比色法和分光光計分析法第1頁/共61頁光電比色法(分光光度法):

隨著近代分析儀器的發展,目前已普遍使用光電比色計(分光光度計)通過測量有色溶液對入色光的吸收程度對物質進行分析,稱為光電比色法(分光光度法)。第2頁/共61頁與目視比色法相比,光度法的特點:①靈敏度高;10-5~10-6mol/L②準確度較高;③儀器設備較簡單,操作簡便、快速；④應用廣泛。第3頁/共61頁(2)光的性質和物質的顏色光的性質:光是一種電磁波,具有波粒二象性。光的波動性可用波長來描述,其單位常用納米(nm)表示,波長越短,能量越高。第4頁/共61頁

具有同一波長的光稱為單色光,由不同波長光組成的光稱為復合光。第5頁/共61頁

互補色光:若將兩種顏色的光按適當的強度比混合可成白光,那么這兩種光稱為互補色光。第6頁/共61頁物質的顏色:

物質對光的吸收是具有選擇性的。當一束白光通過溶液時,若溶液對各種色光都不吸收,則白光全部通過,

溶液呈無色透明;若各種色光幾乎全被吸收,則溶液呈黑色;若溶液只吸收某種色光,則溶液呈透過光的顏色,也就是說,溶液呈吸收光的互補色光的顏色。第7頁/共61頁

例如,白光通過CuSO4溶液時,溶液顏色為藍色。第8頁/共61頁

吸收曲線:為了精確表明溶液對不同波長光的吸收情況,可將不同波長的單色光依次通過某一固定濃度的有色溶液,測量該溶液對各單色光的吸收程度,即吸光度,以波長為橫坐標,

吸光度為縱坐標作圖所得曲線,即為吸收曲線,或稱吸收光譜。第9頁/共61頁第10頁/共61頁二、朗伯-比爾定律

(1)朗伯-比爾定律透光度(透光率T):吸光度(A):朗伯-比爾定律:第11頁/共61頁

此式表明:當一束平行的單色光通過吸光物質的均勻溶液時,溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。

K:比例常數,與入射光波長,溶液中吸光物質的本性及溶液的溫度有關。第12頁/共61頁(2)吸光系數當b以cm,c以g/L為單位,K為吸光系數,用符號a表示,單位為L/g·cm

A=abc

當b以cm,c以mol/L為單位時,K為摩爾吸光系數,用符號ε表示,單位為L/mol·cm

A=εbc

a與ε的關系:第13頁/共61頁

比吸光系數():指質量濃度為1%(g/mL),b為1cm時的吸光度值,單位為mL/g·cm

同一物質的ε與之間的關系:第14頁/共61頁

例1一含Fe2+濃度為0.5mg/L的溶液,用鄰二氮菲顯色測定,吸收池厚度為2cm,在508nm處測得吸光度為

0.19,求其摩爾吸光系數和比吸光系數。第15頁/共61頁第16頁/共61頁(3)偏離朗伯-比爾定律的原因標準曲線:根據朗伯-比爾定律,當吸收池厚度不變,以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標作圖時,應得到一條通過原點的直線,稱為校正曲線或標準曲線。第17頁/共61頁偏離朗伯-比爾定律的主要原因:①定律僅適用于稀溶液②化學變化引起的偏離(正偏離)③非單色入射光引起的偏離(負偏離)第18頁/共61頁第19頁/共61頁三.方法和儀器

(1)目視比色法目視比色法:

用眼睛觀察比較溶液顏色深度以測量物質含量的分析方法稱為目視比色法。第20頁/共61頁標準系列法的原理:

朗伯-比爾定律對標準系列法原理的解釋:

A=εsbscs=εxbxcx第21頁/共61頁標準系列法的優點:①儀器簡單,操作簡便,適宜于大批試樣分析②適宜于稀溶液中微量組分的測定③某些不完全符合朗伯-比爾定律的顯色反應,仍可用此法進行測定。標準系列法的缺點:準確度較差。第22頁/共61頁(2)光電比色法和可見分光光度法①光電比色法的原理:所用儀器為光電比色計。光源→濾光片→一定波長范圍的近似單色光→有色溶液→透過光→光電池→檢流計的標盤第23頁/共61頁

可見分光光度法所用的儀器稱為分光光度計,它是利用分光能力很強的棱鏡或光柵的原理,作為單色器,可連續獲得不同波長的單色光,其波長范圍比用濾光片獲得的更窄。因此用分光光度計可連續測量某一定濃度有色溶液在不同波長下的吸光度,從而可得其吸收光譜,通過吸收光譜可選擇最適宜的測定波長。第24頁/共61頁

所以分光光度計采用適當的光源和檢測器,使測量的范圍不只局限于可見光區。如用紅外光作為光源成為紅外分光光度法;用紫外線作為光源稱為紫外分光光度法。第25頁/共61頁②光電比色計和可見分光光度計的基本部件光源單色器吸收池檢測器指示器第26頁/共61頁a.光源要求:光源須具有足夠的輻射強度,

且穩定性好。鎢燈是可見分光光度計常用的光源。第27頁/共61頁b.單色器光電比色計:用濾光片獲得單色光。選擇濾光片的原則是:濾光片最易透過的光應是有色物質最易吸收的光,即濾光片的顏色與溶液的顏色應為互補色;也可以使用不同的濾光片測量同一有色溶液的吸光度,測得吸光度最大時所用的濾光片就是最適宜的濾光片。第28頁/共61頁

分光光度計:單色器由棱鏡或光柵、狹縫和準直鏡等部分組成。

棱鏡:色散元件,有石英或玻璃兩種,它們對不同波長光具有不同的折射率。石英棱鏡對紫外光分光效果好,玻璃棱鏡對可見光分光效果好,因為玻璃對紫外光有吸收,故不能用于紫外光區。第29頁/共61頁第30頁/共61頁

光柵:色散元件,利用光的衍射和干涉原理制成。當白光通過密刻平行條痕的光柵后,將不同波長的光色散成連續光譜。具有波長范圍寬、色散均勻、分辨本領高等優點。第31頁/共61頁c.吸收池(比色皿)

用于盛裝被測試液和參比溶液。按制作材料不同分為石英吸收池和玻璃吸收池。第32頁/共61頁d.檢測器作用:是將光強度信號轉換為可測電信號,常見檢測器有光電池和光電管。光電池:國產581-G型光電比色計及72型分光光度計。第33頁/共61頁第34頁/共61頁優點:光電池靈敏度較高,產生的光電池不需要經過放大便可直接用靈敏檢流計測量。缺點:光電池經強光照射或連續使用時間過長,易產生“疲勞現象”,導致靈敏度降低,遇此情況,應暫停使用并避光放置,待其復原后再用。第35頁/共61頁光電管:國產721型分光光度計第36頁/共61頁e.指示器第37頁/共61頁(3)常用光電比色計和分光光度計光電比色計:國產581-G型,儀器通常配有紅色、綠色、藍色三塊濾光片,其透過光的最大波長分別在650、

530和440mm左右。第38頁/共61頁可見光光度計:國產721型分光光度計第39頁/共61頁四、顯色反應及其影響因素顯色反應:將被測組分轉變為有色化合物的反應稱為顯色反應。顯色劑:使被測組分顯色的試劑稱為顯色劑。第40頁/共61頁(1)對顯色反應的要求①選擇性好②靈敏度高③有色化合物組成恒定④有色化合物的化學性質穩定⑤顯色劑在測定波長處無明顯吸收第41頁/共61頁(2)顯色劑顯色劑可分為無機顯色劑和有機顯色劑兩大類。由于大多數有機顯色劑能與金屬離子形成穩定的有特征顏色的螯合物,靈敏度較高,選擇性也較好。因此,在比色分析和光度分析中主要選用有機顯色劑。第42頁/共61頁兩種常用的有機顯色劑：①鄰二氮菲其結構式為這是目前廣泛用于測定Fe2+的較好的顯色劑。先用鹽酸羥胺把待測試液中的Fe3+還原為Fe2+,然后在pH5~6的條件下,與鄰二氮菲反應,生成穩定的橙紅色配合物，配合物的λmax為508nm.反應是特效的,靈敏度也較高，摩爾吸光系數ε為1.1×104L/mol.cm。第43頁/共61頁②.雙硫腙其結構式為第44頁/共61頁(3)影響顯色反應的因素：①顯色劑的用量：顯色反應表示式:M+RMR(被測組分)(顯色劑)(有色配合物)

顯色劑的用量應當適宜,其用量是通過實驗確定。第45頁/共61頁第46頁/共61頁實驗方法為：固定被測組分的濃度和其它條件,改變顯色劑在溶液中的濃度cR,分別測量吸光度(A),繪制A-cR曲線。第47頁/共61頁第48頁/共61頁②溶液的酸度適宜酸度范圍確定方法：固定顯色劑和被測組分的濃度,

改變溶液的pH值,分別測量吸光度,

繪制A-pH曲線。曲線平坦部分所對應的pH值即為適宜的酸度范圍。第49頁/共61頁③顯色時間作吸光度-時間曲線,確定適宜的顯色時間。④顯色溫度⑤溶劑的性質⑥共存離子的干擾及其消除第50頁/共61頁

消除共存離子干擾的方法：

a.控制溶液的酸度

b.加入掩蔽劑

c.分離干擾離子第51頁/共61頁五、光度測量條件的選擇

(1)選擇合適波長的入射光①選被測有色物質的λmax為入射光②如在λmax處顯色劑或干擾組分有明顯的吸收,則應選靈敏度較低但能避免干擾的適宜波長的光作為入射光。第52頁/共61頁(2)選擇適宜的參比溶液①.當被測溶液、顯色劑及所用其他試劑均無色,可用純溶劑作為參比溶液,稱為溶劑空白。②.當顯色劑無色而被測試液中存在其他有色離子時,可用不加顯色劑的被測試液作為參比溶液,稱為試樣空白。③.當顯色劑或其他試劑有色,可用顯色劑或其他試劑作為參比溶液,稱為試劑空白。第53頁/共61頁④.用不含被測組分的試樣,在相同條件下與被測試樣同時進行處理,測吸光度時以前者所得溶液為參比溶液,稱為平行操作空白。如臨床上進行某種藥物濃度的監測,取正常人血樣和待測血藥濃度的血樣在相同條件下處理,用前者得到的溶液作為參比溶液。第54頁/共61頁(3)控制適當的吸光度讀數范圍適宜讀數范圍:吸光度A在0.15~1.0內，或透光度T值在0.10~0.70內。六.比色法和可見分光光度法的定量方法

(1)校正曲線法(適用于經常性的批量分析）

(2)標準對比法（標準品對照法）此法適宜于非經常性