課題：微生物的培養與應用教學目標：（一）知識與技能了解有關培養基的基礎知識；掌握培養基的制備、高壓蒸汽滅菌和平板劃線法等基本操作技術（二）過程與方法分析實驗思路的確定和形成的原因，分析實驗流程，對比前面的實驗設計，歸納共性，分析差異，增加印象（三）情感、態度與價值觀形成勇于實踐、嚴謹求實的科學態度和科學精神教學重點：無菌技術的操作教學難點：無菌技術的操作教學過程：（一）引入新課在傳統發酵技術的應用中，都利用了微生物的發酵作用，其中的微生物來自于制作過程中的自然感染。而在工業化生產中，為了提高發酵的質量，需要獲得優良菌種，并保持發酵菌種的純度。這就要涉及到微生物的培養、分離、鑒別等基本技術。現在我們開始學習微生物的培養和應用專題。（二）進行新課1．基礎知識1．1培養基的種類包括固體培養基和液體培養基等。〖思考1〗瓊脂是從紅藻中提取的多糖，在配制培養基中用作為凝固劑。【補充】培養基的類型及其應用：標準標準培養基類型配制特點主要應用物理性質固體培養基加入瓊脂較多菌種分離,鑒定,計數半固體培養基加入瓊脂較少菌種保存液體培養基不加入瓊脂工業生產，連續培養化學組成合成培養基由已知成分配制而成，培養基成分明確菌種分類、鑒定天然培養基由天然成分配制而成，培養基成分不明確工業生，產降低成本目的用途鑒別培養基添加某種指示劑或化學藥劑菌種的鑒別選擇培養基添加（或缺少）某種化學成分菌種的分離1．2培養基的化學成分包括水、無機鹽、碳源、氮源四類營養成分。〖思考2〗從細胞的化學元素組成來看，培養基中為什么都含有這些營養成分？C、H、O、N、P、S是構成細胞原生質的基本元素，約占原生質總量的97％以上。【補充】碳源：如CO2、糖類、脂肪酸等有機物，構成微生物的結構物質和分泌物，并提供能量。氮源：如N2、氨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨等，主要用來合成蛋白質、核酸及含氮代謝物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作為碳源，又可以作為氮源，如氨基酸等。1．3培養基除滿足微生物生長的pH、特殊營養物質和氧氣等要求。【補充】生長因子：某些微生物正常生長代謝過程中必須從培養基中吸收的微量有機小分子，如某些氨基酸、堿基、維生素等。〖思考3〗牛肉膏和蛋白胨主要為微生物提供糖、維生素和有機氮等營養物質。〖思考4〗培養乳酸桿菌時需要添加維生素，培養霉菌時需要將培養基pH調節為酸性，培養細菌時需要將pH調節為中性或微堿性。活動2：閱讀“無菌技術”，討論回答下列問題：1．4獲得純凈培養物的關鍵是防止外來雜菌的入侵。1．5無菌技術包括：（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；（2）將培養器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌；（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近旁進行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。1．6比較消毒和滅菌（填表）比較項比較項理化因素的作用強度消滅微生物的數量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀態的微生物不能滅菌強烈全部微生物能〖思考5〗無菌技術除了防止培養物被污染外，還具有的目的是防止感染實驗操作者。1．7消毒方法：（1）日常生活經常用到的是煮沸消毒法；（2）對一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法（作簡要介紹）；（3）對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強消毒效果，然后使用紫外線進行物理消毒。（4）實驗操作者的雙手使用酒精；（5）飲水水源用氯氣進行消毒。1．8滅菌方法：（1）接種環、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；（2）玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；（3）培養基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。〖思考6〗對接種環滅菌時要用酒精燈的充分燃燒層火焰灼燒可能伸入試管或培養皿的部位。〖思考7〗利用干熱滅菌箱對玻璃器皿滅菌時物品不能擺得太擠，目的是避免妨礙熱空氣流通。〖思考8〗物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內冷空氣，其目的是有利于鍋內溫度升高；隨后關閉排氣閥繼續加熱，氣壓升至100kPa，溫度為121℃，并維持15～30min；最后切斷熱源，使溫度自然降溫，氣壓務必降至零時打開鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸【補充】培養基的配制原則：①目的要明確：根據培養的微生物種類、培養的目的等確定培養基的類型和配制量。②營養要協調：培養基中各種營養物質的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比4∶1時，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產生谷氨酸少；碳氮比為3∶1時，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③pH要適宜：細菌培養基pH中性或偏堿性，霉菌培養基呈酸性。2．實驗操作2．1計算：根據配方比例，計算100mL培養基各成分用量。2．2稱量：準確稱取各成分。稱取牛肉膏和蛋白胨時動作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空氣中水分。2．3溶化：①加水加熱熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化鈉繼續加熱；③加入瓊脂；④用蒸餾水定容到100mL。整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。2．4調pH：用1mol/LNaOH溶液調節pH至偏堿性。2．5滅菌：將配制好的培養基轉移到錐形瓶中，加塞包扎后用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌；所用培養皿用報紙包扎后用干熱滅菌箱滅菌。2．6倒平板：待培養基冷卻至50℃其過程是：①在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰；③左手將培養皿打開一條縫隙，右手將培養基倒入培養皿，立刻蓋上皿蓋。④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。〖思考1〗錐形瓶的瓶口通過火焰的目的是消滅瓶口的雜菌，防止雜菌感染培養基。〖思考2〗倒平板的目的是防止培養基冷卻過程中形成的水滴落到培養基表面。〖思考3〗若皿蓋和皿底之間粘有培養基，則該平板能否培養微生物？為什么？不能。空氣中雜菌會在這些粘附培養基上繁殖，并污染皿內培養基。〖思考4〗配制斜面培養基中，試管要加塞棉塞的目的是保持通氣并防止雜菌感染。〖思考5〗試管培養基形成斜面的作用是增大接種面積。2．7接種2．7．1微生物接種的最常用方法是平板劃線法和稀釋涂布法，另外還有穿刺接種和斜面接種等。2．7．2平板劃線法：通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。其操作步驟是：①將接種環在酒精燈火焰上灼燒直至燒紅。②在酒精燈火焰旁冷卻接種環，并打開大腸桿菌的菌種試管的棉塞。③將菌種試管口通過火焰達到消滅試管口雜菌的目的。④將冷卻的接種環伸入到菌液中取出一環菌種。⑤將菌種試管口再次通過火焰后塞上棉塞。⑥將皿蓋打開一條縫隙，把接種環伸入平板內劃3～5條平行線，蓋上皿蓋，不要劃破培養基。⑦灼燒接種環，冷卻后從第一區劃線末端開始向第二區域內劃線。重復上述過程，完成三、四、五區域內劃線。注意不要將第五區的劃線與第一區劃線相連。⑧將平板倒置放在培養箱中培養。〖思考6〗取菌種前灼燒接種環的目的是消滅接種環上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環的目的是消滅接種環上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環的目的是防止細菌污染環境和操作者。〖思考7〗在第1次劃線后都從上次劃線末端開始的目的是獲得由單個細菌形成的標準菌落。2．7．3稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列梯度稀釋，并將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊脂固體培養基上進行培養。當稀釋倍數足夠高時，即可獲得單個細菌形成的標準菌落。2．7．4系列稀釋操作：①取盛有9mL水的無菌試管6支，編號101、102、103、104、105、106。②用灼燒冷卻的移液管吸取1mL菌液注入編號為101試管中，并吹打3次，使之混勻。③從101倍液中吸取1mL菌液注入到編號為102試管內吹打均勻，獲得102倍液。依此類推。〖思考8〗操作中試管口和移液管應在離火焰1～2cm處。整個操作過程中使用了1支移液管。3．結果分析與評價3．1培養未接種培養基的作用是對照，若有菌落形成，說明培養基滅菌不徹底。3．2在肉湯培養基上，大腸桿菌菌落呈白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊。3．3培養12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是時間越長，菌落中細菌繁殖越多，菌落體積越大；菌落的位置不動，但菌落數增多。〖思考9〗在某培養基上出現了3種特征不同的菌落，原因有培養基滅菌不徹底或雜菌感染等。〖思考10〗頻繁使用的菌種利用臨時保藏法保存，長期保存菌種的方法是甘油管藏法。前者利用固體斜面培養基培養后，保存在4℃冰箱中，每3～6個月轉種培養一次，缺點是保存時間較短，容易發生污染和變異；后者將菌種與無菌體積等量混合后保存在－20（三）課堂總結、點評微生物的實驗室培養微生物的實驗室培養培養基無菌技術純化大腸桿菌培養基的配制配制培養基的原則配制培養基的方法計算→稱量→溶化→調pH→分裝→加棉塞→滅菌→倒平板平板劃線法稀釋涂布法系列稀釋平板涂布（四）實例探究例1．關微生物營養物質的敘述中，正確的是A.是碳源的物質不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽D.無機氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營養物質有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于A、B選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養型微生物的碳源和無機鹽；而NaCl則只能提供無機鹽。對于D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面對發酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養基和發酵設備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前解析：滅菌是微生物發酵過程的一個重要環節。A說的是滅菌的目的，因為發酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因為與發酵有關的所有設備和物質都要滅菌；發酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。答案：B綜合應用例3．右表是某微生物培養基成分，請據此回答：編號成分含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml（1）右表培養基可培養的微生物類型是。（2）若不慎將過量NaCl加入培養基中。如不想浪費此培養基，可再加入，用于培養。（3）若除去成分②，加入（CH2O），該培養基可用于培養。（4）表中營養成分共有類。（5）不論何種培養基，在各種成分都溶化后分裝前，要進行的是。（6）右表中各成分重量確定的原則是。（7）若右表培養基用于菌種鑒定，應該增加的成分是。解析：對于一個培養基，它能培養何種微生物，要看它的化學成分。當然這只適用于合成培養基，如果是一個天然培養基就不能從培養基的成分上區分它是培養何種微生物的。分析化學成分要從營養物質的類型出發。右表中的營養物質有水、無機鹽、氮源三類，缺乏碳源和特殊營養物質。對特殊營養物質，有的微生物是不需要的，但沒有微生物是不需要碳源的。該培養基中沒有碳源，說明培養的微生物是從空氣中獲得碳源的，即可培養的微生物就是自養型微生物了。該培養基中加入了過量食鹽，就可以成為金黃色葡萄球菌鑒別培養基，但金黃色葡萄球菌是異養型微生物，這個培養基就還需要加入有機碳源。該培養基若加入（CH2O），培養基中就有了碳源，但除去成分②，卻使培養基中沒有了氮源，這時就只能用于培養固氮微生物了。對于菌種鑒定，往往用的是固體培養基，而表中沒有凝固劑，需要加入常見的凝固劑——瓊脂。答案：⑴自養型微生物⑵含碳有機物金黃色葡萄球菌⑶固氮微生物⑷3⑸調整pH⑹依微生物的生長需要確定⑺瓊脂（或凝固劑）（五）鞏固練習1．不可能作為異養微生物碳源的是A．牛肉膏B．含碳有機物C．石油D．含碳無機物2．根瘤菌能利用的營養物質的組別是A．NH3，（CH2O），NaClB．N2，（CH2O），CaCl2C．銨鹽，CO2，NaClD．NO2，CO2，CaCl23．配制培養基的敘述中正確的是A．制作固體培養基必須加入瓊脂B．加入青霉素可得到放線菌C．培養自生固氮菌不需氮源D．發酵工程一般用半固體培養基4．自養型微生物與異養型微生物的培養基的主要差別是A．碳源B．氮源C．無機鹽D．特殊營養物質5．下表是有關4種生物的能源、碳源、氮源和代謝類型的概述。其中正確的是()生物硝化細菌根瘤菌酵母菌谷氨酸棒狀桿菌能源氧化NH3N2的固定分解糖類等有機物光能碳源C02糖類糖類糖類氮源NH3N2NH4+、NO3-尿素代謝類型自養需氧型異養需氧型異養兼性厭氧型自養需氧型A．根瘤菌、谷氨酸棒狀桿菌B．硝化細菌、酵母菌C．酵母菌、谷氨酸棒狀桿菌D．硝化細菌、根瘤菌6．甲、乙、丙是三種微生物，下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用來培養微生物的三種培養基。甲、乙、丙都能在Ⅲ種正常生長繁殖；甲能在Ⅰ中正常生長繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生長繁殖，甲、丙都不能。下列說法正確的是（）粉狀硫10gK2HPO44gFeSO40.5g蔗糖10g（NH4）2SO40.4gH2O100mlMgSO49.25gCaCl20.5gⅠ++++-+++Ⅱ+++-++++Ⅲ++++++++A、甲、乙、丙都是異養微生物B、甲、乙、丙都是自養微生物、丙是異養微生物C、甲是固氮微生物、乙是自養微生物、丙是異養微生物D、甲是異養微生物、乙是固氮微生物、丙是自養微生物7．微生物（除病毒外）需要從外界吸收營養物質并通過代謝來維持正常的生長和繁殖。下列有關微生物營養的說法正確的是A．乳酸菌與硝化細菌所利用的碳源物質是相同的B．微生物生長中不可缺少的一些微量的無機物稱為生長因子C．培養基中的營養物質濃度越高對微生物的增殖越有利D．生長因子一般是酶或核酸