第二節細胞化學染色檢驗為什么要做組織化學染色火眼金睛能辨認出什么細胞？原始淋巴細胞？原始單核細胞？原始粒細胞？其它腫瘤細胞？

細胞化學(或組織化學)是組織學的一個分支，是在細胞形態學的基礎上研究細胞的生物化學成分、定位、定量及代謝功能狀態的學科。細胞化學染色

CytochemicalStaining實質是原位顯示細胞成分結構，為不移動有機化學物。細胞化學染色包括三個步驟：固定有色沉淀反應復染細胞化學染色的基本步驟固定（fixation）物理法：干燥、火焰化學法：液體固定(甲醛、乙醇、甲醇、丙酮)顯示(display)：通過化學反應形成有色沉淀顯示被測物質。偶氮偶聯法聯苯胺法普魯士藍法雪夫反應金屬沉淀法保持細胞結構及化學成分的不變使細胞內的蛋白質、酶類、糖類等變成不溶性物質。細胞化學染色的基本步驟復染(doublestaining)復染顏色應與有色沉淀的顏色有明顯對比。化學定量（chemicalquantitativeanalysis）定性半定量定量鐵染色中性粒細胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應酯酶染色酸性磷酸酶染色普魯士蘭染色法（1958郁知非方法）1.原理:根據BM中含Fe3+與蛋白質結合較疏松，經稀HCL處理后，呈游離Fe3+。在酸性溶液中與亞鐵氰化鉀作用后呈蘭綠色，有折光，圓形顆粒或珠、塊狀。

4Fe++++3K4[Fe(CN)6]Fe4[Fe(CN)6]3

一、鐵染色貯存鐵（鐵蛋白+含鐵血黃素），主要分布網狀細胞內。細胞外鐵骨髓小粒

幼稚紅細胞的非血紅素含鐵顆粒，又稱鐵粒幼紅細胞。分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和環形鐵粒幼紅細胞細胞內鐵少數含小顆粒的正常成熟紅細胞稱鐵粒紅細胞鐵粒紅細胞2.鐵染色分類細胞外鐵細胞內鐵鐵粒紅細胞3.正常范圍細胞外鐵：

+～++細胞內鐵：

12～44%4.臨床意義⑴缺鐵性貧血（IDA）---診斷IDA及指導鐵劑治療的一種輔助方法。⑵鐵粒幼細胞貧血---環形鐵粒幼紅細胞增多⑶MDS---環形鐵粒幼紅細胞＞15%，外鐵↑⑷非缺鐵性貧血：HA、MegA、AA、多次輸血、白血病等，內外鐵N/↑；感染、肝硬化、尿毒癥等，外鐵↑內鐵↓缺鐵性貧血（IDA）巨幼紅細胞性貧血

內鐵顆粒多MDS-RA、RAEB、RAEBT鐵染色

N/↓/↑

環形鐵粒幼細胞（RS）大于15%---RAS診斷鐵染色中性粒細胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應酯酶染色酸性磷酸酶染色

血細胞含有的磷酸水解酶主要

堿性磷酸酶ALP

酸性磷酸酶ACP

ALP由許多同工酶組成，在堿性條件下(最適pH為9.3～9.6)催化各種醇和酚的單磷酸酯。二、堿性磷酸酶染色鈣鈷法Gomori-Takamaish偶氮偶聯法底物:磷酸萘酚AS-MXTomonaga1963

萘酚AS-BI磷酸鈉Kaplow1963α-磷酸萘酚鈉重氮鹽:堅固藍B固蘭RR固紫B鹽1.染色方法

Kaplow法中性粒細胞中的堿性磷酸酶在pH9.6水解磷酸萘酚鈉，釋放萘酚，后者與偶氮鹽耦合形成不溶性的染料。

2.染色原理ALP偶氮偶聯法原理陽性：中性粒細胞的標志酶，ALP的含量以晚幼和成熟粒細胞為最高,原粒ALP反應陰性；網狀細胞強陽性。陰性：嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、巨核細胞、漿細胞及紅系細胞。3.分布4.染色分級反應(-)0分：陰性反應，胞漿中無陽性染色顆粒。(+)1分：胞漿少量顆粒或呈彌散淺紅色。(++)2分：胞漿中含有中等量顆粒或彌散受色。(+++)3分：胞漿中有豐富的顆粒或彌散深色，胞核清晰。(++++)4分：極豐富粗大顆粒，或彌散深色，胞核不清晰。NAP積分：NAP反應結果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）

204020155積分=（0×20）+（1×40）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145陽性率為80%。細菌感染ALP染色CMLALP陰性5.ALP正常范圍陽性率:〈40%陽性指數:30～130分⑴生理變化年齡：NAP活性在新生兒很高，3個月開始降低，嬰幼兒和兒童期仍略高于成年人，60歲以上老年期NAP活性降低。應激狀態：恐懼、緊張、妊娠、分娩和劇烈運動等應激狀態下NAP活性可增高。性別：女性＞男性；經前期＞行經期6.臨床意義⑵病理變化：炎癥反應，各種急性化膿性感染，球菌性較桿菌性感染為高；急性感染較慢性感染高。病毒性感染或寄生蟲感染、立克次體感染時ALP積分值一般正常或降低。類白血病與CML鑒別：前者中性粒細胞ALP表現極度增高，CML減低。ALP增高

急淋、慢淋、多發性骨髓瘤、原始神經母細胞瘤、再障、真性紅細胞增多癥、骨髓纖維化、慢性中性粒細胞白血病、惡性淋巴瘤、骨髓轉移癌、原發性血小板增多癥等。

ALP降低慢粒、惡性組織細胞病、急性髓系白血病陣發性睡眠性血紅蛋白尿。MDS正常或減低。

增高減低類白血病慢性粒細胞白血病慢性中性粒細胞白血病慢性粒細胞白血病細菌感染病毒感染再生障礙性貧血PNH

正常減低反應性組織細胞增多癥惡性組織細胞病

正常增高

繼發性紅細胞增多癥真性紅細胞增多癥繼發性血小板增多癥原發性血小板增多癥ALP鑒別意義鐵染色中性粒細胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應酯酶染色酸性磷酸酶染色1.實驗方法

1958年Washburn復方聯苯胺法

1965年Kaplow二鹽酸聯苯胺法

1985年血液學國際標準化委員會(ICSH)

二氨基聯苯胺法（DAB染色法）過氧化酶氨基-甲基卡巴唑染色法二鹽酸聯苯胺法三、過氧化物酶染色PeroxidaseStaining(POX)2.染色原理過氧化氫新生態氧過氧化物酶二氨基聯苯胺DBA金黃色沉淀二氨基聯苯胺法二鹽酸聯苯胺法

3.血細胞陽性程度的判斷：（-）無顆粒沉著（±）顆粒細小，分布稀疏（+）顆粒較粗常呈局灶性分布（++）顆粒粗大分布較密占胞漿1/2～2/3（+++）顆粒粗大，呈團塊狀分布（++++）顆粒布滿細胞，可覆蓋胞核4.參考范圍⑴粒細胞系

原粒-/±，粗粒聚集狀；隨細胞成熟反應漸強；衰老細胞因過氧化酶活性降低而反應減弱;嗜酸粒細胞為強陽性反應;嗜堿粒細胞呈陰性或弱陽性反應。⑵其它細胞成熟單核細胞、組織細胞呈-或±；幼紅細胞、淋巴細胞、漿細胞、巨核細胞及血小板均為陰性反應。5.MPO臨床意義POX主要存在于線粒體和溶酶體中，定位于中性粒細胞和單核細胞嗜天青顆粒中。急性白血病MPO反應強弱順序

M3>M2b>M2a>M6(粒)>M4>M1>M5>HAL>ALLALL和AML鑒別：ALLMPO陰性ALLL1L2L3AMLM0急性髓細胞白血病微分化型

M1急性原始粒細胞白血病未分化型

M2—M2a,M2b急性原始粒細胞白血病部分分化型M3—M3a,M3b急性早幼粒細胞白血病M4—M4a,M4b,M4c,M4Eos急性粒-單核細胞白血病M5—M5a,M5b急性單核細胞白血病M6急性紅白血病

M7急性巨核細胞白血病

急性白血病的FAB分型急性淋巴細胞白血病MPO陰性

急性混合型白血病MPO急性髓細胞白血病MPO特點粒系MPO：陽性反應物顆粒粗大，聚集。單核系MPO：陽性反應物細顆粒狀，彌散

早幼粒以下隨細胞分化成熟而↑；

特點：陽性物在細胞核的凹陷處聚集成團，呈團塊狀反應。

M2b中異常中幼粒細胞MPO呈強陽性

特點：陽性物充滿胞漿，細胞外漿一般為陰性。

M3呈強陽性反應。M4MPO染色M5MPO染色急淋ALL急粒AML急單AMOL急粒APL鐵染色中性粒細胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應酯酶染色酸性磷酸酶染色鐵染色中性粒細胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應酯酶染色酸性磷酸酶染色periodicacid-schiff，PAS

又名糖原染色五、過碘酸-雪夫反應1.原理：氧化劑過碘酸把-CHOH-CHOH變成-CHO-CHO，此新生的醛基與無色堿性品紅染液（schiff）結合成紫色染料，其反應顏色的深淺于細胞內乙二醇基的含量成正比。

2.陽性結果

陽性結果為胞質內出現粉紅色物質。細胞核為藍色。

顆粒狀片狀珠狀塊狀

陽性率：100個計數細胞中陽性細胞的個數陽性指數：100個細胞中陽性細胞，按不同強度的細胞個數乘以相對應強度之和。例：（+）×1+（++）×2+

（+++）×3+（++++）×4陽性率及陽性指數計算法細顆粒彌散狀

PAS為裙邊樣反應細顆粒彌散狀見小珠

中粗顆粒散在分布PAS珠狀、塊狀呈冠狀。

3.正常血細胞染色反應⑴粒細胞系原粒細胞多呈（±），少部分見（-）。隨細胞的成熟陽性反應漸強；嗜酸粒細胞顆粒本身不著色，但顆粒間的胞漿呈彌漫粉紅色；嗜堿粒細胞為陽性，反應物呈粗顆粒、珠狀和塊狀。⑵淋巴細胞系大多數呈（-）少數胞質內有少量紅色顆粒B淋巴細胞PAS正常值為陽性率＜20%⑶紅細胞系幼紅細胞和成熟紅細胞均呈（-）。⑷巨核細胞系和血小板

（-）或（+）陽性物呈珠狀或塊狀

⑸單核細胞呈（+），陽性反應物為細顆粒彌散狀、中粗顆粒往往位于胞漿邊緣；

⑹漿細胞大多呈（-），少數為紅色顆粒；

⑺組織細胞為（-）/（+）；

⑻巨噬細胞可呈細顆粒（+）。4.臨床意義⑴白細胞系統疾病的鑒別①原幼淋細胞：陰性陽性細、中粗和粗顆粒散在分布；珠狀和塊狀一個至數個成冠。②成熟淋巴細胞細、中粗、粗顆粒散在分布。

ALLPAS(-)

中粗、粗顆粒散在分布

ALLPAS珠狀③原粒及早幼粒細胞陰性或弱陽性細顆粒彌散狀

M2bPAS細顆粒彌散狀

M3④原、幼稚單核細胞陽性較粒細胞強細、中粗顆粒彌散狀分布，邊緣及外漿處可見粗顆粒。部分在細顆粒基礎上可見小珠；少數呈裙邊樣反應。⑤嗜堿粒細胞PAS為強陽性，

陽性物多表現粗顆粒、珠狀、塊狀。⑵紅細胞系統陰性：正常人和再障。陰性：正常紅細胞、AA、CLL弱陽性：巨幼貧、溶血性貧血強陽性：紅白血病及各類急性白血病的幼紅細胞、MDS、IDA和重型地中海貧血。

IDAPAS

MDSPAS染色M6PAS染色鐵染色中性粒細胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應酯酶染色酸性磷酸酶染色(Esterase)㈠酯酶分類⒈特異性酯酶:氯乙酸萘酚AS-D酯酶(NaphtholAS-Dchloroacetateesterase，NAS-DCE)⒉非特異性酯酶α-醋酸萘酯酶(Alpha-naphtholacltateesterase,α-NAE)醋酸AS-D萘酚酯酶(NaphtholAS-Dacltateasterase,NAS-DAE)α-丁酸萘酯酶(Alpha-Naphtholbutynateasterase,α-NBE)六、酯酶染色

國際血細胞標準化委員會1985年

固紫醬GBC法

新品紅方法特異性酯酶染色方法介紹1.特異性酯酶CE染色原理

細胞內的氯乙酸萘酚酯酶，在作用液中可以將氯乙酸AS-D萘酚進行水解，釋放氯乙酸AS-D與重氮鹽偶聯產生不溶性有色沉淀，定位于胞質內。

CE通常被看成是粒細胞及肥大細胞的標志酶，分布局限，對粒細胞有較強的特異性。CE固紫醬GBC法

CE副品紅方法

2.正常血細胞染色反應⑴粒系原粒細胞呈陰性反應分化好早幼粒細胞至成熟中性粒呈陽性反應;

嗜酸粒細胞呈陰性或弱陽性反應;

嗜堿粒細胞呈陰性反應。⑵單核細胞呈陰性或弱陽性反應。⑶淋巴細胞、漿細胞、幼紅細胞、巨核細胞和血小板均呈陰性反應。⑷組織嗜堿細胞呈強陽性反應。

3.臨床意義急性白血病，陽性率強弱的排列順序為：

M3>M2b>M5>M2a>M4>M6（粒）>Ml>ALL

粒系原始及早幼粒細胞一般陰性，少部分可見弱陽性反應(+～++)。

M2b在細胞核的凹陷處呈團塊狀反應M3呈強陽性反應。易見柴束樣結晶。

單核：陰性或弱陽性，為顆粒狀散狀分布

ALLCE染色陰性

(Non-SpecificEsterase)

非特異性酯酶是一組在酸性、中性和堿性pH條件下，水解各種短鏈脂肪酸酯或芳香族酯的酶。幾乎存在于所有血細胞，包括巨核細胞、漿細胞，甚至上皮細胞的溶酶體內。該酶是單核細胞、巨噬細胞的標志酶,分布較廣泛。非特異性酯酶底物：α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)

醋酸AS-D萘酚酯酶(NAS-DAE)

α-丁酸萘酚酯酶(α-NBE)

重氮鹽堅牢藍B固藍BB六偶氮付品紅

α-醋酸萘酚酯酶

α-Naphtholacetateesterase，α-NAE

1.原理:

在中性條件下，酯酶將醋酸萘酚水解，產生萘酚，在與重氮鹽偶聯，產生不溶性的有色沉淀。

不加NaF積分值-加NaF積分值NaF抑制率

=——————————————×100％

不加NaF積分值

抑制率大于50％為抑制

NaF用量15mg／10m1作用液。2.正常血細胞染色反應⑴粒細胞系:各階段粒細胞均為-或±，隨細胞成熟陽性減弱呈陰性，不被氟化鈉抑制⑵單核細胞:陽性反應較強,能被氟化鈉抑制。⑶其它細胞成熟淋巴細胞部分呈陽性反應，陽性物多表現為顆粒狀，不被氟化鈉抑制；巨核細胞和血小板呈強陽性反應；早期幼紅細胞呈陽性反應，隨幼紅細胞的成熟陽性反應逐漸減弱，不被氟化鈉抑制。NAE正常參考結果

3.臨床意義是單核細胞和巨噬細胞的標志酶

⑴單核細胞系統疾病原始單核細胞呈陽性，陽性細胞呈局灶型或顆粒型反應；少部分為陰性。幼稚單核細胞陰性、弱陽性和強陽性。陽性物顏色鮮艷呈細小顆粒彌散狀加NaF后陽性率及指數明顯降低或陰性。原幼單核細胞NAE染色M5NAE+NaF染色⑵粒系統細胞疾病原始及早幼粒細胞陰性或弱陽性反應，酶型多為彌散型、局灶型，少數可呈顆粒狀。陽性反應不被NaF抑制。M2aNAE染色M2bNAE染色⑶淋巴細胞疾病陰性或陽性，陽性物可呈顆粒型或局灶型，在pH5.0條件下，T-淋巴細胞NSE活性顯示更為充分。有利于ALL和ANLL的鑒別。ALLNAE染色鐵染色中性粒細胞堿性磷酸酶染色過氧化物酶染色蘇丹黑染色過碘酸-雪夫反應酯酶染色酸性磷酸酶染色

酸性磷酸酶染色法(ACP)

存在大部分有核細胞的胞質，共有7種同功酶，在臨床血液學上，酸性磷酸酶反應對診斷HCL，鑒別T-細胞型和非T細胞型淋巴增生有重要意義。是HCL所特有的，HCLACP呈陽性反應，陽性為中等強度或強陽性反應，并具有抗L（+）-酒石酸的功能。

T-ALLACP

B-ALLACP鐵染色中性粒細胞堿性磷酸酶染色（N-ALP）過氧化物酶染色（POX）蘇丹黑染色（SBB）糖原染色（PAS）特異性酯酶（CE）非特異性酯酶（N