒食子酰基化，出現了酯型兒茶素。（3）60~70天幼苗除上述五種兒茶素外，又增加了L-EGC和D,L-GC，根中只有D,L-GC，D,L-C和L-EC，而幼苗莖部各種兒茶素都含有。（4）150天幼苗，根中有D,L-GC，D,L-C和L-EC，木質化莖中有D,L-GC，D,L-C，L-EC，L-EGCG和L-ECG。下部葉中與新梢都含有上述各種兒茶素。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第98頁

綜合上述情況可看出：茶籽萌發和幼苗生長過程中，最初形成是非酯型兒茶素，后經羥基化和沒食子酰基化形成了沒食子基兒茶素和兒茶素沒食子酸酯。生長60—70天幼苗中便含有成長茶樹新梢所含有各種兒茶素了。酯型兒茶素只有在茶樹地上部分才含有，而根部僅有非酯型兒茶素，看來沒食子酰基化作用在根部是缺乏。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第99頁(二)茶葉中兒茶素生物合成路徑

同位素示蹤法試驗證實：兒茶素分子中A環來自‘乙酸鹽’單位，由三個乙酸分子頭尾相接形成；茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第100頁B環與C環上碳原子則來自莽草酸路徑(shikimicacidpathway)；然后，A環和B環縮合成查爾酮，深入形成C6-C3-C6環。兒茶素生物合成大致可分為以下三個步驟：1.合成莽草酸；2.形成苯丙酸鹽；3.兒茶素合成。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第101頁1、莽草酸（shikimicacid）合成路徑

莽草酸是植物和微生物中芳香氨基酸生物合成關鍵中間體，而且莽草酸路徑也是高等植物特有生物合成路徑，它本身是碳水化合物代謝產物。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第102頁莽草酸合成路徑以下：（1）磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和D-赤蘚糖-4磷酸鹽，進行立體專一縮合反應，形成了3-脫氧-D-7磷酸阿拉伯庚酮糖酸（DAHP）；茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第103頁（2）DAHP閉環形成去氫奎尼酸，再經可逆去氫作用形成去氫莽草酸，再產生莽草酸及其3-磷酸鹽；茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第104頁（3）再與一個PEP縮合產生磷酸鹽化合物,經1、4-消除轉變為分支酸，然后形成芳香氨基酸。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第105頁在茶樹枝條中，莽草酸作為兒茶素和黃酮類化合物前體要比L-苯丙氨酸和肉桂酸愈加有效。（zaprometor和Bukhlaeva,1968,1971），預示著可能存在3,4,5-三羥基肉桂酸可從莽草酸經過更直接路線越過肉桂酸而形成，也說明由莽草酸形成兒茶素和黃酮類化合物，不一定非經過苯丙氨酸。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第106頁2、苯丙酸鹽形成

苯丙氨酸是苯丙酸鹽路徑起始物，也是將植物細胞初級代謝與次級代謝相連接主要物質。在此路徑中，有3個酶將苯丙氨酸轉化為對香豆酰CoA，即苯丙氨酸解氨酶(PAL)，桂皮酸(肉桂酸)-4-羥基化酶(C4H)和4-香豆酸、輔酶A連接酶(4CL)。（注：4-羥基桂皮酸又稱對-香豆酸）香豆酰CoA是植物次生代謝中又一主要中間產物。此物質可用于合成許多植物次生代謝產物：類黃酮類物質、木質素等。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第107頁PAL：苯丙氨酸裂解酶phenylanineammonialyaseC4H：肉桂酸-4-羥基化酶cinnamate-4-hydroxylase4CL：4-香豆酸輔酶A連接酶4-coumaroyl:CoA-ligase

TAL：酪氨酸氨裂解酶tyrosineammonia

lyase4茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第108頁3兒茶素合成路徑

茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第109頁在兒茶素生物合成中當前比較清楚是（+）-兒茶素合成，在茶樹中占主導地位表兒茶素和兒茶素沒食子酸酯生物合成路徑還不是非常清楚。依據現有研究資料，推測表兒茶素合成需要一個表異構化酶作用，在二氫槲皮素或其稍后階段改變中間產物立體構型，再經特異酶作用形成表兒茶素，但當前還沒相關于兒茶素沒食子酸酯形成研究報道。茶葉生物化學茶樹次級代謝專家講座第110頁Flavonoidbiosynthesis