發(fā)酵學生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)與保藏演示文稿當前1頁，總共44頁。優(yōu)選發(fā)酵學生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)與保藏當前2頁，總共44頁。生產(chǎn)菌種的制備：

即種子制備，是發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序。即將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌種的過程。目的：提供發(fā)酵產(chǎn)量高、生產(chǎn)性能穩(wěn)定、數(shù)量充足、未被雜菌污染的生產(chǎn)用菌種當前3頁，總共44頁。第一節(jié)種子制備的過程第二節(jié)種子質(zhì)量控制第三節(jié)種子保藏與復壯當前4頁，總共44頁。第一節(jié)種子制備的過程當前5頁，總共44頁。兩個過程：孢子制備過程－固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)孢子，種子制備過程－液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲。當前6頁，總共44頁。（一）放線菌孢子的制備

1.一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨、無機鹽

2.

C和N源不要太豐富（C約為1%，N約為0.5%）

3.干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導孢子形成。

4.斜面培養(yǎng)溫度大多為28℃，少數(shù)為37℃。

5.

培養(yǎng)時間5~14天。一、孢子制備當前7頁，總共44頁。一、孢子制備（二）霉菌孢子的制備

1.霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。

2.霉菌培養(yǎng)溫度大多為25~28℃。

3.

培養(yǎng)時間4~14天。

當前8頁，總共44頁。一、孢子制備（三）細菌孢子的制備

1.一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，碳源限量而氮源豐富，如牛肉膏、蛋白胨作有機氮源

2.細菌培養(yǎng)溫度大多為37℃少數(shù)為28℃。

3.細菌和菌體培養(yǎng)時間1~2天，可產(chǎn)芽孢的菌則5~10天。

當前9頁，總共44頁。二、種子制備

是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出來的孢子或菌體轉入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。目的：形成一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體。當前10頁，總共44頁。方法：搖瓶種子制備和種子罐種子制備種子罐的級數(shù)主要決定于菌種的性質(zhì)、菌體生長速度、發(fā)酵設備的合理應用。一級種子、二級種子……N＋1級發(fā)酵搖瓶種子制備：某些孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進入種子罐。培養(yǎng)基要求比較豐富和完全，并易被菌體分解利用，氮源豐富有利于菌絲生長。種子罐種子制備：當前11頁，總共44頁。細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐（27?C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級種子罐（27?C,10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐

放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵當前12頁，總共44頁。種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會；種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會；種子罐級數(shù)：產(chǎn)物的品種、生產(chǎn)規(guī)模、工藝條件。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數(shù)。

確定種子級數(shù)需注意的問題當前13頁，總共44頁。第二節(jié)種子質(zhì)量控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及其控制培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和濕度、培養(yǎng)時間和接種量。二、影響種子質(zhì)量的因素及其控制孢子質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡和接種量。當前14頁，總共44頁。影響孢子質(zhì)量的因素及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件接種量一、影響孢子質(zhì)量的因素及其控制

當前15頁，總共44頁。(一)培養(yǎng)基影響因素：原材料；瓊脂的牌號不同；水質(zhì)的影響注意事項：原材料需經(jīng)過化學分析及搖瓶發(fā)酵實驗嚴格控制滅菌后的培養(yǎng)基質(zhì)量使用前應在適當溫度下放置一定時間考慮不同代謝類型的菌落對多種氨基酸的選擇當前16頁，總共44頁。(二)培養(yǎng)溫度和濕度龜裂鏈霉菌斜面最適溫度為36.5～

37℃菌體的糖代謝和氮代謝的各種酶類，對溫度的敏感性是不同的，培養(yǎng)溫度不同，菌體的生理狀態(tài)也不同。因此，需要用最適合孢子生長的溫度進行培養(yǎng)。培養(yǎng)室的相對濕度對孢子形成的速度、數(shù)量和質(zhì)量有很大影響。在北方相對濕度控制在40%～45%；而在南方則控制在35%～42%當前17頁，總共44頁。(三)培養(yǎng)時間和冷藏時間1、孢子的培養(yǎng)時間孢子的培養(yǎng)時間應控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。2、孢子的冷藏時間冷藏時間宜短不宜長。冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右冷藏，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體開始自溶。而培養(yǎng)5天后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6?C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。當前18頁，總共44頁。(四)接種量制備孢子時的接種量要適中。接種量的大小影響到在一定量培養(yǎng)基中孢子的個體數(shù)量的多少，進而影響到菌體的生理狀況。當前19頁，總共44頁。二、影響種子質(zhì)量的因素及其控制影響種子質(zhì)量的因素及控制接種量種齡孢子的質(zhì)量培養(yǎng)基培養(yǎng)條件當前20頁，總共44頁。(一)培養(yǎng)基主要是碳源、氮源、無機鹽、生長素和水等。選用原則：營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要；營養(yǎng)成分要盡可能地和發(fā)酵培養(yǎng)基接近；pH值要比較穩(wěn)定當前21頁，總共44頁。(二)培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量:在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。當前22頁，總共44頁。(三)種齡種齡：種子罐中培養(yǎng)液從開始接種到移入下一級種子罐或發(fā)酵罐的培養(yǎng)時間。種齡過短—→前期生長緩慢、整個發(fā)酵周期延長。種齡過長—→生產(chǎn)能力下降、菌絲過早自溶最適的種齡為生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，菌體量尚未達到最高峰時移種。當前23頁，總共44頁。(四)接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度。采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖到達高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來。生產(chǎn)上多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)的措施。雙種法：二只種子罐接一只發(fā)酵罐倒種法：以適宜的發(fā)酵液倒出適量給另一發(fā)酵罐作種子當前24頁，總共44頁。三、種子質(zhì)量標準細胞或菌體：以單細胞菌體為種子的質(zhì)量要求菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列和形態(tài)；以霉菌、放線菌為種子的質(zhì)量要求是菌絲粗壯，對某些染料著色力強、生產(chǎn)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況良好。生化指標：種子液的糖、氮、磷含量的變化和pH值變化。產(chǎn)物生成量：測定產(chǎn)物含量。酶活力：如胞內(nèi)的淀粉酶等。當前25頁，總共44頁。四、種子的異常狀況菌種生長發(fā)育異常孢子質(zhì)量、種子罐的培養(yǎng)條件菌絲結團攪拌效果差、接種量小菌絲粘壁攪拌效果不好、泡沫過多以及種子罐裝料系數(shù)過小等當前26頁，總共44頁。第三節(jié)種子保藏與復壯一、菌種保藏

優(yōu)良菌種被選育出來后，要保持其生產(chǎn)性能穩(wěn)定、不污染雜菌、不死亡，這是保藏菌種的主要目的。當前27頁，總共44頁。（一）菌種保藏的原理

根據(jù)菌種的生理生化特性，人工創(chuàng)造條件使菌體的代謝活動處于休眠狀態(tài)。通常利用菌種的休眠體（孢子、芽孢等），采用的方法有低溫、隔絕空氣或氧氣、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)，以降低菌種的代謝活動，減少菌種的變異，達到長期保存的目的。當前28頁，總共44頁。（二）菌種保藏的方法各種微生物由于遺傳特性不同，因此適合采用的保藏方法也不一樣。一種良好的有效保藏方法，首先應能保持原菌種的優(yōu)良性狀長期不變，同時還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設備的普及性。當前29頁，總共44頁。1、斜面低溫保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。應用范圍：適用于細菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。優(yōu)點：簡便易行，容易推廣，存活率高缺點：菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。當前30頁，總共44頁。2、液體石蠟封藏法在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕。應用范圍：適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好。優(yōu)點：操作簡單，保藏時間長（1～2年）缺點：對很多厭氧性細菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。當前31頁，總共44頁。3、固體曲保藏法采用麩皮、大米、小米或麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為產(chǎn)孢子培養(yǎng)基，使菌種產(chǎn)生大量的休眠體（孢子）后，在室溫或低溫加以保存。應用范圍：適用于產(chǎn)孢子的真菌要點：控制適當?shù)乃之斍?2頁，總共44頁。4、沙土管保藏法先將砂與土分別洗凈、烘干、過篩，按一定比例混勻，分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，以121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘干并經(jīng)無菌檢查后備用。需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)，再以無菌水制成108～1010個/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，封口后置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。特點：保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約1～10年。當前33頁，總共44頁。5、冷凍干燥法用保護劑（脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等）制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。應用范圍：適用于除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌之外的其他大多數(shù)微生物如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等優(yōu)點：保藏期長，一般達5～15年，存活率高，變異率低缺點：該法操作比較煩瑣，技術要求較高，且需凍干機當前34頁，總共44頁。當前35頁，總共44頁。6、液氮超低溫保藏法是以甘油、二甲基亞砜等作為保護劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細胞內(nèi)的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結成冰晶而使細胞損傷。應用范圍：適用于各種微生物菌種的保藏

優(yōu)點：操作簡便、高效、保藏期一般可達到15年以上；可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進行保藏（孢子或菌體、液體或固體）缺點：超低溫液氮設備，且液氮消耗較多，操作費用較高當前36頁，總共44頁。（三）菌種保藏的注意事項1、菌種在保藏前所處的狀態(tài)絕大多數(shù)微生物的菌種均保藏其休眠體。2、菌種保藏所用的基質(zhì)斜面低溫保藏：碳源應少些、營養(yǎng)成分應貧乏砂土管保藏：砂和土要充分洗凈冷凍干燥：應注意保護劑3、操作過程對細胞結構的損害當前37頁，總共44頁。二、菌種的復壯菌種復壯：使衰退的菌種重新恢復原來的優(yōu)良特性。菌種衰退：生產(chǎn)上使用的菌種，在使用和保藏過程中，逐漸向不利于生產(chǎn)的方向發(fā)展變化，這種變化稱之為菌種衰退。當前38頁，總共44頁。1.純種分離法通過純種分離,可將衰退菌種細胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細胞分離出來,經(jīng)擴大培養(yǎng),就可恢復原菌株的典型性狀。采用稀釋平板法、涂布平板法、平板劃線法等方法獲得單菌落。當前39頁，總共44頁。2.淘汰法將衰退菌種進行一定的處理（如藥物，低溫、高溫等），往往可以起到淘汰已衰退個體而達到復壯的目的。

3.選擇合適的培養(yǎng)條件將保藏后的菌種接種在保藏前所使用的同一培養(yǎng)基上，有利于原有性狀的恢復。當前40頁，總共44頁。（1）ATCCAmericanTypeCultureCollection.Rockvil1．。美國標準菌種收藏所，美國，馬里蘭洲，羅克維爾市。（2）CSH〔（ColdSpr