一、實驗?zāi)康谋緦嶒炇侵参锷韺W(xué)課堂教學(xué)中的一個重要環(huán)節(jié)，不僅與課堂講授的基本理論、基礎(chǔ)知識相結(jié)合，而且要使學(xué)生學(xué)會植物生理學(xué)的基本實驗方法，并在科學(xué)態(tài)度、實驗技能技巧、獨立工作能力、理論聯(lián)系實際能力等方面獲得基本的訓(xùn)練。第一頁，共93頁。二、基本要求通過教學(xué)，要使學(xué)生學(xué)會植物生理學(xué)的基本實驗方法、技術(shù)和設(shè)計思路，掌握植物生理學(xué)基本原理的驗證方法和定量測定植物體內(nèi)發(fā)生的生理生化變化，并初步具有完成綜合性、設(shè)計性實驗的能力。每次實驗結(jié)束，學(xué)生均需寫出一份實驗報告。

第二頁，共93頁。實驗1植物組織滲透勢的測定第三頁，共93頁。Ⅰ質(zhì)壁分離法

【實驗原理】當(dāng)植物組織細(xì)胞內(nèi)的汁液與其周圍的某種溶液處于滲透平衡狀態(tài),細(xì)胞壓力勢為零時,細(xì)胞汁液的滲透勢就等于該溶液的滲透勢。該溶液的濃度稱為等滲濃度。設(shè)計并配制一系列具濃度梯度的蔗糖溶液，通過實驗找出使細(xì)胞發(fā)生初始質(zhì)壁分離的濃度，代入公式計算可得植物組織的滲透勢。【儀器與用品】洋蔥或紫鴨趾草；顯微鏡載玻片蓋玻片鑷子刀片蔗糖移液器第四頁，共93頁。【方法與步驟】配制各種濃度的蔗糖溶液→剝?nèi)⊙笫[鱗莖（或紫鴨趾草葉片）表皮→迅速投入各種濃度的蔗糖溶液中→低倍顯微鏡觀察并記錄質(zhì)壁分離的相對程度→確定使細(xì)胞發(fā)生初始質(zhì)壁分離的濃度→計算滲透勢【思考題】1.測定并計算不同植物組織的滲透勢。2.為什么選用有色素的洋蔥鱗莖外表皮實驗效果較好？

第五頁，共93頁。Ⅱ冰點下降法【實驗原理】根據(jù)物理化學(xué)溶液理論——拉烏爾冰點下降原理，溶液單位體積中所溶解的溶質(zhì)顆粒總數(shù)相同，則引起冰點下降的數(shù)值相同。利用冰點滲透壓計測定一定的冰點下降值對應(yīng)的滲透濃度單位ic，代入公式計算。【儀器與用品】新鮮植物材料；冰點滲透壓計、液氮罐、注射器、紗布、吸水紙、Eppendorf管第六頁，共93頁。【方法與步驟】取材1-2克新鮮植物材料洗凈包在錫箔紙中，放入液氮或低溫冰箱中將細(xì)胞殺死→取出剪碎放入注射器溶冰，用加壓法將胞液擠出，存于Eppendorf管待測→取20微升待測液于冰點滲透壓計的測定管測定→提出探頭，擦拭后可繼續(xù)下一個樣品的測定。【思考題】冰點下降法與質(zhì)壁分離法的原理有何不同？

第七頁，共93頁。實驗2植物組織水勢的測定（小液流法）第八頁，共93頁。

【實驗原理】

把等量的植物組織放入一系列具濃度梯度的蔗糖溶液中，利用小液流法尋找植物組織放入后濃度不變的蔗糖溶液，計算出此蔗糖溶液的滲透勢即等于所測植物的水勢。【儀器與用品】

菠菜試管毛細(xì)滴管移液器剪刀鑷子蔗糖甲烯藍(lán)第九頁，共93頁。【方法與步驟】

配制一系列蔗糖溶液→各放入等量植物組織→加入次甲基藍(lán)粉，染色→毛細(xì)管移取藍(lán)色小液滴，放入未染色同濃度的蔗糖溶液中→找出液滴不動的蔗糖溶液→計算蔗糖溶液的滲透勢＝所測植物組織的水勢。【思考題】用小液流法測定植物組織水勢與用質(zhì)壁分離法測定植物細(xì)胞滲透勢都是以外界溶液的濃度算出的溶質(zhì)勢為根據(jù)，它們之間的區(qū)別何在？第十頁，共93頁。實驗3印跡法測定氣孔開張度第十一頁，共93頁。【實驗原理】有些有機溶劑涂在葉片表面，失水很快形成一層薄膜，上面就印在葉片表面的保衛(wèi)細(xì)胞與氣孔的輪廓。在顯微鏡下可觀察到，結(jié)合顯微測微尺可測其開張度大小。【儀器與用品】植物葉片顯微鏡顯微測微尺載玻片蓋玻片牛皮膠(或火棉膠)第十二頁，共93頁。【方法與步驟】

配制牛皮膠溶液→在葉的下表皮涂膠→成膜后取一小片→鏡檢→測量【思考題】測量不同生境下、不同植物葉片的氣孔開張度，比較后說明原因。第十三頁，共93頁。實驗4植物灰分元素的定性鑒定和定量分析第十四頁，共93頁。【實驗原理】植物風(fēng)干樣品在高溫灼燒后，剩下灰分灰分元素發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)后顯現(xiàn)出顏色及結(jié)晶灰分元素在高溫下吸收特定光譜的能量發(fā)生能級的躍遷，可用原子吸收分光光度計定量測定第十五頁，共93頁。【儀器設(shè)備及試劑】植物樣品高溫電爐、顯微鏡、原子吸收分光光度計、坩堝等，10%硝酸、5%鹽酸、5%硫氰化鉀等（見實驗指導(dǎo)）各元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液第十六頁，共93頁。【實驗步驟】植物樣品5g放在坩堝（已稱重）中，在灰化爐中緩慢升溫至400度，灰化1小時，冷卻，稱重。取出一部分進(jìn)行灰分元素的定性分析。詳見實驗指導(dǎo)45頁另取一部分稱重，放于50ml燒杯中，10%硝酸5ml于電熱板上加熱熔解，定容于100ml容量瓶中。原子吸收分光光度計測定其Ca、K、Mg、Fe、Zn、Mo含量（同時要測定和元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線）觀察的現(xiàn)象描述及計算第十七頁，共93頁。【思考題】灰分元素在植物樣品中的含量是怎樣的？各灰分元素的化學(xué)反應(yīng)原理是什么？原子吸收分光光度計的工作原理以及他可以測定多種灰分元素的技術(shù)關(guān)鍵是什么？第十八頁，共93頁。實驗5植物的無土培養(yǎng)和缺素癥狀

第十九頁，共93頁。[實驗原理]水溶液培養(yǎng)缺乏某種元素會表現(xiàn)出特定的缺素癥狀

[儀器設(shè)備及試劑]離子交換器培養(yǎng)罐玻璃房漂浮盤、恒溫培養(yǎng)箱、光照培養(yǎng)箱、刻度移液管、通氣泵等第二十頁，共93頁。[實驗操作]水培液所需的化學(xué)試劑（化學(xué)純）培育玉米苗配制營養(yǎng)儲備液配制完全培養(yǎng)液和缺素培養(yǎng)液完全培養(yǎng)液及缺素培養(yǎng)液培養(yǎng)玉米苗觀察記載、根據(jù)實驗結(jié)果描述缺素時所表現(xiàn)的典型癥狀，并分析其原因。第二十一頁，共93頁。[思考題]植物營養(yǎng)必須的大量元素和微量元素有哪些植物的大量元素和微量元素缺乏時的表現(xiàn)癥狀有什么不同如何做好植物的缺素實驗第二十二頁，共93頁。實驗6葉綠體色素的提取、分離及理化性質(zhì)的鑒定第二十三頁，共93頁。

【實驗原理】

葉綠素是一種雙羧酸的酯，可與堿發(fā)生皂化作用，產(chǎn)生的鹽能溶于水，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。葉綠素與類胡蘿卜素都有光學(xué)活性，表現(xiàn)出一定的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計精確測定。葉綠素在光照下可產(chǎn)生暗紅色的熒光；葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，容易受強光的破壞，特別是葉綠素與蛋白質(zhì)分離后破壞更快；葉綠素中的鎂可被氫離子取代而生成褐色的去鎂葉綠素；加入銅鹽后，去鎂葉綠素則成為綠色的銅代葉綠素，后者很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故用此法制作綠色植物的浸制標(biāo)本。第二十四頁，共93頁。

【儀器與用品】

1.儀器大試管或展層缸，臺天平，研缽，量筒，燒杯，漏斗，軟木塞，濾紙，毛細(xì)滴管，剪刀，分液漏斗，移液管，分光計2.試劑丙酮，甲醇，醋酸銅，鹽酸，氫氧化鉀，石英砂，碳酸鈣，無水硫酸鈉，四氯化碳，乙醚3.材料新鮮植物葉片第二十五頁，共93頁。【方法與步驟】

一、葉綠體色素的提取與分離

1.色素的提取2.準(zhǔn)備紙條（2cm×20cm，將其一端剪去兩側(cè)，中間留一長約1.5cm,寬約0.5cm的窄條。）3.點樣（注意：一次點樣不要太多，風(fēng)干后多點幾次，展層效果會更好。）4.紙層析（結(jié)果：最上端橙黃色為胡蘿卜素，其次黃色為葉黃素，再下面藍(lán)綠色為葉綠素a，最后的黃綠色為葉綠素b。）第二十六頁，共93頁。二、葉綠體色素的理化性質(zhì)1.葉綠素的熒光現(xiàn)象2.光對葉綠素的破壞作用3.銅代反應(yīng)4.黃色素與綠色素的分離5.觀察色素溶液的吸收光譜第二十七頁，共93頁。【思考題】

1.提取葉綠素時為什么要加入少量碳酸鈣，加多了會出現(xiàn)什么問題？2.銅在葉綠素中取代鎂的作用，有何實用意義？第二十八頁，共93頁。

實驗7葉綠素a、b含量的測定

第二十九頁，共93頁。【實驗原理】葉綠素a的最大吸收峰在663nm，葉綠素b的最大吸收峰在645nm，吸收曲線彼此又有重疊。根據(jù)Lambert-Beer定律，如果混合液中的兩個組分，它們的光譜吸收峰雖然有明顯的差異，但吸收曲線彼此有些重疊，在這種情況下要分別測定兩個組分，可通過代數(shù)方法，計算一種組分由于另一種組分存在時對光密度的影響，最后分別得到兩種組分的含量。第三十頁，共93頁。根據(jù)Lambert-Beer定律，通過代數(shù)方法，換算后得公式：

Ca=12.7OD663-2.69OD645（1）Cb=22.9OD645-4.68OD663（2）CT=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645（3）（3）式中CT為總?cè)~綠素濃度，單位為mg/L。

利用上式,既可以計算出葉綠素a和葉綠素b及總?cè)~綠素的濃度（mg/L）。【方法與步驟】色素的提取→測定光密度→計算色素提取液中葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素a+葉綠素b的濃度→計算每克鮮重葉片中色素的含量

第三十一頁，共93頁。【儀器與用品】1.儀器高級分光光度計，臺天平，研缽，漏斗，剪刀，移液管2.試劑丙酮，碳酸鈣3.材料植物葉片【思考題】1.試比較陰生植物與陽生植物的葉綠素a與葉綠素b的比值有何不同？2.分光光度法和比色法有何不同？3.葉綠素a與葉綠素b在紅光區(qū)和藍(lán)光區(qū)都有最大吸收峰，能否用藍(lán)光區(qū)的最大吸收峰波長進(jìn)行葉綠素a與葉綠素b的定量分析，為什么？第三十二頁，共93頁。

實驗8植物呼吸強度的測定第三十三頁，共93頁。【實驗原理】利用Ba(OH)2溶液吸收呼吸釋入的二氧化碳,實驗結(jié)束后,用草酸滴定殘余的Ba(OH)2，從空白和樣品兩者消耗草酸溶液之差，即可計算出呼吸過程釋放的二氧化碳的量。【儀器與用品】廣口瓶溫度計酸式滴定管干燥管尼龍網(wǎng)制小籃Ba(OH)2麝香草酚酞5%乙醇草酸(重結(jié)晶)小麥種子第三十四頁，共93頁。【實驗步驟】安排實驗裝置→放入萌發(fā)種子（同時用煮死的種子作對照）于小籃內(nèi)→滴定→計算【思考題】比較不同類型種子的呼吸強度。

第三十五頁，共93頁。實驗9可溶性總糖類的測定第三十六頁，共93頁。實驗原理

本實驗采用葸酮比色法測定可溶性糖的含量。糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再與葸酮作用形成綠色絡(luò)合物，顏色的深淺與糖含量有關(guān)。在625nm波長下的OD值與糖含量成正比。由于葸酮試劑與糖反應(yīng)的呈色強度隨時間變化，故必須在反應(yīng)后立即在同一時間內(nèi)比色。該實驗方法簡便，但沒有專一性，絕大部分的碳水化合物都能與蒽酮試劑反應(yīng)，產(chǎn)生顏色。第三十七頁，共93頁。儀器與用品1、實驗儀器分光光度計，恒溫水浴，分析天平，烘箱，刻度試管，漏斗，活性炭，酒精（20%）2、實驗試劑酒精（20%），葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，葸酮試劑3、實驗材料各種植物葉片、種子、果實第三十八頁，共93頁。方法與步驟1、可溶性糖的提取干材料50mg→10ml刻度離心管（4ml80%

酒精）→水浴40min→離心→上清液+10mg活性炭→脫色（80℃）30min→定容至10ml→過濾→濾液2、顯色及比色濾液1ml+5ml葸酮→沸水浴10min→冷卻→OD

值（625nm）3、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線第三十九頁，共93頁。思考題1、應(yīng)用葸酮法測得的糖包括那些類型？2、你知道還有哪些方法可以測定糖類？第四十頁，共93頁。實驗10吲哚乙酸氧化酶活性的測定第四十一頁，共93頁。實驗原理

吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破壞失去活性。植物體內(nèi)吲哚乙酸氧化酶活力的大小，對調(diào)節(jié)體吲哚乙酸的水平，起著重要作用，而影響植物的生長。酶活力的大小可以其破壞吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法測定。第四十二頁，共93頁。儀器與用品1、實驗儀器72型分光光度計，離心機，恒溫水浴鍋，天平，研缽，試管，移液管，燒杯2、實驗試劑磷酸緩沖液，2，4-二氯酚，氯化錳，吲哚乙酸，吲哚乙酸試劑。3、實驗材料豆類種子第四十三頁，共93頁。方法與步驟1、豆類種子30℃溫箱萌發(fā)3-4天，選取生長一致的幼苗，留下胚軸作材料。2、20株胚軸稱重→加磷酸緩沖液5ml+石英砂→研磨→加提取液→離心20min

粗酶液。3、試管1+氯化錳+二氯酚+IAA+酶液+磷酸緩沖液

→30℃水浴30min

試管2+氯化錳+二氯酚+IAA+磷酸緩沖液第四十四頁，共93頁。4、反應(yīng)液2ml+4ml吲哚乙酸試劑→30℃暗處保溫30min→顯色5、將反應(yīng)液于530nm處測定光密度值6、根據(jù)讀數(shù)查出相應(yīng)的吲哚乙酸殘留量7、配制從0-35μg/ml的IAA濃度，分別測定OD

值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。8、計算酶活力

U=(C2－C1)×10/1/V’×V×t/60

簡化成：U=(C2－C1)×200第四十五頁，共93頁。思考題1、試比較幼苗的胚軸和胚根中吲哚乙酸氧化酶活性大小。2、試比較幼根的根尖和延伸區(qū)中吲哚乙酸氧化酶活性大小。第四十六頁，共93頁。實驗11植物組織中總氮、蛋白質(zhì)氮含量的測定（微量凱氏法）

第四十七頁，共93頁。【實驗原理】植物組織中的有機氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量無機氮化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。將植物材料與濃硫酸共熱，硫酸分解為二氧化硫、水和原子態(tài)氧，并將有機物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮轉(zhuǎn)變成氨，并進(jìn)一步生成硫酸銨。為了加速有機物質(zhì)的分解，在消化時通常加入多種催化劑，如硫酸銅、硫酸鉀和硒粉等。消化完成后，加入過量NaOH，將NH4+轉(zhuǎn)變成NH3，通過蒸餾把NH3導(dǎo)入過量的硼酸溶液中，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH3的摩爾數(shù)，通過計算，可得出含氮量。蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的含氮化合物，每種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量，（約在14％～18％，平均約含氮16％）所以，可用蛋白氮的量乘以6.25（100／16＝6.25），算出蛋白質(zhì)的含量。第四十八頁，共93頁。【材料、儀器設(shè)備及試劑】材料：各種干燥、過篩（60～80目）的植物樣品

儀器設(shè)備：1.消化管；2.微量凱氏定氮蒸餾裝置一套（圖17）；3.三角燒瓶；4.微量滴定管；5.量筒；6.容量瓶；7.燒杯；8.移液管等。

第四十九頁，共93頁。【實驗步驟】樣品提取分離：樣品的消化：蒸餾及滴定：結(jié)果計算：樣品中總氮量（％）＝0.010×(V3V0)×100×14/(W×1000×10)×100×氮的回收率

樣品中蛋白氮含量（％）＝0.0100×(V1－V2－V0)×100×14/(W×5×1000)×100×氮的回收率

回收率（％）＝0.0100×(V－V0)×14/(2.0×0.6×100)×100

第五十頁，共93頁。【思考題】植物的蛋白氮和非蛋白氮的分離原理是什么？系數(shù)6.25是如何得出的？開氏定氮器的原理是很么，如何操作？第五十一頁，共93頁。實驗12種子活力的快速測定第五十二頁，共93頁。Ⅰ氯化三苯基四氮唑法(TTC法)實驗原理

凡有生命活力的種子胚問呼吸作用過程中都有氧化還原反應(yīng)，而無生命活力的種胚則無此反應(yīng)。當(dāng)TTC滲入種胚的活細(xì)胞內(nèi)，并作為氫受體被脫氫輔酶上的氫還原時，便由無色TTC變?yōu)榧t色的三苯基甲Ｘ（TTＦ）儀器與用品１、實驗儀器恒溫箱，燒杯，培養(yǎng)皿，鑷子，刀片、天平２、實驗試劑0.5%TTC溶液３、實驗材料種子第五十三頁，共93頁。方法與步驟1、浸種將待測種子于30-35℃溫水中浸種，以增強種胚的呼吸強度，使顯色迅速。2、顯色取吸脹種子200粒，縱切為兩半，將其中一半置于2只培養(yǎng)皿中（每皿100粒），另一半沸水煮5min殺死胚，加入適量的TTC，30℃保溫0.5-1h。3、觀察結(jié)果，計算活種子的百分率。第五十四頁，共93頁。Ⅱ溴麝香草酚藍(lán)法（BTB法）實驗原理凡活細(xì)胞必有呼吸作用，吸收空氣中O2，放出CO2。CO2溶于水成為H2CO2，解離成H+和HCO-，使得種胚周圍環(huán)境的酸度增加，可用溴麝香草酚藍(lán)法來測定酸度的改變。BTB的變色范圍為pH6.0-7.6，酸性呈黃色，堿性呈藍(lán)色，中間經(jīng)過綠色。色澤差異顯著，易于觀察。第五十五頁，共93頁。儀器與用品1、實驗儀器恒溫箱，天平，培養(yǎng)皿，燒杯，鑷子，漏斗，濾紙，瓊脂2、實驗試劑0.1%BTB溶液，1%BTB瓊脂凝膠3、實驗材料種子第五十六頁，共93頁。方法與步驟1、浸種同TTC法2、顯色取吸脹種子200粒，埋于備好的瓊脂凝膠培養(yǎng)皿中（間隔至少1cm）。置于30-35℃

下培養(yǎng)2-4h，觀察種胚周圍的顏色。用沸水殺死的種子作對照。3、算活種子的百分率。第五十七頁，共93頁。Ⅲ紅墨水染色法實驗原理凡生活細(xì)胞的原生質(zhì)膜具有選擇性吸收物質(zhì)的能力，而死的種胚細(xì)胞原生質(zhì)膜喪失這種能力，于是染料便能進(jìn)入死細(xì)胞而染色。儀器與用品1、實驗儀器恒溫箱，燒杯，培養(yǎng)皿，漏斗，鑷子2、實驗試劑5%紅墨水3、實驗材料種子第五十八頁，共93頁。方法與步驟1、浸種同上述TTC法2、染色吸脹種子200粒→縱切為二→一半加5%紅墨水，染色10-15min→倒去紅墨水→用水沖洗→檢查種子死活。用沸水殺死的種子作對照。3、計算活種子的百分率。第五十九頁，共93頁。思考題1、試驗結(jié)果與實際情況是否相符？為什么？2、就你所知還有哪些快速方法可以測定種子的生活力？3、試比較TTC法、BTB法、紅墨水，測定的結(jié)果是否相同，為什么？第六十頁，共93頁。

實驗13高溫和低溫對植物的傷害

第六十一頁，共93頁。【實驗原理】植物在遭遇不良環(huán)境（如高溫、低溫等）時，原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)常受到影響，原生質(zhì)膜的選擇透性喪失，對物質(zhì)的透性發(fā)生變化，鹽類或有機物從細(xì)胞中滲出，進(jìn)入周圍環(huán)境中。通過電導(dǎo)度的測量和糖的顯色反應(yīng)，可以測知物質(zhì)的外滲，表明植物的受害情況。【儀器與用品】1.儀器電導(dǎo)儀，電冰箱，溫箱臺，水浴鍋，燒杯，量筒，移液管，試管，鑷子2.試劑蒽酮試劑3.材料玉米或小麥幼苗第六十二頁，共93頁。【方法與步驟】1.培養(yǎng)玉米或小麥幼苗2.當(dāng)幼苗長2-3cm時，取出幼苗，盡量不要傷害根系，用鑷子除去幼苗上殘留的胚乳，用蒸餾水漂洗數(shù)次，以除去傷口上的物質(zhì)。然后以10株為一組，共3組，分別放在盛有20mL蒸餾水的小燒杯中，務(wù)必將根系浸入水中，將一杯放在45℃溫箱中，一杯放在0-2℃冰箱中，另一杯放在室溫20-25℃條件下。3.經(jīng)過1h、2h、3h后，分別測定每一處理中溶液的電導(dǎo)度。另外吸取溶液0.5mL于試管中，加入蒽酮試劑2mL，于沸水浴中加熱15min,如果溶液變綠，即表明糖類的存在。另以蒸餾水做同樣測定進(jìn)行比較。4.制表記錄實驗結(jié)果。第六十三頁，共93頁。【思考題】1.利用測量電導(dǎo)度和糖的顯色反應(yīng)，試比較水稻和小麥幼苗在低溫和高溫中受害的程度。2.說明這種測量方法的實踐意義。第六十四頁，共93頁。實驗14干旱、低溫對植物（水稻）體ABA含量的影響第六十五頁，共93頁。[實驗原理]

ABA是一種重要的激素，在植物的生長發(fā)育和抗逆境脅迫中起著重要的作用。尤其，在多種逆境條件下體內(nèi)含量增多，誘導(dǎo)多種抗逆蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而提高植物的抗逆性。本實驗分析ABA含量的方法為酶聯(lián)免疫法（ELISA）,該方法是被分析物先與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，然后檢測抗原或抗體上酶標(biāo)記物的活性并進(jìn)行定性定量測定。常用的酶為辣根過氧化酶和堿性磷酸酶。酶可直接標(biāo)記激素分子，也可標(biāo)記第二抗體，稱為酶標(biāo)二抗。這兩類標(biāo)記物分別用于固相抗體型和固相抗原型酶聯(lián)免疫法。本實驗使用前者。第六十六頁，共93頁。

將抗脫落酸(ABA)甲酯的單克隆抗體與已吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體結(jié)合，加入脫落酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，使其與固相華的單克隆抗體結(jié)合，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記脫落酸。提高測定酶標(biāo)脫落酸的被結(jié)合量，換算出樣品中位置的脫落酸含量。第六十七頁，共93頁。[儀器與用品]儀器：酶聯(lián)免疫測定儀，冷凍離心機，恒溫箱，真空泵，漩渦儀，研缽，帶蓋磁盤。試劑：磷酸緩沖液（稱8gNaCl.0.2gKH2PO4,29.6gNa2HPO4,1000ml,pH7.4）,樣品稀釋液（100ml磷酸緩沖液加0.1mlTween-20）,洗滌緩沖液（1000ml蒸餾水中溶解20gNaCl,再加1mlTween-20），ABA標(biāo)準(zhǔn)溶液（用ABA甲酯母液配成參比系列溶液，濃度單位為ng/L），鄰苯二胺基質(zhì)液（稱5g鄰苯二胺,溶于12.5ml0.01mol/LpH5.0磷酸緩沖液，使用前加入12.5ul30%H2O2）。辣根過氧化物酶稀釋緩沖液（在100ml磷酸緩沖液中加入0.1mlTween-20,0.1g白明膠及4g聚乙二醇6000）。材料：15日齡的水稻幼苗分別在室溫、4℃冰箱、不澆灌培養(yǎng)一周苗的葉子。第六十八頁，共93頁。[方法與步驟]脫落酸的提取1、處理好的水稻材料的新鮮葉子，各稱取100-500mg（若取樣后材料部馬上測定，用液氮速凍后保存在-20℃的低溫冰箱中），用2ml80%甲醇研磨至勻漿，轉(zhuǎn)入試管中，再用2ml甲醇將研缽沖洗干凈。5000g離心10min,殘渣加o.5ml甲醇液，再離心1次，合并上清液，記錄體積，殘渣棄去。脫落酸純化

2、取300ul上清液轉(zhuǎn)入5ml塑料離心管中，用氮氣吹干，用200ul0.1mol/lNa2HPO4（pH9.2）溶解，加等體積的乙酸乙酯，蝸旋，萃取3次，合并乙酸乙酯相，用氮氣吹干。

第六十九頁，共93頁。脫落酸的甲酯化3、上述氮氣吹干得樣品用200ul甲醇溶液，加入過量的重氮甲烷至樣品呈黃色，10min后加入半滴0.2mol/L乙酸甲醇破壞過量的重氮甲烷（黃色消失），氮氣吹干，加入300uL0.01mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）溶解樣品。脫落酸的測定4、取一次性酶標(biāo)板，在每小孔中加入100ul兔抗鼠Ig抗體溶液用于包被聚苯乙烯反應(yīng)板的微孔，然后將酶標(biāo)板放入內(nèi)鋪有濕紗布的帶蓋磁盤內(nèi)，4℃下過夜或37℃下放置2h。棄去孔內(nèi)溶液，用磷酸緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，甩干。5、各孔中加入100ul抗ABA甲酯的單克隆抗體的，37℃下放置60min,洗板，甩干。第七十頁，共93頁。6、各孔內(nèi)依次加入標(biāo)準(zhǔn)ABA容液或待測樣品，每個樣品重復(fù)3次，于20℃放置20min，洗板，甩干。7、各孔加入100ul辣根過氧化物酶稀釋緩沖液，濕盒在37℃放置60min，洗板，甩干。8、暗中，各孔加入100ul鄰苯二胺基質(zhì)液，濕盒在37℃顯色15min，加入50ul硫酸中止反應(yīng)。9、用酶聯(lián)免疫儀，測定490nm處各孔的OD，以加入ABA母液的孔調(diào)0（標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度孔），以加入不含ABA甲酯的磷酸緩沖液孔的OD值為B0,以加入ABA甲酯各標(biāo)準(zhǔn)溶液孔的OD值為Bi。求出每份樣品孔的平均值。第七十一頁，共93頁。10、以標(biāo)準(zhǔn)的ABA甲酯摩爾濃度的產(chǎn)果年糕對數(shù)log[ABA]為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)的In[Bi/(Bo-Bi)]為縱坐標(biāo)（Y）,得到一條Y=a+bX的直線。11、將樣品孔得OD值代入公式，換算出ABA甲酯摩爾數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，除以樣品重量，得每克樣品的ABA量。[思考題]干旱和低溫條件下，植株體內(nèi)的ABA含量與對照比是否有顯著的增高？解釋乙酸乙酯萃取脫落酸的原理。第七十二頁，共93頁。實驗15植物組織培養(yǎng)1-培養(yǎng)基的配制第七十三頁，共93頁。[實驗原理]

植物組織培養(yǎng)（planttissueculture）是指在無菌條件下，在人工制備的培養(yǎng)基上培養(yǎng)植物的離體器官、組織、細(xì)胞的技術(shù)。其理論依據(jù)為細(xì)胞的全能性。培養(yǎng)基為離體培養(yǎng)物提供了細(xì)胞分裂、生長及分化所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基成分包括大量元素（如N,P,K,Ca,Mg）、微量元素（如B,Mn,Cu,Zn,Fe）、有機物、碳源和植物激素等。第七十四頁，共93頁。[儀器與用品]

高壓消毒器、電爐（800-1000w）、電子天平（精確度0.01;0.001各一臺）、pH計、50；100ml三角瓶、90cm培養(yǎng)皿、1000ml和500ml燒杯、量筒（50ml;100ml;5ml）、漏斗（6-8cm）、封口膜、封瓶膜、牛皮筋、細(xì)口瓶(500ml;1000ml)。蔗糖、硝酸銨、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硼酸；萘乙酸、6-芐基腺嘌呤、6-呋喃甲基腺嘌呤、赤霉素等。

第七十五頁，共93頁。[實驗步驟]

1、分別配制MS培養(yǎng)基的大量元素20倍、微量元素200倍、有機物200倍母液、植物激素：萘乙酸、6-芐基腺嘌呤、6-呋喃甲基腺嘌呤、赤霉素等的1mg/L的母液并分裝。2、按以下方案設(shè)計附加激素的培養(yǎng)基配方及配制培養(yǎng)基（激素濃度mg/L）

NAA6-BA）00MS(1號)11/0（4號）22/0（7號）0.510/0.5（2號）0/1（3號）1/0.5（5號）1/1（6號）2/0.5（8號）2/1（9號）第七十六頁，共93頁。（1）取母液大量元素微量元素鐵鹽有機物（2）稱量蔗糖(30g/L)(3)稱瓊脂粉(7g/L)

加蒸餾水600ml/L

混合--定容--調(diào)pH值--分裝封瓶口--高壓滅菌--冷卻--凝固第七十七頁，共93頁。[注意事項]1、不要將培養(yǎng)基倒在瓶口上。2、高壓滅菌不能超過20min.[思考題]1、試述培養(yǎng)基中蔗糖的作用。2、高壓滅菌的時間是多長？為何不宜過長和過短？第七十八頁，共93頁。實驗16植物組織培養(yǎng)2-材料的消毒、接種與培養(yǎng)（愈傷組織的誘導(dǎo)與器官的分化）第七十九頁，共93頁。[實驗原理]

用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段叫外植體（explant）,外植體切口可經(jīng)脫分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織經(jīng)分化可形成根、芽等器官。植物激素在愈傷組織分化過程中起重要作用；當(dāng)生長素與細(xì)胞分裂素比值高時，有利于根的分化，當(dāng)二者比值低時有利于芽的分化，當(dāng)二者比值相等時有利于愈傷組織的生長。第八十頁，共93頁。[儀器與用品]

1、儀器：超靜工作臺；恒溫培養(yǎng)箱、光照培養(yǎng)箱；或光、暗恒溫培養(yǎng)室；噴霧器；手術(shù)剪刀；槍頭鑷子；解刨刀；衛(wèi)生紙;紫外燈；酒精燈等。2、材料：菊花花蕾、嫩莖、嫩葉。第八十一頁，共93頁。

[實驗步驟]

1、接種室和超靜工作臺的通風(fēng)和消毒；1）、接種室先開紫外燈20分鐘，關(guān)燈后20-30分鐘人在進(jìn)入；2）、超凈工作臺表面用70%乙醇擦拭一遍，后開啟紫外燈并通風(fēng)20分鐘。2、操作者的消毒更換干凈的工作服，戴工作帽和口罩；用肥皂水清洗雙手，擦干，再用酒精棉球擦拭一遍。第八十二頁，共93頁。3、外植體的消毒

1）如果材料表面有灰塵，現(xiàn)用自來水沖洗3-5分鐘。用吸水紙擦干表面水分。2)以后在工作臺中進(jìn)行，將菊花嫩莖切成4-5厘米的小段、花蕾的花瓣分開、嫩葉片一分為二，且放置在消過毒的三角瓶中，倒入70%乙醇并浸泡30秒鐘，用無菌水沖洗一次后，再用0.1%的升汞溶液浸泡8分鐘。期間需要動山腳平數(shù)次；最后用無菌水沖洗5-6次，無菌紙吸干備用第八十三頁，共93頁。4、切割材料和接種

剪刀、鑷