內容概要棒狀桿菌屬及白喉棒狀桿菌簡介棒狀桿菌與疾病常用種屬鑒定靶點及序列比對棒狀桿菌毒力因子及序列比對文獻第一頁，共22頁。棒狀桿菌屬及白喉棒狀桿菌簡介棒狀桿菌屬(Corynebacterium)是一群革蘭染色陽性桿菌。本屬細菌的特點是菌體一端或兩端膨大呈棒狀，菌體染色不均勻，可出現異染顆粒。該菌屬無莢膜、無鞭毛，不產生芽胞。種類較多，廣泛分布于動、植物。可在人體皮膚、上呼吸道和泌尿生殖道粘膜等處定居。大多為非致病菌或條件致病菌，其中白喉棒狀桿菌是唯一能引起人類致病且具較強傳染性的菌種。白喉棒狀桿菌的異染顆粒（Albert染色）第二頁，共22頁。白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae)，俗稱白喉桿菌，是白喉的病原菌。白喉是一種急性呼吸道傳染病，患者咽喉部粘膜可出現灰白色的假膜。該菌能產生強烈外毒素，進入血液可引起全身中毒癥狀。菌體細長微彎，一端或兩端膨大呈棒狀。細菌排列不規則，常排列呈V、L等形狀。革蘭染色陽性。用美藍短時間染色菌體著色不均勻，出現有深染的顆粒。用Neisser或Albert等法染色，這些顆粒與菌體著染顏色不同，稱為異染顆。顆粒的主要成分是核糖核酸和多偏磷酸鹽，在鑒定時有重要意義。但當細菌衰老時異染顆粒被消耗而不明顯，且細胞壁變薄易被脫色，常造成革蘭染色不定，有時可表現為在革蘭陰性的菌體中見有陽性顆粒或節段。需氧或兼性厭氧。在血平板上可生長，菌落大小1~3mm。在含有凝固血清的呂氏血清斜面上生長迅速，涂片染色異染顆粒明顯。分離培養時常用亞碲酸鉀血平板作為鑒別選擇培養基。因亞碲酸鉀能抑制雜菌，而白喉棒狀桿菌不受影響，并能吸收亞碲酸鹽使其還原為黑色的金屬碲，菌落呈黑色。白喉棒狀桿菌在亞碲酸鉀血平板上可形成三種不同形態特征的菌落，分別稱為重型、輕型和中間型。三型的產毒株與疾病的輕重程度無明顯的對應關系，但對流行病學分析具有一定意義。在我國以輕型多見。白喉棒狀桿菌對濕熱抵抗力不強，58C10分鐘或煮沸1分鐘死亡。但對寒冷、干燥和日光的抵抗力較其他無芽胞菌強。在衣服、床單、玩具上可存活數天至數周。對常用消毒劑抵抗力較弱，5%石碳酸1分鐘、3%來蘇爾10分鐘處理可殺滅。對青霉素、氯霉素、紅霉素等敏感。第三頁，共22頁。棒狀桿菌與疾病棒狀桿菌種名臨床疾病與癥狀C．diphtheriae臨床上引起白喉，主要侵犯口咽、鼻咽等部位，局部形成灰白色假膜，有咽白喉、喉白喉、鼻白喉和氣管白喉之分。其產生的外毒素可損害心肌和神經系統，病死率高，死亡的病例中50%以上是由于心肌受損發展到充血性心力衰竭所致，可引起心肌炎、軟腭麻痹、聲嘶、腎上腺功能障礙等癥狀。此外，本菌可侵犯眼結膜、外耳道、陰道和皮膚傷口C．pseudodiphtheriticum偶爾可引起心內膜炎、尿路感染、骨感染C．ulcerans可產毒素，引物呼吸道白喉樣疾病，也與奶牛乳腺炎有關C．amycolatum可引起心內膜炎C．striatum關節炎，敗血癥C．jeikeium在免疫抑制或免疫功能不全的人身上引起機會性感染，比如骨髓移植中引起的機會性感染，也可引起關節炎，心內膜炎，敗血癥。C．urealyticum可引起泌尿道感染，產生大量尿素酶使尿液變堿，易導致結石形成。C．xerosis常寄居于眼結膜，可引起關節炎，心內膜炎，胸膜肺炎，腹膜炎，骨髓炎，膿毒性關節炎，腦膜炎等。C．pseudotuberculosis可引起小反芻動物干酪樣淋巴結炎C．bovis可引起牛乳房炎C．renale引物牲畜膀胱炎和腎盂腎炎C．pyogenes從牛、羊和豬的化膿性損傷中分離到，跟奶牛乳腺炎有關，人類感染已有報告.第四頁，共22頁。常用種屬鑒定靶點及序列比對靶微生物基因生理功能特異性敏感性備注C.pseudotuberculosis16S[1,11]核糖體RNA假陽性—與C.ulcerans交叉C.diphtheriaeC.ulceranstox[2,5,6,8,9,10,12,13,14]白喉毒素假陰性10copiesperreactiontube某些菌株不含有此基因C.diphtheriaeC.ulceransrpoB[2,11]RNA聚合酶亞基B—10copiesperreactiontubeC.diphtheriaedtxR[3,12]代謝調節和毒素合成調節因子100%—C.pseudotuberculosisrpoB[4]RNA聚合酶亞基B100%1pg和16S聯用3重PCR特異性達100%，敏感性達1pgC.pseudotuberculosisPld[4]外毒素PLD100%1pg第五頁，共22頁。靶微生物基因生理功能特異性敏感性備注C.JeikeiumC.urealyticum16S-23S[7]核糖體RNA間區————16S-23S序列多態能夠清楚區分這兩個種第六頁，共22頁。種屬鑒定靶點的選定16S作為國際公認的細菌分類“金標準”，作為細菌屬的鑒定靶點是得到認可的，在已下載到的棒狀桿菌文獻中，缺乏關于棒狀桿菌屬鑒定靶點的描述，介于16S在分類上應用的普遍性和權威性，在此將16S暫定為棒狀桿菌屬的鑒定靶點。代謝調控因子編碼基因dtxR和RNA聚合酶亞基B編碼基因rpoB是白喉棒狀桿菌鑒定討論最多的靶點，特別是dtxR在白喉的鑒定中表現出良好的特異性，現將dtxR作為白喉的首選鑒定靶點，rpoB作為備選，以區分白喉和非白喉。換句話說，只要16S顯陽性，排除假陽性的結果，就認為是棒狀桿菌屬的細菌，再加上dtxR和rpoB顯陽性，排除假陽性結果，就說明是白喉，如果是陰性就說明是棒狀桿菌的其他種，其他種在這不進行細致的鑒定。第七頁，共22頁。臨床上棒狀桿菌中的致病種包括白喉棒狀桿菌在內，有36個種，然而在此不可能將數目眾多的種都考慮進去，產毒白喉棒狀桿菌（C．diphtheriae）是最主要的致病種，也是絕對致病種，在本課題中作為重點考慮，此外，在16S的比對中將條件致病種C．pseudodiphtheriticum，C．ulcerans，C．amycolatum，C．striatum，C．jeikeium，C．urealyticum和C．xerosis考慮進去，另加跟牛乳腺炎有關的2個種：C．bovis和C．pyogenes。第八頁，共22頁。16S序列比對選取白喉棒狀桿菌（C.diphtheriae）等10個種的16S序列進行比對，共計278條序列。棒狀桿菌屬鑒定16S-1第九頁，共22頁。由于文獻都是直接用靶基因鑒定到種，沒有用16S屬的鑒定棒狀桿菌屬的引物，屬引物還需自行設計。第十頁，共22頁。dtxR序列比對選取白喉棒狀桿菌21條dtxR序列進行比對。第十一頁，共22頁。文獻中dtxR引物Targetmicrob序列（5'-3）'Location產物長度(bp)白喉[3]GGGACTACAACGCAACAAGAACAACGGTTTGGCTAACTGTA568-588809-828260第十二頁，共22頁。rpoB序列比對選取白喉（C．diphtheriae）等9個種的rpoB序列進行比對，合計102條。第十三頁，共22頁。文獻中的棒狀桿菌rpoB引物Targetmicrob序列（5'-3）'Location產物長度(bp)C.Pseudotuberculosis[4]CGTATGAACATCGGCCAGGTTCCATTTCGCCGAAGCGCTG2767-27863208-3227446第十四頁，共22頁。棒狀桿菌毒力因子及序列比對種主要毒力因子相關基因分布率備注C．diphtheriae白喉毒素（DT）Tox[2,3,5,8,11,12,14，15]54%[5]該種某些菌株不攜帶該毒素，為溶原噬菌體攜帶,A,B兩個亞基組成,有的菌株只有A亞基，有的只有BC．ulcerans白喉毒素（DT）Tox[2,8,10]11/20[9]A,B兩個亞基組成外毒素PLD（鞘磷脂酶）PLD[4]__C.pseudotuberculosis外毒素PLD（鞘磷脂酶）PLD[4]100%[4]_第十五頁，共22頁。白喉毒素tox基因比對選取13株C.diphtheriae的白喉tox基因和15株C.ulcerans的tox基因進行比對。第十六頁，共22頁。文獻中白喉毒素tox引物Targetmicrob序列（5'-3）'Location產物長度(bp)C．Diphtheriae[2]AndC．ulceransTGAAACCCGTGGAAAACGAGACTCTATCTTTGTCTTAGCGTGTCAGGCGATCAGTAGGT(diphtheriae)CTCATTGTCATGCATAAATCTTGAT(ulcerans)576-593713-732643-663666-690156C．DiphtheriaefortoxAsubunit[16]GAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCA118-137338-366248C．DiphtheriaefortoxBsubunit[16]ATACTTCCTGGTATCGGTAGCCGAATCTTCAACAGTGTTCCA991-10111267-1287297白喉毒素又A,B2個亞基組成，但某些菌株只存在一種亞基，另一亞基丟失的情況，建議針對這兩個亞基分別設計1對引物檢測，方能對菌株是否含有白喉毒素進行準確定性。第十七頁，共22頁。鞘磷脂酶PLD基因比對選取10株C.ulcerans的PLD基因進行比對選取17株C.pseudotuberculosis的PLD基因進行比對第十八頁，共22頁。文獻中PLD引物Targetmicro序列（5'-3）'Location產物長度(bp)C.pseudotuberculosis[4]ATAAGCGTAAGCAGGGAGCAATCAGCGGTGATTGTCTTCC506-525689-708203第十九頁，共22頁。參考文獻[1]BurhanC?etinkayaa,*,MuratKarahana,ErayAtila,etal.IdentificationofCorynebacteriumpseudotuberculosisisolatesfromsheepandgoatsbyPCR[J].VeterinaryMicrobiology88(2002)75–83.[2]FabiolaMancini,MonicaMonaco,MarcoPataracchia,etal.IdentificationandmoleculardiscriminationoftoxigenicandnontoxigenicdiphtheriaCorynebacteriumstrainsbycombinedreal-timepolymerasechainreactionassays[J].DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease73(2012)111–120.[3]FabriciaP.Pimenta,GiseleA.M.Matias,GabrielaA.Pereira,etal.APCRfordtxRgene:Applicationtodiagnosisofnon-toxigenicandtoxigenicCorynebacteriumdiphtheriae[J].MolecularandCellularProbes22(2008)189–192.[4]LuisG.C.Pacheco,RobertaR.Pena,ThiagoL.P.Castro,etal.MultiplexPCRassayforidentificationofCorynebacteriumpseudotuberculosisfrompureculturesandforrapiddetectionofthispathogeninclinicalsamples[J].JournalofMedicalMicrobiology(2007),56,480–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