發酵工程實驗第1頁/共69頁實驗一、斜面培養基的選擇一、實驗目的學習菌種斜面培養基選擇的方法和原理。二、實驗原理良好的斜面培養基能使孢子迅速萌發和生長，菌絲生長快、產生孢子多、孢子產生時間短，從而獲得優質的種子液，并縮短發酵的周期。根據菌株在斜面培養基上菌絲生長和孢子產生速度、數量和質量等情況，來選擇適當的斜面培養基。第2頁/共69頁三、實驗材料菌株：一株鏈霉菌。培養基成分：葡萄糖、L-天門冬酰胺、K2HPO4、微量鹽、瓊脂、酵母膏、燕麥片、復合維生素、麥芽膏、馬鈴薯。其他儀器設備和材料：試管、移量管、滅菌鍋、接種環、無菌培養皿、恒溫培養箱、超凈工作臺、酒精燈、無菌水等。第3頁/共69頁四、實驗步驟1．培養基配制和滅菌：1#：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，瓊脂15~20g，水1000ml，pH7.4~7.6。2#培養基：酵母膏4g，葡萄糖4g，麥芽膏5g，復合維生素3.5mg，微量鹽1ml，瓊脂20g，定容至1L，pH7.2；第4頁/共69頁3#培養基：燕麥片20g（煮沸30分鐘，8層紗布過濾），微量鹽1ml，瓊脂20g，定容至1L，pH7.2；4#：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂15~20g，水1000ml，pH7.4~7.6。采用濕熱滅菌，滅菌溫度為121℃，時間30min。第5頁/共69頁2．培養基滅菌及試管斜面制作。3．斜面接種：用接種環取配制好的鏈霉菌孢子懸液一環，在長度一樣的斜面上分別涂布接種，28°C恒溫箱內培養。4．菌絲形態和孢子產生觀察：每24h觀察菌絲生長和孢子產生情況，第3d開始每天取一支斜面加入5ml無菌水，振蕩均勻，用移量管從試管中取0.1ml涂布在平板上，28°C下培養，3d后觀察并記錄菌落數。第6頁/共69頁五、注意事項1．試管采用同一規格，培養基裝量一致，斜面長度一致，以免影響結果。2．斜面接種量用同一接種環，以確保接種量一致。3．整個過程在無菌操作下完成。六、實驗結果及分析對實驗所觀察到的現象、實驗結果進行分析，選擇該菌株的斜面培養基。七、思考題斜面培養基必須滿足什么條件？不同菌株的斜面培養基是否相同？為什么？如何設計斜面培養基？第7頁/共69頁實驗一具體安排1、斜面接種后第三天（星期六）每組每天分配2人進行取樣，檢測斜面生長情況和孢子的產生情況。（大家最好把時間安排好，共用移液管）0.1ml孢子懸液涂布培養計數第8頁/共69頁2、記錄連續三天計數結果，確定生長好、產生孢子數量多的斜面培養基第9頁/共69頁實驗報告的寫法題目：一株鏈霉菌斜面培養基的選擇1材料與方法1.1材料1.2方法2結果與分析3討論第10頁/共69頁實驗二、種子培養基的選擇一、實驗目的學習發酵生產種子培養基選擇的方法和原理。二、實驗原理種子培養基主要是為菌絲的生長繁殖提供營養，所以應保證其營養成分易被菌體吸收利用，通常是以菌體生長速度和菌體濃度來選擇種子培養基。第11頁/共69頁在一定時間內，菌絲體生長快則生長量大，生長量大菌體密度就大。在一定范圍內，菌體密度越大，其吸光度就越大，根據吸光度的大小可以初步檢測其菌體密度，進一步確定種子液的生長情況。一定體積的種子液其菌體濕重或干重大，則其生長量大，根據菌絲體濕重或干重的大小就可以確定種子液的生長情況，從而確定適當的種子培養基。第12頁/共69頁三、實驗材料菌種：實驗一保存的生長良好的斜面。培養基成分：酵母膏，葡萄糖，麥芽膏，復合維生素，微量鹽，淀粉，牛肉膏，蛋白胨，CaCO3等。其他儀器設備和材料：分光光度計，移量管，滅菌鍋，接種環，無菌培養皿，恒溫培養箱，超凈工作臺，酒精燈，三角瓶，紗布，無菌水等。第13頁/共69頁四、實驗步驟1．培養基配制及滅菌：1#培養基：酵母膏4g，葡萄糖4g，麥芽膏10g，復合維生素3.5mg，微量鹽1ml，定容至1L，pH7.2。2#培養基：淀粉24g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏5g，蛋白胨3g，CaCO34g，定容至1L，pH7.0。500ml三角瓶裝液體種子培養基100ml，8層紗布封口。采用濕熱滅菌，滅菌溫度為121℃，時間30min。第14頁/共69頁2．孢子懸液的制備：取2支生長良好的斜面菌種，各注入5ml無菌水，充分振蕩，將孢子從斜面上洗脫，倒入無菌三角瓶備用。3．接種及培養：用移量管取4ml孢子懸液，接入待選擇的種子培養基中，置于28℃、180rpm的搖床上進行培養。第15頁/共69頁4．菌絲體生長狀況觀察：1d后每12h取樣檢測。每次取樣10ml，先進行吸光度的檢測（分光光度計用未接種的種子培養基進行調零），再全部倒入預先干燥稱重的濾紙內進行過濾，用無菌水洗滌菌體3次，除去水溶性雜質，稱重，記錄菌絲體濕重，用放入60℃電熱鼓風干燥箱中進行干燥至恒重，稱重，記錄菌絲體干重。第16頁/共69頁五、注意事項1．孢子懸液制備和種子液的取樣都要進行嚴格的無菌操作，防止雜菌污染。2．注意要充分洗去水溶性的雜質，以免影響實驗結果。3．干燥時間要適宜。六、實驗結果及分析對實驗所觀察到的現象、實驗結果進行分析，選擇該菌株的種子培養基。第17頁/共69頁七、思考題1．為什么濕重法和干重法要充分洗去水溶性成份？2．菌絲體干燥時間為什么不能太短、也不能太長？3．如何選擇種子培養基？第18頁/共69頁取樣離心讀取菌體體積過濾洗滌稱濕重烘干稱干重第19頁/共69頁第20頁/共69頁第21頁/共69頁實驗三、發酵培養基的選擇一、實驗目的初步了解不同發酵培養基對發酵終產物和目的產物的影響，理解發酵培養基成分對目的產物及其發酵產物提純的重要性。二、實驗原理在不同的發酵培養基條件下，微生物進行初級代謝的途徑基本一致，初級代謝產物也大體相同，但是其次級代謝途徑則可能有很大不同，因此產生的次級代謝產物成分可能也大不相同，在一定溶劑系統下展開，不同次級代謝產物在TLC上的Rf值不一樣，利用TLC檢測，可以初步確定其不同發酵培養基產生的不同次級代謝產物。第22頁/共69頁三、實驗材料菌種：搖瓶培養48h一株鏈霉菌的種子液。培養基成分：甘露醇，大豆粉，葡萄糖，酵母膏，淀粉，蛋白胨，NaCl，K2HP4，MgSO47H2O，CaCO3。其他材料、設備儀器：滅菌鍋，恒溫振蕩培養箱，超凈工作臺，酒精燈，三角瓶，茴香醛顯色劑等。第23頁/共69頁四、實驗步驟1．培養基配制與滅菌1#：甘露醇20g，大豆粉20g，定容至1L，pH7.0；2#：大豆粉20g，葡萄糖20g，酵母膏2g，淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl4g，K2HP40.5g，MgSO47H2O0.5g，CaCO32g，定容至1L，pH7.8（定容測pH后，再將CaCO3在加入培養基內）；培養基配制完后，加入150ml的三角瓶中，每瓶狀液量為40ml，用濕熱滅菌，滅菌溫度為121℃，時間30min。第24頁/共69頁2．接種與培養：將生長良好的種子液按15%的接種量進行接種，接完種后置于28℃、180rpm的搖床上進行培養，培養時間為6d。3．發酵產物初步提?。喊l酵結束后，將發酵液進行超聲破壁30min，加入乙酸乙酯30ml，100rpm搖床振蕩20min，再用濾紙濾去菌絲體，濾液用分液漏斗將乙酸乙酯相分離出來，進行減壓濃縮至4~5ml液體。第25頁/共69頁4．TLC（薄層層析）檢測：在同一塊薄層層析硅膠板上將濃縮液在進行點樣，再利用適當的展層溶劑進行展層。待溶劑前沿到達硅膠板另一端時取出硅膠板，溶劑完全干后將硅膠板置于紫外儀下檢測，記錄檢測結果，取出硅膠板進行顯色反應，并記錄顯色結果。五、注意事項1．點樣時注意點不宜太大，其直徑不超過0.5cm，最好0.2~0.3cm。2．點樣量要足夠多，使展層后能夠檢測出更多的不同條帶。第26頁/共69頁六、實驗結果及分析記錄TLC檢測的結果（紫外檢測和顯色結果），說明對于一定目的產物來說，發酵培養基成分的重要性。七、思考題1．同一微生物菌株在不同培養基上所產生的次級代謝產物相同嗎？請簡要分析其原因。2．用TLC檢測微生物菌株不同代謝產物時，這些產物必須滿足什么條件？第27頁/共69頁第28頁/共69頁實驗四、目的產物發酵效價的TLC檢測一、實驗目的初步學習發酵過程中TLC檢測目的產物效價的方法；了解目的產物產量隨發酵時間而變化的的關系。第29頁/共69頁二、實驗原理微生物產生的抗生素一般都是次級代謝產物，微生物生長從對數生長期進入穩定期時才產生次級代謝產物。那些對一定波長的光具吸收的次級代謝產物，可以利用TLC展層后刮板的方法，將相應條帶刮下，用溶劑浸泡，再利用分光光度計進行檢測浸泡液的吸光度，根據吸光度的大小，即可初步確定目的產物的發酵效價。第30頁/共69頁三、實驗材料菌種：搖瓶培養48h一株鏈霉菌的種子液。培養基成分：大米，大豆粉，米糠。其他材料、設備儀器：乙酸乙酯等有機試劑、滅菌鍋，超凈工作臺，酒精燈，三角瓶，紫外分光光度計，層析缸等。第31頁/共69頁四、實驗步驟1．培養基的配制與滅菌：大米50g，大豆粉30g，米糠20g，H2O100mL，裝入500mL三角瓶；采用高壓蒸汽滅菌，溫度121℃，時間60min，滅完菌后趁熱將培養基振散。2．接種：將生長良好的種子液接入固體發酵培養基中，每瓶接種量為25ml。接完種后置于28℃恒溫培養箱內進行靜置培養。第32頁/共69頁3．取樣檢測：24h后進行取樣，取樣時間間隔為24h，每次取樣2g左右，取出的樣品先進行稱重，再按一定比例加入有機溶劑提取其中目的組分，減壓濃縮至少量溶劑，進行TLC檢測，刮取目的組分的條帶，按樣品重量比例加入相應體積的溶劑，取上清液進行紫外吸收檢測。4．根據吸光度，計算目的組分的發酵效價。第33頁/共69頁五、注意事項1．取樣時注意嚴格的無菌操作，以免雜菌污染。2．刮取目的組分條帶時，不要將無關組分刮下，也不能將目的組分漏刮，否則結果誤差較大；浸泡目的組分的TLC條帶時所用溶劑的量要根據所取的樣品重量。六、實驗結果及分析記錄實驗結果，分析原因及其說明的問題。第34頁/共69頁七、思考題為什么微生物次級代謝產物產量會隨著時間而發生變化？有時當目的產物發酵效價達到最大值以后，如果繼續發酵目的組分產率非但不增加，反而越來越少，甚至完全消失，試解釋其原因。第35頁/共69頁第36頁/共69頁實驗五、變溫發酵對目的產物產量的影響一、實驗目的初步了解不同溫度對菌體生長和抗生素發酵效價的影響，理解變溫發酵對提高目的產物的意義。第37頁/共69頁二、實驗原理微生物在發酵過程中，首先要進行菌絲體的生長，對于分批發酵或實驗室三角瓶發酵來說，隨著營養物質的消耗、其他有害因素的積累，其生長由對數期進入穩定期，菌絲體生長量達到最大，此時微生物便通過次級代謝途徑，迅速將初級代謝產物轉變為次級代謝產物。對于許多微生物產生的抗生素來說，此時發酵溫度適度降低，將大大提高目的產物的產量。第38頁/共69頁三、實驗材料菌種：搖瓶培養48h一株鏈霉菌的種子液。培養基成分：大米，大豆粉，米糠。其他材料、設備儀器：乙酸乙酯等有機試劑、滅菌鍋，超凈工作臺，酒精燈，三角瓶，紫外分光光度計，層析缸等。第39頁/共69頁四、實驗步驟1．培養基的配制與滅菌：大米20g，大豆粉5g，米糠7g，H2O30mL，裝入150mL三角瓶；采用高壓蒸汽滅菌，溫度121℃，時間60min，滅完菌后趁熱將培養基振散。2．接種：將生長良好的種子液接入固體發酵培養基中，每瓶接種量為10ml。3．變溫培養：接完種后置于28℃恒溫培養箱內進行靜置培養，當菌絲體長滿固體培養基時，將溫度下調3℃繼續培養，對照組仍然采用28℃。在菌絲體出現溶菌時終止發酵。第40頁/共69頁4．目的組分提取：將發酵物加入乙酸乙酯50ml超聲破壁30min，再置于100rpm搖床上振蕩30min，用濾紙過濾，濾液用分液漏斗將乙酸乙酯相取出，進行減壓濃縮，濃縮液加乙酸乙酯進行定容。5．發酵效價檢測：取0.2ml樣品溶液，進行劃線點樣，待樣品干后進行展層，將目的組分條帶刮下，用一定體積溶劑浸泡，取上清液進行吸光度檢測。6．根據吸光度，計算兩個樣品中的目的組分的發酵效價。第41頁/共69頁五、注意事項變溫時間要選擇好，在菌絲體生長量未達到最大之前變溫可能會影響菌絲體的生長速度。選擇的制備型硅膠板制板條要一致，以免影響結果。如濃度太高，則先要進行稀釋，再檢測吸光度。六、實驗結果及分析記錄實驗結果，分析原因及其說明的問題。七、思考題為什么抗生素工業發酵采用變溫發酵？對于某些抗生素而言，變溫發酵為什么產量會有所提高？第42頁/共69頁第43頁/共69頁實驗六、葡萄糖濃度對目的產物發酵效價的影響一、實驗目的初步了解不同濃度的葡萄糖對抗生素發酵效價的影響，進一步理解優先利用的速效碳源分解代謝產物的抑制作用。第44頁/共69頁二、實驗原理在有易于利用的碳源存在的條件下，細胞不會生產異化難利用碳源的酶。這種控制機制使細胞以更為經濟的方式去合成蛋白質，從而加強它在自然界生存競爭的優勢。許多抗生素的合成過程受葡萄糖的抑制。葡萄糖引起的抑制作用并不是葡萄糖本身的直接作用，而是葡萄糖作為一種易被利用碳源，促進了抗生素產生菌生長的結果，而抗生素的產率與菌體生長速率大致成反比，因此葡萄糖等速效碳源過多的情況下，微生物產生的抗生素產量往往降低。第45頁/共69頁三、實驗材料菌種：搖瓶培養48h一株鏈霉菌的種子液。培養基成分：大豆粉，葡萄糖，酵母膏，淀粉，蛋白胨，NaCl，K2HP4，MgSO47H2O，CaCO3。其他材料、設備儀器：滅菌鍋，恒溫振蕩培養箱，超凈工作臺，酒精燈，三角瓶等。第46頁/共69頁四、實驗步驟1．培養基配制與滅菌1#：大豆粉20g，葡萄糖20g，酵母膏2g，淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl4g，K2HP40.5g，MgSO47H2O0.5g，CaCO32g，定容至1L，pH7.8（定容測pH后，再將CaCO3在加入培養基內）；2#：大豆粉20g，葡萄糖40g，酵母膏2g，淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl4g，K2HP40.5g，MgSO47H2O0.5g，CaCO32g，定容至1L，pH7.8。培養基配制完后，加入150ml的三角瓶中，每瓶狀液量為40ml，用濕熱滅菌，滅菌溫度為121℃，時間30min。第47頁/共69頁2．接種與培養：將生長良好的種子液按15%的接種量進行接種，接完種后置于28℃、180rpm的搖床上進行培養，培養時間為5d，另外剩下一瓶2#培養基發酵7d。3．發酵產物初步提取：發酵結束后，將發酵液進行超聲破壁30min，加入乙酸乙酯30ml，100rpm搖床振蕩20min，再用濾紙濾去菌絲體，濾液用分液漏斗將乙酸乙酯相分離出來，進行減壓濃縮至4~5ml液體。第48頁/共69頁4．TLC（薄層層析）檢測：三個樣品各取0.2ml，在制備型薄層層析硅膠板上進行劃線點樣，再利用適當的展層溶劑進行展層。展完層后待硅膠板上的溶劑完全揮發干再進行紫外檢測，將目的條帶刮下，以同樣體積的溶劑浸泡樣品，取浸泡液上清部分進行吸光度檢測，如果濃度太高，則稀釋后再檢測。5．記錄檢測到的吸光度，計算目的組分的發酵效價。第49頁/共69頁五、注意事項選擇的制備型硅膠板制板條要一致，以免影響結果。如濃度太高，則先要進行稀釋，再檢測吸光度。六、實驗結果及分析記錄實驗結果，分析其原因及其說明的問題。七、思考題為什么工業發酵抗生素要限制速效碳源、氮源的使用？如何才能做到既要保證適量菌絲體的生長，又要不影響抗生素的產量？抗生素等目的發酵產物的產量與菌絲體生長之間有何關系？第50頁/共69頁實驗七、磷酸鹽濃度對發酵目的產物的影響一、實驗目的初步檢測不同磷酸鹽濃度對一株放線菌搖瓶發酵活性成分產量的影響，尋找一定發酵條件下，最佳磷酸鹽濃度。第51頁/共69頁二、實驗原理磷酸鹽是很重要的抗生素產生菌菌絲體生長限制養分，促進初級代謝作用，在很多初級代謝過程中作為一種反應因子，除控制抗生素產生菌的DNA、RNA和蛋白質的合成外，也控制碳水化合物的代謝作用，細胞的呼吸作用和細胞內的ATP水平。無機磷抑制次級代謝作用，限制次級代謝產物合成作用的誘導物的合成，過量的磷還抑制次級代謝產物前體的形成，在許多抗生素的生物合成中，只要發酵液中的磷酸鹽未耗盡，菌絲體生長就繼續進行，而不合成抗生素，一旦磷酸鹽耗竭，抗生素合成便開始。第52頁/共69頁三、實驗材料菌種：搖瓶培養48h一株鏈霉菌的種子液。培養基成分：大豆粉，葡萄糖，酵母膏，淀粉，蛋白胨，NaCl，K2HP4，MgSO47H2O，CaCO3。其他材料、設備儀器：滅菌鍋，恒溫振蕩培養箱，超凈工作臺，酒精燈，三角瓶等。第53頁/共69頁四、實驗步驟1．培養基配制與滅菌培養基配方：大豆粉20g，葡萄糖20g，酵母膏2g，淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl4g，K2HP4（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）g，MgSO47H2O0.5g，CaCO32g，定容至1L，pH7.8（定容測pH后，再將CaCO3在加入培養基內）；培養基配制完后，加入150ml的三角瓶中，每瓶狀液量為40ml，用濕熱滅菌，滅菌溫度為121℃，時間30min。第54頁/共69頁2．接種與培養：將生長良好的種子液按15%的接種量進行接種，接完種后置于28℃、180rpm的搖床上進行培養，培養時間為5d。3．發酵產物初步提?。喊l酵結束后，將發酵液進行超聲破壁30min，加入乙酸乙酯30ml，100rpm搖床振蕩20min，再用濾紙濾去菌絲體，濾液用分液漏斗將乙酸乙酯相分離出來，進行減壓濃縮至4~5ml液體。第55頁/共69頁4．TLC（薄層層析）檢測：將各樣品濃縮液各取0.2ml，在制備型薄層層析硅膠板上進行劃線點樣，再利用適當的展層溶劑進行展層。展完層后待硅膠板上的溶劑完全揮發干再進行紫外檢測，將目的條帶刮下，以同樣體積的溶劑浸泡樣品，取浸泡液上清部分進行吸光度檢測，如果濃度太高，則稀釋后再檢測。5．記錄檢測到的吸光度，計算目的組分的發酵效價。第56頁/共69頁五、注意事項選擇的制備型硅膠板制板條要一致，以免影響結果。如濃度太高，則先要進行稀釋，再檢測吸光度。六、實驗結果及分析記錄實驗結果，分析其原因及其說明的問題。七、思考題無機磷酸鹽對發酵產物有何影響？發酵過程如何控制其適當濃度？第57頁/共69頁第58頁/共69頁實驗八、正交實驗一、實驗目的掌握正交實驗的原理，學習用正交實驗來優化發酵培養基組分及各組分配比的方法。對發酵培養基中的大米、大豆粉、葡萄糖、蛋白胨等四種成分進行配比優化，確定菌株發酵培養基中它們的最佳配比。第59頁/共69頁二、實驗原理正交設計是一種研究多因素試驗的設計方法。在多因素試驗中，隨著試驗因素和水平數的增加，處理組合數將急劇增加。n個因素M個水平的試驗有Mn個處理組合，要全面實施這么龐大的試驗是相當因難的。因而，D．J．Finney倡儀了部分試驗法。而后日本學者倡導利用正交款式設計部分試驗，稱為正交試驗。第60頁/共69頁正交試驗是利用一套規格化的表格——正交表(orthogonaltable)來科學合理地安排試驗。這種設計的特點是在試驗的全部處理組合中，僅挑選部分有代表性的水平組合(處理組合)進行試驗。通過部分實施了解全面試驗情況，從中找出較優的處理組合。這樣可以大大節省人、財、物和時間，使一些難以實施的多因素試驗得以實施。例如，要進行一個4因素3水平的多因素試驗，如果全面實施