發(fā)酵技術(shù)生物工程第1頁/共23頁從廣義上講，發(fā)酵工程由三部分組成：

1：上游工程

2：中游工程

3：下游工程第2頁/共23頁上游工程包括：優(yōu)良種株的選育最適發(fā)酵條件（pH、溫度、溶氧和營(yíng)養(yǎng)組成）的確定營(yíng)養(yǎng)物的準(zhǔn)備第3頁/共23頁中游工程包括：發(fā)酵開始前用高溫高壓對(duì)發(fā)酵原料和發(fā)酵罐及各種連接管道進(jìn)行滅菌的技術(shù)；在發(fā)酵過程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無菌空氣的空氣過濾技術(shù)；在發(fā)酵過程中根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)要求控制加料速度的計(jì)算機(jī)控制技術(shù)；種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)的不同的工藝技術(shù)。發(fā)酵工藝上批量發(fā)酵，流加批量發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵的選擇。第4頁/共23頁下游工程包括：固液分離技術(shù)（離心分離，過濾分離，沉淀分離等工藝）細(xì)胞破壁技術(shù)（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶）蛋白質(zhì)純化技術(shù)（沉淀法、色譜分離法和超濾法等）產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)（真空干燥和冰凍干燥等）第5頁/共23頁補(bǔ)加前體DL-蛋氨酸對(duì)S-腺苷-L-蛋氨酸發(fā)酵的影響S-腺苷-L-蛋氨酸(簡(jiǎn)稱SAM)是一種廣泛存在于活體細(xì)胞內(nèi)的生物小分子,可由ATP:蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT)催化等分子的L-蛋氨酸和ATP合成得到。SAM是甲硫鍵型高能化合物,是生物體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)和中間代謝物質(zhì),具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫等多種生理生化功能。細(xì)胞內(nèi)SAM濃度的微小改變,便會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能產(chǎn)生重大影響。第6頁/共23頁SAM的用途：

在生物學(xué)上具有多種生理作用,主要用于抗抑郁、肝病治療、關(guān)節(jié)炎和偏頭痛治療,此外還具有食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等功能。SAM功能的多元性和無副作用,決定了其應(yīng)用的廣泛性和長(zhǎng)期使用性。1999年美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)上市后,SAM迅速成為暢銷的營(yíng)養(yǎng)保健品之一,年銷售額超過十億美元。它在國(guó)際市場(chǎng)和國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求不斷增長(zhǎng)。近年來,國(guó)外的SAM臨床應(yīng)用已轉(zhuǎn)向?qū)Ω闻K疾患的治療。據(jù)報(bào)道,SAM不僅利于各種急、慢性肝病的治療,而且對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物早期肝癌也具有預(yù)防作用,有望成為肝病治療的理想藥物。我國(guó)是肝病大國(guó),肝病患者眾多,目前國(guó)內(nèi)銷售的SAM粉針劑(思美泰)是主要的護(hù)肝產(chǎn)品之一,長(zhǎng)期依賴進(jìn)口,價(jià)格昂貴,臨床使用受到很大的限制。因此,對(duì)SAM的生產(chǎn)工藝研究是國(guó)內(nèi)當(dāng)前急需解決的問題。第7頁/共23頁通過補(bǔ)加前體提高釀酒酵母SAM-J5E-4發(fā)酵生產(chǎn)S-腺苷-L-蛋氨酸的水平。采用10L罐發(fā)酵,考察在相同的培養(yǎng)條件下,補(bǔ)加不同類型的蛋氨酸前體對(duì)S-腺苷-L-蛋氨酸合成的影響。不補(bǔ)加前體蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果補(bǔ)加前體L-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果補(bǔ)加前體D-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果補(bǔ)加前體DL-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果第8頁/共23頁不補(bǔ)加前體蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果圖1,2為不補(bǔ)加前體蛋氨酸時(shí)SAM的發(fā)酵過程曲線

圖1未補(bǔ)加前體蛋氨酸的細(xì)胞生長(zhǎng)和SAM發(fā)酵結(jié)果第9頁/共23頁圖2未補(bǔ)加前體蛋氨酸的發(fā)酵過程中葡萄糖和乙醇質(zhì)量濃度變化曲線第10頁/共23頁分析：由于SAM的合成是一個(gè)高能耗的過程,每生成一分子的SAM需要消耗36分子ATP,僅靠葡萄糖消耗產(chǎn)生的ATP能量無法實(shí)現(xiàn)高密度積累SAM.結(jié)果表明,在未補(bǔ)加前體蛋氨酸的條件下,SAM的積累量增長(zhǎng)很慢,最高為0.38g/L,生物量最高為128g/L,在發(fā)酵結(jié)束前,容易積累較高濃度的乙醇。第11頁/共23頁補(bǔ)加前體L-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果在生物量達(dá)到80g/L時(shí),開始流加L-蛋氨酸前體,流加速率為2g/(L.h),共流加5h,所得發(fā)酵結(jié)果見圖3,4。第12頁/共23頁第13頁/共23頁分析：由于合成一分子的SAM,需要消耗一分子的蛋氨酸和一分子的ATP,加入前體蛋氨酸,可減少合成蛋氨酸所需的能量,利于SAM的高密度積累.在補(bǔ)加前體L-蛋氨酸后,SAM快速積累,在開始流加16h后,SAM積累量達(dá)到最高值,為4.66g/L,蛋氨酸轉(zhuǎn)化率為17.45%.在生物量達(dá)到80g/L后流加L-蛋氨酸,可使生物量繼續(xù)增加,最高達(dá)到147g/L,說明采用流加方式補(bǔ)加L-蛋氨酸,并沒有對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用。第14頁/共23頁補(bǔ)加前體D-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果圖5,6為在生物量達(dá)到80g/L時(shí),流加D-蛋氨酸前體的發(fā)酵結(jié)果,流加速率為2g/(L.h),共流加5h.圖5補(bǔ)加前體D-蛋氨酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和SAM合成的影響第15頁/共23頁第16頁/共23頁分析：釀酒酵母的SAM合成酶不能直接利用D-蛋氨酸.D-蛋氨酸被酵母細(xì)胞吸收后,在胞內(nèi)消旋酶的作用下,部分D-蛋氨酸可被轉(zhuǎn)化成L-蛋氨酸,為SAM合成提供前體.發(fā)酵結(jié)果表明,流加前體D-蛋氨酸,SAM的積累量最高為1.53g/L,僅為流加L-蛋氨酸前體時(shí)SAM積累量的1/3,蛋氨酸轉(zhuǎn)化率為5.73%.而生物量最高達(dá)到124g/L,表明通過流加方式補(bǔ)加D-蛋氨酸對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用并不明顯。第17頁/共23頁補(bǔ)加前體DL-蛋氨酸的發(fā)酵結(jié)果圖7,8為在生物量達(dá)到80g/L時(shí)流加DL-蛋氨酸前體的發(fā)酵結(jié)果,補(bǔ)加速率為4g/(L.h),共流加5h.第18頁/共23頁第19頁/共23頁分析：在補(bǔ)加2倍量的DL-蛋氨酸前體條件下,釀酒酵母先利用L-蛋氨酸前體合成SAM,同時(shí)D-蛋氨酸在酵母細(xì)胞內(nèi)消旋酶的作用下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蛋氨酸,有效補(bǔ)充了合成SAM的前體,從而更利SAM的積累,SAM的積累量最高為5.28g/L,蛋氨酸的轉(zhuǎn)化率為9.88%.在該前體流加策略下,生物量最高達(dá)131g/L,表明流加2倍量的DL-蛋氨酸對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)無影響.第20頁/共23頁結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)分別以L-蛋氨酸、D-蛋氨酸和DL-蛋氨酸作為發(fā)酵前體,考察了補(bǔ)加不同類型的蛋氨酸前體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和SAM積累的影響.當(dāng)發(fā)酵過程中以2g/(L.h)的速率流加D-蛋氨酸前體時(shí),SAM的積累量為1.53g/L,生物量達(dá)124g/L;以相同速率流加前體L-蛋氨酸時(shí),SAM的積累量達(dá)4.68g/L,生物量為146g/L。相比較而言,采用4g/(L.h)的速率流加DL-蛋氨酸前體時(shí),SAM的積累量最高,可達(dá)5.28g/L,生物量為128g/L,發(fā)酵結(jié)果比較理想.此外,目前市場(chǎng)上D