分子遺傳學

MolecularGenetics

教學目的：學習分子遺傳學的基本理論，重點是遺傳物質在分子水平上的遺傳信息流向和基因表達調控。利用分子遺傳學的基本理論指導相關科研工作。教學組織：教師講述和學生自學結合。成績評價：課程論文（50%）；按指定題目在規定時間內完成。閉卷考試（50%）。參考書籍：分子遺傳學。南京大學分子遺傳學，張玉靜95年以后出版的分子生物學教材或專著第一章

遺傳的物質基礎――DNA

DNAisthegeneticmaterial一、DNA所帶的遺傳信息作為遺傳物質所應具備的條件多樣性貯存并表達多種遺傳信息連續性準確傳遞后代穩定性物理、化學性質穩定多變性有遺傳變化的能力DNA是遺傳物質的證明1928年Griffith的肺炎球菌對小鼠的轉化1944年Avery對肺炎球菌的轉化1952年病毒重組真核細胞的基因轉化1953年Watson和Crick，DNA雙螺旋模型

核酸之外的遺傳物質克雅氏病－－1913庫魯病（kuru）－－1950羊搔癢病（scrapie）－－1959瘋牛病－－1985共同特征：退行性神經疾病，影響大腦功能，大腦細胞死亡。過濾性因子，可感染，能被蛋白質酶滅活，但不能被核酸酶或UV滅活，朊病毒（prion），即蛋白質樣的感染粒子遺傳信息負責蛋白質氨基酸組成的信息――結構基因基因選擇性表達的信息――調控基因高等生物的結構基因占基因組的10-15%，占基因組80%以上的DNA有什么作用？無準確的回答。與基因表達的調控有關。AGTC3-5磷酸二脂鍵三、DNA的二級結構Watson-Crick的DNA雙螺旋的特征主鏈右手雙螺旋，脫氧核糖和P為骨架，位于外側，反向平行螺旋,直徑￠2nm堿基配對位于內側，嘌呤和嘧啶（A-T,G-C）螺旋參數任一條鏈繞軸一周的升降的距離。3.4nm，10對核苷酸，相鄰堿基0.34nm。大溝和小溝骨架雙鏈在螺旋軸上的間距不等，在DNA表面形成寬窄不等的大小溝。大溝寬2.2nm，是蛋白質識別DNA雙螺旋結構上的特定信息位點。小溝寬1.2nm。決定雙螺旋穩定的因素1、氫鍵結構的穩定性與G+C的含量成正比，G-C>A-T.2、堿基堆積力嘌呤和嘧啶具疏水性,產生疏水區而與介質分開,使堿基與水的接觸為最小。3、其他帶負電荷的磷酸基與介質中的陽離子形成離子鍵,可有效地屏蔽磷酸基間的靜電斥力。

四、DNA物理結構的不均一性富含A+T的序列AT含量在染色體的不同區域不同，螃蟹衛星DNA的AT含量高達97%。AT區域對復制和轉錄的起點很重要。嘌呤和嘧啶的排列順序堿基組成相同，但排列不同，雙螺旋的穩定性有差別5’GC>5’CG，和堿基堆積力有關，堿基堆聚力是嘌呤向嘧啶方向大于嘧啶向嘌呤方向。Tm值，DNA熔解溫度雙螺旋失去一半時的溫度，GC含量與Tm成正比。Tm值低的雙鏈容易解開，復制起點的核苷酸多為TA反向重復序列回文序列（palindrome）形成發夾結構，十字形結構，是限制酶的酶切位點。B－DNA天然狀態DNA，相對濕度92％。右手雙螺旋，每周螺旋10對堿基(10.4)，螺距3.4nm，堿基平面與螺旋軸垂直，大溝寬而深。Z－DNA左手雙螺旋，每圈螺旋12對堿基，螺距4.6nm，堿基平面與螺旋軸不垂直，無大溝，小溝深而窄

一條嘌呤和兩條嘧啶鏈構成，(YR*Y)CG*C，TA*T星號左邊的堿基正常配對，右邊的堿基異常配對或兩條嘌呤和一條嘧啶鏈構成(YR*R)CG*G，TA*A，CG*A。GGGACAATC六、DNA的變性和復性變性：熱，試劑，氫鍵、堿基堆積力破壞，DNA由雙鏈變成單鏈溫度：80～100℃變性劑：尿素，甲酰胺增色效應（hyperchromicity）正常雙鏈（50μg/ml）A260=1.00完全變性的單鏈DNAA260=1.37單核苷酸A260=1.60DNA雙螺旋結構失去一半時，A260=1.185Tm值的影響因素：DNA的均一性均一性高，Tm值的范圍小G-C含量G-C含量高，Tm值高經驗公式G-C%=(Tm-69.3)×2.44介質中的離子強度

低離子強度易熔解變性

DNA保存在高濃度緩沖液中防變性（TE）

復性單鏈重新締合為雙螺旋的過程，一般比Tm低20～25℃下進行復性過程：復性時溶液中單鏈DNA隨機碰撞。GC先配對形成短的雙鏈，然后配對區域延伸，象拉鏈一樣復性產生的不一定是原有的互補鏈，非原配影響DNA復性的因素：DNA復雜性簡單序列復性快DNA濃度高濃度復性快DNA片斷片斷小復性快，移動碰撞機會多溫度過低溫度減少互補鏈的碰撞機會鹽濃度過低鹽濃度使復性后的DNA又變性雜交：不同來源的單鏈核酸經堿基互補配對而形成的雙螺旋，DNA-DNA,DNA-RNADNA雜交可反映不同生物中DNA的共同序列和不同序列，研究生物的進化，

核酸雜交是現代分子生物學的基礎液相雜交濾膜雜交Cot曲線DNA復性時的單鏈消失的速度1C/Co=――――1+KCotC：單鏈DNA濃度，Co：DNA總濃度，t：時間秒，k：=二級反應常數復性的分數C/Co是起始濃度和經過時間的乘積（Cot）的函數。

Cot曲線定義C/Co=1/2時，Cot值定義為Cot1/2；即復性一半時DNA總濃度和時間乘積11/2=――――――1+Kcot1/21+KCot1/2=2Cot1/2=1/k不同DNA的Cot1/2值不同，總DNA濃度相同時，片斷越短，Cot1/2值越小，DNA復雜性越高，復性越慢，基因組大復性慢.DNA復雜性（X）：最長的沒有重復序列的DNA核苷酸對的數值：ATATAT---,X=2ATGC------,X=4

X=KCot1/2七、DNA超螺旋結構生物體中大多數DNA是以超螺旋的形成存在，而缺少超螺旋的DNA則為松弛型DNA原核生物DNA，共價封閉環，再經螺旋就成為超螺旋真核生物DNA為線性，DNA與蛋白質結合之間的DNA可形成一個小“環”，類似共價封閉環，從而螺旋成為超螺旋正超螺旋：和DNA內部雙螺旋纏繞方向相同的方向纏繞形成的超螺旋，結構更加緊密。DNA每圈初級螺旋的堿基對小于10.5，則為正超螺旋。

負超螺旋：DNA繞其軸與右手雙螺旋方向相反的方向纏繞所產生的超螺旋，結果減少每個堿基對的旋轉，每圈初級螺旋的堿基對大于10.5，則為負超螺旋。超螺旋是耗能過程，超螺旋的產生可能為能量的儲存形式拓撲異構酶Ⅰ催化DNA鏈斷裂和重新連接。每次只作用于一條單鏈，無需ATP，功能是松弛DNA，代表：

E.coli拓撲異構酶Ⅰ，對單鏈DNA的親和力比雙鏈高，能識別負超螺旋區，使負超螺旋擴大化而成松弛狀，該酶不能松弛正超螺旋真核生物拓撲異構酶Ⅰ可結合15-19核苷酸的雙鏈區域,其斷裂點在此區域中間.該酶傾向于結合超螺旋而不是結合松弛DNA區域,對正負超螺旋都有松弛功能.拓撲異構酶Ⅱ

大腸桿菌拓撲異構酶Ⅱ又稱DNA旋轉酶(DNAgyrase)，能催化斷裂和連接雙鏈DNA，需能量ATP參與，無堿基序列特異性，

DNA旋轉酶結合到雙鏈閉環分子中在ATP的作用下產生負超螺旋。無ATP時只能緩慢松弛負超螺旋而不能松弛正超螺旋。大腸桿菌拓撲異構酶Ⅱ主要功能是引入負超螺旋以抵消復制叉移動所產生的正超螺旋，還具有形成或拆開雙鏈DNA環連體的能力。該酶對DNA的結合順序是正超螺旋>松弛>負超螺旋拓撲異構酶的生物學功能

恢復細胞過程產生的DNA超螺旋，如復制叉前的正超螺旋、轉錄時聚合酶前產生的正超螺旋。防止細胞DNA過度超螺旋，維持超螺旋的穩定水平。生物體內5％負超螺旋，有利于基因的轉錄、基因組穩定、促進重組。去連環活性（大腸桿菌）、染色體凝縮（真核）、解開纏繞DNA雙螺旋

拓撲異構酶的催化反應本質是先切割DNA的磷酸二脂鍵，改變DNA鏈環數后再連接，兼具DNA內切酶和DNA連接酶的功能，但是它不能連接事先已經存在的斷裂DNA，是DNA復制、重組和轉錄中必需的酶

八、常見DNA分子形式及相互關系

沉降系數：Cscl密度梯度離心時的表示單位。Cscl本身有梯度，在離心時將不同分子大小的物質集中到它自身的不同梯度中。

在同一種密度梯度離心條件下，沉降系數大表示易沉淀，則具有較高的超螺旋。鑒定DNA超螺旋的手段。

Ⅰ型DNA具正、負超螺旋的雙鏈環狀DNAS＝1.41Ⅰ°型DNA無超螺旋的雙鏈環狀DNA，是松弛型S=1.14Ⅱ型DNA一條鏈或兩條鏈上有一個或幾個切口的雙鏈環狀DNAS=1.14Ⅲ型DNA線形雙鏈DNA