第十章植物原生質體培養和細胞融合

10.2原生質體融合10.1植物原生質體培養主要內容原生質體（protoplast）：是去除細胞壁的裸露植物細胞。

原生質體培養再生植株技術是細胞融合（cellfusion）和體細胞雜交（somaticcellhybridization）基礎。2、細菌過濾器0.45m的濾膜可以濾去細菌和病毒（1）

可用抽濾瓶接真空泵抽濾滅菌（2）

可用注射器推壓過濾滅菌3、離心機

提純原生質體500r/min離心3-5min制備酶液用2500r/min離心10min二、化學試劑

1、無機化學試劑：分析純

2、有機化學試劑：

●維生素：組織培養常用的維生素以外還需泛酸鈣，葉酸，VA，VC，VD，生物素，氯化膽堿，對甲基苯甲酸

●激素：生長素和細胞分裂素的適當搭配

●滲透壓穩定劑：糖醇系統（甘露醇，山梨醇，葡萄糖，蔗糖）

●碳源和氮源：C源：葡萄糖和蔗糖；N源：水解酪蛋白，谷氨酰胺，甘氨酸，Arg，Asp

3、凝膠劑：瓊脂粉、瓊脂糖、日本的GelloanGum

三、酶類

纖維素酶：日本的CellulaseonzukaR–10

CellulaseonzukaRs

美國

Cellulysin

果膠酶：日本的PectolyaseY23

Macerozyme

美國Pectinase

2、外植體滅菌：跟組培一樣

3、酶處理

靜置在黑暗中進行

時間：幾小時到十幾小時

溫度：25-27℃

4、原生質體的收集和純化

收集：用40-100m的濾網過濾混合液，將濾液以臺式離心機75-100g離心3-5min。純化：

●沉淀物重新懸浮于清洗培養基中，在50g離心3-5min后再懸浮，如此反復洗滌2-3次。

●為了純化出有活力的原生質體，將沉淀懸浮于少量清洗培養基，置于含有蔗糖溶液（21%）的上部，在100g下離心5-10min后，在蔗糖溶液和原生質體懸浮培養基的界面上會出現一個純凈的原生質體帶，將此帶吸收后，再反復洗滌2次，最后用原生質體培養基洗一次。2、培養方法（1）液體培養

§微滴培養：將懸浮的密度為10000~100000個/ml原生質體的培養液用滴管以0.1ml左右的小滴一滴一滴地接種到培養皿上，如果將培養皿翻轉過來，則成為懸滴培養。

§淺層培養：將含有原生質體的培養液在培養皿底部鋪一薄層。（2）固體培養：原生質體懸液體+熱融的含瓊脂的培養基在45℃下等量混合。（3）固液體混合培養：在培養皿底部先鋪上一層瓊脂培養基，待固化后，在固體培養基表面再作淺層液體培養。

4、原生質體的發育原生質體在適合的條件下，首先形成新的細胞壁，繼而進行分裂，形成愈傷組織。

5、原生質體植株再生

途徑：（1）將原生質體再生的愈傷組織直接轉移到分化培養基上，一步成苗。（2）先將愈傷組織培養在含細胞分裂素和低濃度2.4-D的分化培養基上，形成質地較硬的胚性愈傷組織或胚狀體，再將其轉到含細胞分裂素的分化培養基上再生植株。第二節

原生質體融合（體細胞雜交）一、細胞融合的方法?自發融合（SpontaneousFusion）：在溶解細胞壁過程中，有些原生質體能彼此融合形成同核體。?誘導融合（inducedfusion）：用物理或化學的方法來誘導原生質體的融合。步驟：兩個或多個原生質體的質膜彼此靠近，局部區域質膜緊密粘連，彼此融合，融合完成，形成球形的異核體或同核體。二、細胞融合的程序●兩種親本的原生質體分離：由雙子葉植物中分離出的原生質體是良好的材料?！裨|體融合1）非對稱雜交：一方親本的細胞核和細胞質分另一方親本的少量核物質和全部細胞質融合2）細胞質雜交：一方親本的細胞核和細胞質及另一方的親本的全部細胞質融合。方法：$一個正常的原生質體+一個去核的原生質體

$一個正常的原生質體+一個核失活原生質體融合$異核體形成之后2個核中有一個消失$在較晚的時期chr選擇型地消除三、異核體或雜種細胞的選擇方法：●互補選擇法：融合后的細胞要進行兩次不同的培養條件的培養。適用于缺失體、某些營養缺陷型、抗某些因子的親本?！駲C械分離法：不常用

取盛開的大花萱草作為實驗材料。我們可以看到在每一個花瓣上都具有紅、黃、白三種顏色?；ò瓯砥榕帕芯o密的表皮組織，不易酶解，用尖頭鑷子撕去表皮?！駥⒈┞兜幕ㄈ饨M織浸泡在酶液里●排列相對疏松的花肉細胞很容易被酶液消化。

在酶液消化過程中，由于實驗材料的個體差異，酶解時間不固定。因此要用顯微鏡隨時檢查酶解情況顯微鏡檢查清洗后的原生質體，如碎片過多，則用蔗糖漂浮法去除碎片。蔗糖漂浮方法：細口吸管吸20%蔗糖溶液，小心插入盛有原生質體懸液的離心管底部，緩緩將蔗糖溶液擠出。由于比重不同，蔗糖溶液與原生質體懸液中間有一明顯界面。離心5分鐘（500轉/分），此時死細胞及碎片降至蔗糖溶液內，聚集在離心管底部，而活細胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面處。用細管輕輕插入底部將沉將在離心管底部的碎片小心吹打，混勻在蔗糖溶液中，連同蔗糖溶液一起小心吸出，再吸去上清液即得到健康的原生質體。

例如:甘蘭與大白菜原生質體的電融合1)由甘蘭葉片得到的原生質體帶葉綠體顆粒，呈深綠色。由白菜下胚軸得到的原生質體胞質較濃，呈淡綠色。

(2)將二種原生質體懸液混合后置接通電源的電極小室內，加/MHZ、150VPP/cm正弦交變電場后，原生質體排列成串。(3)加50us，0.5-2.0kv/cm高壓脈沖三次后，開始融合，于10分鐘后完成圓化過程。

(4)異核體培養24小時后發生第一次細胞分裂，培養48小時后發生第二、三次細胞分裂。(5)異核體培養4天后長成小細胞團。移至培養基（MS+KT3mg/L，2.4-D0.2mg/L）上培養。一周后移至分化培養基（MS+6-BA3mg/L+NAA0.1mg/L）上培養，誘導出胚狀芽尖。