植物細胞組織第1頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

第一節植物細胞（組織）培養反應器第2頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五植物細胞（組織）培養反應器通常廣義的植物細胞培養技術包括植物器官、組織、細胞以及原生質體培養，并以此發展起來的各種植物細胞培養技術。植物細胞（組織）培養反應器的研制是植物細胞培養技術向工業化規模發展的關鍵。第3頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五一、植物細胞培養過程的特點1．細胞培養液的性質植物細胞要比微生物大得多。在細胞培養過程中，其細胞形態有明顯的變化。植物細胞培養液的粘度和微生物發酵液表現出明顯不同，它隨細胞濃度的增加而顯著上升。培養液為非牛頓型流體，屬擬塑性流體。

第4頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2．植物細胞培養中的傳遞狀態氧傳遞的研究對于產物的有效生產和較好的經濟效益是息息相關的。植物培養細胞的需氧量要比微生物深層培養低得多。第5頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五起始kLα和最終細胞濃度的關系（培養144h）

第6頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五二、植物細胞培養反應器

植物細胞培養主要采用懸浮培養和固定化細胞培養系統。懸浮培養所用生物反應器主要有機械攪拌反應器和非機械攪拌反應器。固定化細胞培養反應器有填充床反應器、流化床反應器和膜反應器等類型。第7頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五1．懸浮培養生物反應器（l）機械攪拌式反應器機械攪拌式反應器能獲得較高的kLα值（＞100h－1），而植物細胞培養所需的kLα值一般為5～20h－1

。一般認為機械攪拌式反應器應用于植物細胞培養存在的主要問題是植物細胞的細胞壁對剪切的耐受力差。從以往的研究來看，對攪拌器加以改進，可以減小攪拌過程中的剪切力，從而使攪拌式反應器能更廣泛地應用于植物細胞培養上。第8頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五20m3植物細胞培養裝置流程圖

第9頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五（2）非機械攪拌式反應器

通常為氣體攪拌式反應器，是一種利用通入的空氣作通氣和攪拌的生物反應器，主要有鼓泡式反應器和氣升式反應器，而氣升式反應器又可分為外循環和內循環兩種形式。第10頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五氣體攪拌式反應器

（a）鼓泡式反應器（b）內循環氣升式反應器（c）外循環氣升式反應器第11頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

氣體攪拌式反應器（尤其是氣升式反應器）十分適于植物細胞生長與次級代謝產物的生成。氣體攪拌式反應器必須依靠大量通氣輸入動量和能量，以保證反應器內培養液的良好傳質、傳熱，并保證不出現死角。但過量的通氣同時也易于驅除培養液中的二氧化碳和乙烯，對細胞生長反而有阻礙作用，因而有時也需要降低氣體成分的傳質系數。同時由于植物細胞的攝氧速率較低，過高的溶氧對植物細胞合成次級代謝產物不利。氣體攪拌式反應器第12頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

新疆紫草細胞培養流程（ALCROF反應器）

第13頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2．固定化細胞生物反應器

植物細胞培養的最大問題是培養中的細胞遺傳和生理的高度不穩定性。固定化細胞培養可以在一定程度上克服這種傾向。固定化細胞系統也比懸浮培養更適合于植物細胞的培養。固定化細胞包埋于支持物內，可以消除或極大地減弱流質流動引起的切變力。便于連續操作。第14頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五固定化細胞培養反應器的類型（1）填充床反應器（2）流化床反應器（3）膜反應器第15頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

填充床反應器示意圖

流化床反應器示意圖

第16頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五幾種流化床反應器流程

用藻酸纖維固定化植物細胞的循環流化床反應器

第17頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

實驗用流化床生化反應器

第18頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

錐形流化床反應器

第19頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五磁場流化床生化反應器

第20頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五固定化細胞膜反應器示意圖

第21頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

（a）中空纖維

(b)螺旋卷繞反應器第22頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五三、植物組織培養及反應器利用高度分化的植物器官、組織培養以提高目的產物含量的研究也日益引起人們的重視。在組織培養研究當中，大規模培養系統發展較為迅速的領域主要有以下幾種。

1．發狀根大規模培養

2.小植物的大規模快速繁殖第23頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

流化床反應器培養黃花蒿發狀根的流程示意圖1.反應器2.空氣出口3.空氣入口4.空氣過濾器5.流量計6.空氣貯罐7.蠕動泵8.無菌水入口9.無菌水貯槽10.熒光燈第24頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

淺層循環式植株快速繁殖器l.溫度傳感器2.出口管3.反應器體4.托板5.進口管6.排氣口7.空氣分布管8.溫度調節器

9.轉換器

第25頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五唐菖蒲原球莖培養流程圖

l.反應器2.蠕動泵3.培養液貯罐4.通氣口5.培養板

6.支架7.加液口8.出波口9.加液、取液口

第26頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

培養馬鈴薯無菌芽的內環噴霧生物反應器A.培養容器B.內管C.轉能器D.超聲波發生器E.計時器F.液體培養基G.熒光燈H.支架I.不銹鋼網J.植物材料K.空氣出口L.空氣過濾器

第27頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五第二節動物細胞培養反應器應用細胞工程技術，建立大規模動物細胞培養系統生產各種生物活性物質，是一種比較經濟可靠的技術。具有代表性的有氣升式深層培養系統、微載體培養系統、微囊培養系統、大載體培養系統以及中空纖維培養系統。第28頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五一、動物細胞培養方法體外培養的動物細胞有兩種類型。一種是非貼壁依賴性細胞，可采用類似微生物培養的方法進行懸浮培養。另一種是貼壁依賴性細胞，它們需要附著于帶適量正電荷的固體或半固體表面上生長。第29頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五l.貼壁培養培養貼壁依賴性細胞，最初采用滾瓶系統VanWezel在1967年開發了微載體系統培養貼壁依賴性細胞。第30頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體系統培養動物細胞的優點①表面積／體積比大。②微載體懸浮于培養基中，細胞生長環境均一，簡化了這些環境因素的監測和控制。③培養基利用率高。④采樣重演性好。⑤收獲過程不復雜。⑥放大較容易。⑦勞動強度小，占用空間小。影響微載體培養的特殊因素有微載體濃度、接種濃度和攪拌轉速等。第31頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2.懸浮培養所謂懸浮培養，是指細胞在培養器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴性細胞培養。動物細胞的懸浮培養是在微生物發酵的基礎上發展起來的。由于動物細胞的特點，在許多方面又與經典的發酵不同。懸浮培養的細胞密度較低，轉化細胞懸浮培養有潛在致癌危險，培養病毒易失去病毒標記而降低免疫能力。第32頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五3.固定化培養懸浮培養適用于非貼壁依賴性細胞，貼壁培養適用于貼壁依賴性細胞。包埋培養，對兩類細胞都適用，細胞生長的密度高，抗剪切力和抗污染能力強。對非貼壁依賴性細胞常用海藻酸鈣包埋，對貼壁依賴性細胞常用膠原包埋。第33頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五二、細胞培養的操作方式1.分批式操作2.流加式操作3.半連續式操作4.連續操作5.灌注培養第34頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五三、動物細胞大規模培養反應器1．通氣攪拌式細胞培養反應器根據動物細胞培養的特點，要求攪拌器轉動時產生的剪切力小，混合性能好。在已開發的各種形式攪拌器中，籠式通氣攪拌器基本上能符合上述要求。該裝置的主要特點是可以避免在向培養基中通氣時氣泡直接損傷細胞。同時在采用微載體系統培養時，微載體不會被由于通氣所產生的泡沫滯留在氣液界面中。第35頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

Spier設計的籠式通氣攪拌器

第36頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

CelliGen籠式通氣攪拌器

第37頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五Celligen細胞培養反應器

第38頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五2．氣升式動物細胞培養反應器和攪拌式生物反應器相比，氣升式反應器中產生的湍動溫和而均勻，剪切力相當小；反應器內無機械運動部件，因而細胞損傷率比較低；反應器通過直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；反應器內液體循環量大，細胞和營養成分能均勻分布于培養基中。第39頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五1000L動物細胞培養流程圖

第40頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五3．中空纖維細胞培養反應器

中空纖維細胞培養反應器在動物細胞培養方面用途較廣，既可培養懸浮生長的細胞，又可培養貼壁依賴性細胞。一般來說，中空纖維是用聚礬或丙烯的聚合物制成。管壁的厚度約50～75μm，直徑為200μm。管壁是半透膜。第41頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五中空纖維細胞培養反應器美國Endotronic公司生產的Acusyst－JtTM中空纖維培養系統①培養器體積小，細胞高密度生長；②濃縮產品；③產物純度高；④自動化程度高，細胞生長周期長。其缺點是由于中空纖維每次生產的消耗品價格尚貴，如果使用不當會增加生產成本。第42頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五中空纖維培養系統（Acysyst－JrTM）循環簡圖

第43頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五4．微囊培養系統微囊培養系統具有幾個特點：①細胞密度大；②產物單位體積濃度高；③分離純化操作經濟簡便；④抗體活性、純度好。但微囊技術成功率一般只有50％左右，培養液用量大。囊內部分死亡細胞對產物的污染。第44頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

微囊技術操作過程圖解1.懸浮細胞膠狀液2.成滴器3.膠化小珠4.包被溶液5.顯微鏡下膠囊6.多孔微囊膜7.完成操作后的微囊第45頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五5．大載體系統大載體培養系統是一種新型的大規模培養細胞裝置，配有先進的主要部件，如溶解氧、pH測定以及培養液輸入和產物的收獲均由微機程控調節。該培養系統能連續生產3個月以上，已用于培養10多種有經濟價值的細胞株，生產單克隆抗體和干擾素產品。我國于1987年引進上述大載體培養系統。第46頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五大載體系統的優點①操作控制方便，可隨機取樣檢測；②附著細胞密度高；③消耗用品價格低廉，產物收獲量大，有明顯經濟效益。但該系統不具有細胞分泌產物的濃縮裝置。第47頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五

Be11co大載體培養系統組裝簡圖

第48頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五6．微載體培養系統基本原理是利用固體小顆粒作為載體，細胞在載體的表面附著，通過連續攪拌懸浮于培養液中，并形成單層生長、繁殖。由于擴大了細胞的附著面，能充分利用生長空間和營養液，因此大大提高了細胞的生長效率和產量。第49頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體培養系統的優點①具有較高的表面積體積比；②生長環境均一，條件易于控制，放大容易；③兼具貼壁培養和懸浮培養的優勢，而且是均相培養；④取樣和計數簡單；⑤細胞和培養液易分離；⑥大規模培養只需對微生物攪拌式或氣升式培養系統稍加改進即可；⑦適合于培養原代細胞、二倍體細胞株，它對生產重組產品來說是必不可少的有效方法。第50頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體培養系統微載體是由天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）或者各種合成的聚合物組成的。其直徑由50μm到數百μm不等。近年來國外開發的微載體主要有液體為載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、甲殼質微載體、聚酰胺泡沫為載體、藻酸鹽凝膠微載體、新型的外被膠原的聚尿烷泡沫載體、磁性微載體。第51頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體培養系統

國際上微載體系統的研究開發，大體上沿著2個方向進行：①研究開發培養和收獲細胞的新工藝、新設備包括自控和監測系統；②研制開發新型微載體。第52頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微載體培養系統

第53頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五第三節微藻培養反應器一、微藻生物技術的優越性（1）光能利用率高。（2）微藻無復雜的生殖器官，整個生物量易于收獲、加工和利用。（3）許多微藻經誘導后可以產生特別高濃度的、有商品化生產價值的化合物。（4）微藻通常沒有有性階段，只有簡單的細胞分裂周期，能在數小時內完成細胞循環。第54頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五二、微藻大規模培養的特點（1）微藻培養過程要有足夠的光照。（2）氣液傳遞：強化氧解析過程。（3）混合：在藻類培養過程中的混合除了具有促進氣液傳遞、液固傳遞，防止細胞沉降作用外，還必須使細胞在與反應器的表面垂直的方向上能充分混合，否則培養液中的細胞受光不均勻。（4）培養液性質：培養基多采用海水配制第55頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五三、微藻大規模培養反應器微藻培養用反應器要能提供以下條件：①足夠的光照。②合適的溫度。③合適的無機碳源（及其他無機營養物質）。④合適的PH。⑤充分混合。⑥避免污染。⑦氧的析出或供給。第56頁，共61頁，2023年，2月20日，星期五微藻大規模培養反應器敞開式培養反應器封閉式光生物反應器第57頁，共61頁，